一种苦龙胆酯苷磷脂复合物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种苦龙胆酯苷磷脂复合物及其制备方法。所涉及的苦龙胆酯苷磷脂复合物中苦龙胆酯苷和磷脂按质量配比为1‑5:1。所涉及的制备方法是将配方量的组分在有机溶剂中溶解混合，在适宜温度下制备所得。本发明的苦龙胆酯苷磷脂复合物改善了苦龙胆酯苷的溶解性，其在水中的溶解度比苦龙胆酯苷增加了1‑2倍，而在正辛醇中的溶解度增加了7倍；HPLC、DSC、SEM、UV、NMR均表明已形成了复合物，而不是单纯的物理混合物或新生成的化合物；其相对生物利用度提高了159％；与苦龙胆酯苷单体比较，苦龙胆酯苷磷脂复合物显著提高了抗肝纤维化的作用。

权利要求

1.苦龙胆酯苷磷脂复合物用于制备抗肝纤维化药物的应用，所述苦龙胆酯苷磷脂复合物中苦龙胆酯苷和磷脂的质量配比为1-5:1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苦龙胆酯苷与磷脂的质量配比为2-4:1。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述磷脂是平均分子量为700-800，所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或合成磷脂，所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上的组合。

4.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苦龙胆酯苷磷脂复合物的制备方法包括：（1）取配方量的苦龙胆酯苷与磷脂溶于有机溶剂中，所述有机溶剂的用量应使苦龙胆酯苷的反应浓度为2.5mg/mL-20.0mg/mL，所述溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇和甲醇中的一种或两种以上的组合；

（2）于20℃-60℃条件下搅拌0.5h-3.0h；

（3）于30℃-60℃条件下将溶液减压浓缩至干；

（4）再加入氯仿充分溶解后抽滤；

（5）20℃-50℃条件下，将滤液减压浓缩至干即得苦龙胆酯苷磷脂复合物。

说明书

一种苦龙胆酯苷磷脂复合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物及其制备技术领域，涉及一种苦龙胆酯苷磷脂复合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 苦龙胆酯苷(Amarogentin)是一种裂环烯醚萜苷类化合物，其分子式为C29H30O13，分子量为586.54，化学名为1H,3H-Pyrano[3,4-c]pyran-1-one,5-ethenyl-4,4a,5,6-tetrahy-dro-6-[[2-0-[(3,3′,5-trihydroxy[1,1′-biphenyl]-2-yl)carbonyl]-β-D-glu-copyr anosyl]oxy]-,[4aS-(4aα,5β,6α)]-。苦龙胆酯苷多存在于獐牙菜属植物中，目前已证明可从川东獐牙菜、川西獐牙菜、印度獐牙菜以及龙胆中提取[谭桂山，徐平声，田华咏，等.川东獐牙菜化学成分的研究.中国药学杂志，2000，35(7)：441-443/孙洪发，胡伯林，丁经业，等.川西獐牙菜苷类成分.植物学报，1991，33(1)：31-37/Satyendra Suryawanshi,Nitin Mehrotra and R.K.Asthana.Liquid  chromatography/tandem  mass spectrometric study and analysis of xanthone and secoiridoid glycoside composition of Swertia chirata,a potent antidiabetic.Mass Spectrom,2006,20:
3761–3768/张建生，田子新，楼之岑，九种龙胆中五种裂环烯醚帖苷类苦味成分的高效液相色谱定量分析，1991,26(11)：864-870]。

