肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒及制备方法

摘要

本发明提供了提供一种肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒及制备方法，是由毛菊苣总倍半萜提取物、卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、pH 6.8‑7.4的磷酸盐缓冲液和磁性纳米混悬液组成，采用以毛菊苣总倍半萜提取物为模型药物，通过纳米脂质体技术包封于脂质体中，再外加磁性纳米液制备成具有肝靶向的新型药物载体磁性脂质体纳米粒。将药物与纳米级的磁性粒子结合，通过磁性导向系统控制，将药物靶向输送到病变部位，提高靶部位的有效血药浓度，从而增强治疗效果，减轻药物不良反应。该给药载体同时具有纳米粒功能，当其进入体内后，利用体外磁场效应引导脂质体纳米粒在体内定向移动和定位集中，使药物的靶向性和专一性增强，从而达到高效、速效、低毒的治疗效果。

权利要求

1.一种肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒的制备方法，其特征在于以10g为基数，由毛菊苣总倍半萜提取物40-160 mg、卵磷脂800-3500 mg、胆固醇160-640 mg、无水乙醇2-20 ml、pH 6.8-7.4的磷酸盐缓冲液1-10 ml和磁性纳米混悬液1-10 ml制成，具体操作按下列步骤进行：a、将卵磷脂800-3500 mg、胆固醇160-640 mg和毛菊苣总倍半萜提取物40-160 mg加入到无水乙醇2-20 ml中，超声使溶解均匀，其中卵磷脂为大豆卵磷脂和氢化大豆卵磷脂，或卵磷脂为蛋黄卵磷脂，或卵磷脂为磷脂酰胆碱；

b、将步骤a的溶液加入到恒温60℃的pH 6.8-7.4的磷酸盐缓冲液1-10 ml中，在温度

40-60℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400 W超声细胞粉碎仪探头超声150次，得到毛菊苣总倍半萜提取物普通脂质体；

c、将步骤b得到的普通脂质体通过具有细孔径的针头或管道注入到2%吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，注入速度为1-3mL/min，恒温振荡，待脂质体滴加完毕后水浴30 min，静置吸附20-40 min后进行分离，冷冻干燥得到粒径为30-150nm的磁性脂质体纳米粒。

说明书

肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物载体技术领域，具体涉及一种肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒及制备方法。

背景技术

[0002] 肝脏是人体最重要的解毒脏器，易发生各种代谢性、感染性疾病以及原发性和继发性肿瘤。肝损伤引发的肝脏疾病已成为常见病、多发病，更为严重的是其诱发的肝功能衰竭和肝性脑病等，发病率和死亡率高。

[0003] 脂质体(liposomes)作为普通的靶向制剂的纳米药物载体，依据药物结合的载体对机体病变部位亲和力的不同，将药物运送到特定的治疗部位，但这样制备的药物载体往往过大或特异性较差，限制了其作为中药有效部位载体的应用。

[0004] 本发明中的毛菊苣总倍半萜提取物是从新疆特色资源毛菊苣中提取纯化得到的一类天然倍半萜类活性成分，可不同程度的降低化学性肝损伤和免疫性肝损伤模型小鼠血清中AST、ALT和TBIL水平及肝脏系数。目前，毛菊苣总倍半萜提取物尚未有较好靶向效果的靶向制剂。

发明内容

[0005] 本发明目的在于，提供一种肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒及制备方法，是由毛菊苣总倍半萜提取物、卵磷脂、胆固醇、无水乙醇、pH6.8-7.4的磷酸盐缓冲液和磁性纳米混悬液组成，采用以毛菊苣总倍半萜提取物为模型药物，通过纳米脂质体技术包封于脂质体中，再外加磁性纳米液制备成具有肝靶向的新型药物载体磁性脂质体纳米粒。将药物与纳米级的磁性粒子结合，通过磁性导向系统控制(即借助外加磁场的作用)，将药物靶向输送到病变部位，提高靶部位的有效血药浓度，从而增强治疗效果，减轻药物不良反应。该给药载体同时具有纳米粒功能，当其进入体内后，利用体外磁场效应引导脂质体纳米粒在体内定向移动和定位集中，使药物的靶向性和专一性增强，从而达到高效、速效、低毒的治疗效果。要解决的技术问题是将毛菊苣总倍半萜提取物研制成一种新型肝靶向给药载体，以增强肝病变部位的选择性和靶向性，提高生物利用度。

[0006] 本发明所述的肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒及制备方法，以10g为基数，由毛菊苣总倍半萜提取物40-160mg、卵磷脂800-3500mg、胆固醇160-640mg、无水乙醇2-20ml、pH6.8-7.4的磷酸盐缓冲液1-10ml和磁性纳米混悬液1-10ml制成。

[0007] 所述的肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒，以10g为基数，由毛菊苣总倍半萜提取物60-100mg、卵磷脂1400-1800mg、胆固醇300-340mg、无水乙醇8-15ml、pH6.8-7.4的磷酸盐缓冲液2-4ml和磁性纳米混悬液2-4ml制成。

[0008] 卵磷脂为大豆卵磷脂和氢化大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或磷脂酰胆碱。

[0009] 一种肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒的制备方法，按下列步骤进行：

[0010] a、将卵磷脂800-3500mg、胆固醇160-640mg和毛菊苣总倍半萜提取物40-160mg加入到无水乙醇2-20ml中，超声使溶解均匀，其中卵磷脂为大豆卵磷脂和氢化大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂或磷脂酰胆碱；

[0011] b、将步骤a的溶液加入到恒温60℃的pH 6.8-7.4的磷酸盐缓冲液1-10ml中，在温度40-60℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，得到毛菊苣总倍半萜提取物普通脂质体；

[0012] c、将步骤b得到的普通脂质体通过具有细孔径的针头或管道注入到2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，注入速度为1-3mL/min，恒温振荡，待脂质体滴加完毕后水浴30min，静置吸附20-40min后进行分离，冷冻干燥得到粒径为30-150nm的磁性脂质体纳米粒。

[0013] 所述的磁性脂质体纳米粒，微粒粒径为30-150nm，平均包封率在90％以上(n＝3)。

[0014] 本发明所述的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒，其模型药物毛菊苣总倍半萜提取物的制备方法为：

[0015] 取毛菊苣药材干燥地上部分，净选，切制成2-3cm的小段，加15倍药材重量的40％乙醇，80℃回流提取二次，每次3小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至每mL相当于生药0.3g的浓缩液，加入已处理好的HPD100大孔吸附树脂柱上，吸附6小时，先用4倍柱体积的去离子水冲洗，再用5倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集含醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩并真空干燥成干浸膏，粉碎，过100目筛，即得。

[0016] 本发明所述的一种肝靶向的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒的制备方法，该方法中采用超声沉淀法制备Fe3O4磁性纳米混悬液，具体操作按下列步骤进行：

[0017] 室温下，称取0.5gPEG-6000溶解于去离子水，置于三颈瓶中，采取氮气保护下，并预先抽真空来减少空气中氧的影响，减小二价铁的氧化，将氯化亚铁与氯化铁溶液按Fe2+/Fe3+1:2(mol/mol)加入PEG-6000溶液，搅拌使混合均匀，搅拌下加入2mol/L氢氧化钠溶液调pH至11，然后加热至温度60℃，维持该温度搅拌30min；

[0018] 反应完毕后将三颈瓶置磁铁上加速Fe3O4磁性纳米粒沉淀，吸去上层液体，N2保护下，下层Fe3O4磁性纳米粒沉淀混悬液中加入10ml去离子水，100mA超声分散15min后在磁力搅拌下充分洗涤，重复洗涤至Fe3O4磁性纳米粒混悬液pH为中性；