[0003] 苦龙胆酯苷具有多种生理功能和重要的药用价值。研究表明，具有①抗肿瘤作用：对二甲基苯并蒽(dimethylvenzanthracene)诱导的小鼠皮肤癌模型，苦龙胆酯苷可通过下调Cox-Ⅱ的表达和激活细胞凋亡蛋白酶Procaspase-3，诱导凋亡进而抑制肿瘤增殖[Prosenjit  Saha,Suvra Mandal,Ashes  Das,et  al.Evaluation  of  the 
Anticarcinogenic Activity of Swertia chirata Buch.Ham,an Indian Medicinal Plant,on DMBA-induced Mouse Skin Carcinogenesis Model.Phytotherapy Research,
2004,18:373-378]。②保肝作用：对CCl4诱导发生肝癌的小鼠模型，苦龙胆酯苷能够通过调节G1/S细胞周期的控制点和诱导细胞凋亡来预防肝脏癌变，以及抑制肝脏脂质过氧化作用[Debolina Pal,Subhayan Sur,et al.Prevention of liver carcinogenesis by amarogentin through modulation of G1/S cell cycle check point and induction of apoptosis.Carcinogenesis,2012,33:2424-2431]。③抗黑热病作用：对注射利什曼原虫的仓鼠模型，苦龙胆酯苷可抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ，从而抑制寄生虫的增殖，表现出抗黑热病的功效[Swapna Medda,Sibabrata Mukhopadhyay,Mukul Kumar Basu.Evaluation of the in-vivo activity and toxicity of amarogentin,an antileishmanial agent,in both liposomal and niosomal forms.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1999,
44:791-794]。④治疗糖尿病：对链脲霉素引起的糖尿病小鼠模型，可通过抑制葡萄糖苷酶和淀粉酶活性，表现出抗糖尿病的功效[G.Mahendran,G.Thamotharan,S.Sengottuvelu,et al.Anti-diabetic activity of Swertia corymbosa(Griseb.)Wight ex C.B.Clarke aerial parts extract in streptozotocin induced diabetic rats.Journal of Ethnopharmacology,2014,151:1175-1183.]。

[0004] 综上表明，苦龙胆酯苷即具生物活性的物质，又是一种极具开发潜质的物质。但是，在应用过程中发现，苦龙胆酯苷水溶性和脂溶性较差，这使得苦龙胆酯苷的生物利用度不高，严重限制苦龙胆酯苷的吸收和发挥药效作用。如果能够提高苦龙胆酯苷的水溶性/脂溶性就可以改善苦龙胆酯苷的生物利用度，为苦龙胆酯苷在医药领域发挥更广阔的应用空间。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种苦龙胆酯苷磷脂复合物及其制备方法，从而解决苦龙胆酯苷亲水性和亲脂性均较差的技术问题，提高苦龙胆酯苷的生物利用度从而提高药效。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种苦龙胆酯苷磷脂复合物，它是由苦龙胆酯苷和磷脂按重量配比1-5:1组成的苦龙胆酯苷磷脂复合物。

[0007] 进一步地，所属苦龙胆酯苷与磷脂的重量配比优选为2-4:1。

[0008] 进一步地，所属磷脂是平均分子量为700-800的磷脂，可以选用大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂或合成磷脂，优选平均分子量为750的大豆卵磷脂。所述合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，也可以是以上任意组合。

[0009] 本发明的苦龙胆酯苷磷脂复合物的制备方法，包括下述顺序的步骤：(1)取重量比为1:1-5的苦龙胆酯苷与磷脂，于介电常数较小的有机溶剂中，所述有机溶剂的用量应使苦龙胆酯苷的反应浓度为2.5mg/mL-20.0mg/mL；(2)于20℃-60℃磁力搅拌0.5h-3.0h；(3)将溶液减压浓缩至干，所述减压浓缩温度为30℃-60℃；(4)再加入适量复溶溶剂充分溶解后抽滤；(5)将滤液减压浓缩至干即得苦龙胆酯苷磷脂复合物，所述减压浓缩温度为20℃-50℃。

[0010] 制备方法中，所述溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、甲醇或上述溶剂的各种比例的混合溶剂。

[0011] 本发明的有益效果是苦龙胆酯苷磷脂复合物改善了苦龙胆酯苷的溶解性，其在水中的溶解度比苦龙胆酯苷增加了1-2倍，而在正辛醇中的溶解度增加了7倍；HPLC、DSC、SEM、UV、NMR均表明已形成了复合物，而不是单纯的物理混合物或新生成的化合物；其相对生物利用度提高了159％；与苦龙胆酯苷单体比较，苦龙胆酯苷磷脂复合物显著提高了抗肝纤维化的作用。

[0012] 苦龙胆酯苷磷脂复合物有效的解决苦龙胆酯苷在人体及动物体内生物利用度不高的问题。苦龙胆酯苷磷脂复合物可作为原料药，制备成医药领域许可的各种制剂，所述的制剂可以是片剂、胶囊剂、纳米粒、亚微乳、脂质体和注射剂等。

附图说明

[0013] 图1苦龙胆酯苷磷脂复合物与混合物的HPLC分析结果比较(A.苦龙胆酯苷；B.磷脂；C.苦龙胆酯苷磷脂复合物；D.物理混合物；采用的流动相条件为甲醇-水＝50:50)；

[0014] 图2苦龙胆酯苷磷脂复合物与混合物的DSC分析结果比较(A.苦龙胆酯苷；B.磷脂；C.苦龙胆酯苷磷脂复合物；D.物理混合物)；

[0015] 图3苦龙胆酯苷磷脂复合物与混合物的SEM分析结果比较[A.苦龙胆酯苷(×100)；B.磷脂(×30)；C.苦龙胆酯苷磷脂复合物(×200)；D.物理混合物(×200)]；

[0016] 图4苦龙胆酯苷磷脂复合物与混合物的UV分析结果比较(A.苦龙胆酯苷；B.磷脂；C.苦龙胆酯苷磷脂复合物；D.物理混合物)；

[0017] 图5苦龙胆酯苷磷脂复合物与混合物的NMR分析结果比较(A.磷脂；B.苦龙胆酯苷磷脂复合物)；

[0018] 图6各组动物肝组织切片HE染色结果比较×200(A.正常组；B.模型组；C.苦龙胆酯苷组；D.苦龙胆酯苷磷脂复合物组)；

[0019] 图7各组动物肝组织切片天狼星红染色结果比较×100(A.正常组；B.模型组；C.苦龙胆酯苷组；D.苦龙胆酯苷磷脂复合物组；E肝组织天狼星红染色的阳性面积)。

具体实施方式

[0020] 下面列举典型实施例，对本发明进一步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。

[0021] 实施例1：

[0022] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml无水乙醇中，50℃水浴中搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0023] 采用流动相条件为甲醇-水＝50:50对苦龙胆酯苷、磷脂、苦龙胆酯苷磷脂复合物和物理混合物进行HPLC分析，其结果如附图1所示。图1结果表明苦龙胆酯苷及其磷脂复合物在此条件下的色谱行为一致，保留时间为9.15min和9.16min，这说明苦龙胆酯苷与磷脂形成的是一种复合物，而不是新的化合物。

[0024] 分别取苦龙胆酯苷、磷脂、苦龙胆酯苷磷脂复合物和物理混合物适量，以空坩埚为参比，扫描速率为10℃/min，扫描范围50℃-350℃，测试环境为N2气氛，吹扫气80ml/min，保护气为20ml/min。进行DSC扫描，其结果如附图2所示。由图2可知，苦龙胆酯苷的峰值为229.3℃，是吸热反应。苦龙胆酯苷磷脂复合物的峰值为277.9℃，是放热反应。物理混合物的峰值为275.2℃，是放热反应。形成复合物后相变温度提高，证明苦龙胆酯苷的晶型发生了变化，可能是由于苦龙胆酯苷的极性基团与大豆卵磷脂的极性基团部分发生分子间相互作用，大豆卵磷脂的长脂肪酸链对苦龙胆酯苷进行包裹，使苦龙胆酯苷高度分散于大豆卵磷脂中，进而改变了苦龙胆酯苷的相变温度，使其特征峰发生明显改变。

[0025] 分别取少量苦龙胆酯苷、磷脂、苦龙胆酯苷磷脂复合物和物理混合物粉末固定在样品托后喷金，用扫描电子显微镜(SEM)镜下观察，其结果如附图3所示。从图像可以看出，大豆卵磷脂呈平滑的球状；苦龙胆酯苷为晶体；混合物形态既有晶体，也有球状物；苦龙胆酯苷磷脂复合物的晶体特征消失。

[0026] 取苦龙胆酯苷、磷脂、苦龙胆酯苷磷脂复合物和物理混合物用甲醇分别配成苦龙胆酯苷浓度为60μg/mL的溶液，在200nm-400nm范围内扫描，结果见附图4所示。由图4可见，上述4个样品的UV图谱均未出现新的UV吸收峰，证明没有形成新的化合物。

[0027] 取磷脂和苦龙胆酯苷磷脂复合物分别溶于氘代氯仿中，进行磷核磁共振(400M)分析，结果见附图5。由图5可见，苦龙胆酯苷磷脂复合物和磷脂波谱峰的位置和峰形几乎不变，说明磷脂分子中的磷原子未形成新的化学键。

[0028] 实施例2：磷脂复合物溶解性考察

[0029] 取实施例1制备的磷脂复合物，考察在水及正辛醇中的溶解性，并将结果与苦龙胆酯苷比较。取5mL蒸馏水和正辛醇置50mL三角瓶中，加入过量的苦龙胆酯苷、物理混合物及苦龙胆酯苷磷脂复合物，加塞子后室温下振摇24小时(80转/分)，然后置离心管中离心15min(4000转/分)，取上清液过微孔滤膜，再精密吸取1mL滤液置10mL容量瓶中，甲醇定容，HPLC检测，结果见表1。

[0030] 表1溶解性试验结果

[0031]

[0032]

[0033] 由表1可知，苦龙胆酯苷磷脂复合物在水中的溶解度略有提高，是苦龙胆酯苷的1.3倍；在正辛醇中的溶解度显著增加，是苦龙胆酯苷的8.7倍。由结果可知，制成复合物后，既改善了苦龙胆酯苷的亲水性，又改善了其亲脂性，且亲脂性的改善程度更大。

[0034] 实施例3：

[0035] 称取苦龙胆酯苷300mg，大豆卵磷脂100mg，溶于60ml无水乙醇中，50℃水浴中磁力搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0036] 实施例4：

[0037] 称取苦龙胆酯苷400mg，大豆卵磷脂100mg，溶于80ml无水乙醇中，50℃水浴中磁力搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0038] 实施例5：

[0039] 称取苦龙胆酯苷100mg，大豆卵磷脂100mg，溶于20ml无水乙醇中，50℃水浴中磁力搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0040] 实施例6：

[0041] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml无水乙醇中，50℃水浴中磁力搅拌0.5h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0042] 实施例7：

[0043] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml无水乙醇中，50℃水浴中磁力搅拌2h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0044] 实施例8：

[0045] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml无水乙醇中，40℃水浴中磁力搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0046] 实施例9：

[0047] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml无水乙醇中，60℃水浴中磁力搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0048] 实施例10：

[0049] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml无水乙醇中，25℃水浴中磁力搅拌1h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0050] 实施例11：

[0051] 称取苦龙胆酯苷200mg，大豆卵磷脂100mg，溶于40ml乙酸乙酯中，50℃水浴中磁力搅拌2h，减压除去反应溶剂，再加入适量氯仿，充分溶解其中的磷脂及磷脂复合物，滤过，再用少量氯仿洗涤，收集滤液，减压除去氯仿，得到磷脂复合物。

[0052] 通过本制备方法所产生的苦龙胆酯苷磷脂复合物，可以通过常规方法来生产各种药用制剂，下面通过一个实施例来具体说明：

[0053] 实施例12：

[0054] 取实施例1所产生的苦龙胆酯苷磷脂复合物25g，加淀粉20g，微晶纤维素10g，以40％乙醇制粒，压片，得片剂，共制成1000片。

[0055] 实施例13：苦龙胆酯苷磷脂复合物药代动力学及生物利用度研究

[0056] 实验动物：雄性SD大鼠10只，质量250±25g。给药方案：实验鼠随机分为两组，分别尾静脉注射苦龙胆酯苷和苦龙胆酯苷磷脂复合物，给药剂量均相当于15mg·kg-1。样品采集：给药后于2、5、10、30、45、60、75、90、120、180min时通过眼底静脉丛取血约0.4mL，置经肝素处理的抗凝管中，离心分离血浆，吸取血浆样品200μL，加入内标对照品溶液10μL(125μg·mL-1胡黄连苷I)，涡旋混匀后，再加入1.0mL乙睛，涡旋混匀3min，4000r·min-1离心10min得乙睛萃取液，40℃下氮气吹干，残渣加入200μL流动相涡旋振荡溶解，12000r·min-1离心15min，取上清液10μL进样。

[0057] 血浆样品分析色谱条件色谱柱：Angilent Zorbax SB-C18(250×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-水(50:50，v/v)；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1；检测波长：260nm；内标：胡黄连苷I；进样量：10μL。采用药代动力学软件DAS2.0进行药代动力学参数的分析。主要药代动力学参数见表2。

[0058] 表2大鼠静注12.5mg·kg-1AG主要药代动力学参数(n＝6,mean±SD)

[0059]

[0060] 相对生物利用度为159％。

[0061] 实施例14：苦龙胆酯苷及其磷脂复合物抗肝纤维化作用研究

[0062] 实验动物：雄性C57小鼠40只，体重18±2g。给药方案：采用四氯化碳诱导小鼠建立肝纤维化模型，设正常组、模型组、苦龙胆酯苷组、苦龙胆酯苷磷脂复合物组共4组，自造模开始，对各组动物进行治疗，给药剂量均相当于50mg/kg。样品采集：7周后，动物禁食不禁水12小时，称重，乙醚麻醉小鼠，用肝素化的毛细管眼眶取血，静置半小时后，于4℃，以3000r/min离心10min，收集血清，-80℃保存；小鼠断颈处死，采集肝脏组织，用生理盐水洗去残留血，滤纸吸干水分，称重。一块肝组织迅速用4％多聚甲醛溶液固定24小时，脱水，石蜡包埋，切片；其余组织切碎入Ep管，-80℃保存。检测以下指标：①每周称量小鼠体重，观察皮毛质量及活动情况，并做好记录。实验结束后，取新鲜肝脏称重，肝脏指数以肝脏质量(g)/小鼠体重(g)*100％表示。②采用半自动生化仪检测各组小鼠血清ALT、AST、Alb含量；③取肝脏相同部位用于石蜡切片，分别进行HE染色、天狼星红染色；采用Image J图像分析系统对天狼星红染色的结果进行分析。采用GraphPad Prism 5.0软件对实验获得数据进行统计学分析。数据以Mean±SD表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05计有显著性差异。

[0063] 结果：一般状况：给药结束时，正常组小鼠皮毛光滑，生长良好。模型组小鼠反应稍迟钝，活动减少，被毛杂乱无光泽。给药组：精神状况及毛色等情况明显好转，且磷脂复合物组的情况好于苦龙胆酯苷组。肝脏指数：与对照组比较，模型组小鼠肝脏指数显著增加(P<0.05)；与模型组比较，苦龙胆酯苷组和磷脂复合物组小鼠肝脏指数降低，且磷脂复合物组减低具有显著性(P苦龙胆酯苷治疗组汇管区仍可见胶原纤维生成，但胶原分布及纤维隔较模型组明显减少，少量炎性细胞浸润。苦龙胆酯苷磷脂复合物组未见明显纤维隔，胶原纤维显著减少，肝小叶结构基本完整，炎性细胞浸润显著减少。天狼星红染色结果见图7，正常组小鼠肝脏汇管区有极少量的胶原纤维沉积；模型组汇管区纤维结缔组织增生明显增多,呈红色，部分向小叶内伸展，形成小叶间分隔。苦龙胆酯苷治疗组汇管区纤维结缔组织少量增生。苦龙胆酯苷磷脂复合物组纤维增生显著减轻，汇管区有极少量胶原纤维增生，肝小叶结构完整。

[0064] 以上结果均说明，苦龙胆酯苷及苦龙胆酯苷磷脂复合物可显著抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化，表现为改善肝功能，降低肝指数，改善肝纤维化的病理形态，且苦龙胆酯苷磷脂复合物组的效果优于苦龙胆酯苷组。

[0065] 表3苦龙胆酯苷对肝纤维化小鼠肝脏指数和肝功能的影响

[0066]

[0067] *P<0.05与正常组相比,#P<0.05与模型组相比.

[0068] 本发明通过选择磷脂为载体制备了苦龙胆酯苷磷脂复合物，实验证明该复合物提高了苦龙胆酯苷的生物利用度，HPLC、DSC、SEM、UV、NMR分析均表明形成了复合物而不是单纯的物理混合物或新生成的化合物，通过磷脂复合物在大鼠体内的药代动力学特点进行分析发现，苦龙胆酯苷制成磷脂复合物后提高了其在体内的吸收；通过磷脂复合物抗肝纤维化的作用研究发现，苦龙胆酯苷制成磷脂复合物后提高了其抗肝纤维化的作用。这将有效解决苦龙胆酯苷在人体及动物体内生物利用度不高的问题，有利于这一天然活性产物作为药物应用于临床。