[0019] 激光粒度仪检测制得的Fe3O4磁性纳米粒的平均粒径在20nm左右，透射电镜下可见磁性纳米粒呈圆球型且呈单分散分布。

[0020] 通过比较毛菊苣总倍半萜提取物溶液和本发明制备的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒溶液的体外释放考察，结果表明：毛菊苣总倍半萜提取物溶液累积释药速率较快，4h时药物累积释放百分率达到96.4％；而相同时间内毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒的累积释放量远低于提取物溶液，4h时仅为42.2％，12h时为93.1％，并且它的释药速率比较缓慢，说明毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒相对毛菊苣总倍半萜提取物具有明显的缓释效果。

[0021] 本发明要解决的技术问题是，将毛菊苣总倍半萜提取物研制成一种新型肝靶向给药载体，以增强肝病变部位的选择性和靶向性，提高生物利用度。所述的磁性脂质体纳米粒是将毛菊苣总倍半萜提取物包封于脂质体中外加磁性纳米液制备而成。制备的磁性脂质体纳米粒通过静脉注射给药后，显著提高有效成分山莴苣素在小鼠体内组织中的分布量，尤其在肝脏中。与普通脂质体相比，磁性脂质体纳米粒在肝脏中的平均滞留时间(MRT)增大了4倍，含量提高了大约42倍。表明磁性脂质体纳米粒改变了有效成分在动物体内的分布和消除过程，延长有效成分在体内的循环和作用时间，提高了有效成分在体内的生物利用度，具有一定的特异性和靶向性。

[0022] 本发明的积极效果在于：毛菊苣总倍半萜提取物收率低(约0.8％)，普通给药剂型在靶部位较难达到有效血药浓度。而将其研制成磁性脂质体纳米粒后，改变了毛菊苣总倍半萜提取物中活性成分在动物体内的分布，延长活性成分在体内的循环和作用时间，提高了活性成分在体内的生物利用度，特异性和靶向性得到显著增强。

[0023] 本发明采用无水乙醇作为磷脂类的有机溶剂，这样既排除了文献常用的毒性较大的有机试剂氯仿或甲醇的残留，又减少了环境污染，降低了生产成本，且保护了操作人员的安全，更适合于工业化生产。

附图说明

[0024] 图1是本发明毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒的粒径分布图，可见平均粒径为约65nm，符合正态分布。

[0025] 图2是本发明毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒的透射电镜图，可见中心明显包裹有磁性纳米粒，粒径范围小于100nm，分布均匀。

[0026] 图3是本发明静注毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒在小鼠组织器官中的时间-浓度变化，即体内的组织分布图，可见磁性纳米粒具有一定的肝靶向性，其中1为0.083小时，2为0.167小时，3为0.333小时，4为0.5小时，5为1小时，6为2小时，7为4小时，8为6小时，9为12小时。

具体实施方式

[0027] 通过以下实施例进一步描述本发明，应当理解的是，这些实施例在不背离本发明的技术前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求保护范围之内。

[0028] 实施例1

[0029] 精密称取大豆卵磷脂1200mg、氢化大豆卵磷脂200mg、胆固醇300mg、毛菊苣总倍半萜提取物60mg置锥形瓶中，加入8ml无水乙醇，超声使溶解；

[0030] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液4ml中，在温度60℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用超声细胞粉碎仪探头超声(400W)150次，即得到普通脂质体；

[0031] 将普通脂质体溶液以2mL/min的流速通过具有细孔径的针头注入到5ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附30min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为30nm，平均包封率为91.2％(n＝3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0032] 实施例2

[0033] 精密称取大豆卵磷脂1400mg、氢化大豆卵磷脂400mg、胆固醇340mg、毛菊苣总倍半萜提取物100mg置锥形瓶中，加入15ml无水乙醇，超声使溶解；

[0034] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝6.8磷酸盐缓冲溶液4ml中，在温度50℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，即得到普通脂质体；

[0035] 将普通脂质体溶液以1mL/min的流速通过具有细孔径的管道注入到4ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附30min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为50nm，平均包封率为92％(n＝3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0036] 实施例3

[0037] 精密称取大豆卵磷脂1300mg、氢化大豆卵磷脂300mg、胆固醇320mg、毛菊苣总倍半萜提取物80mg置锥形瓶中，加入10ml无水乙醇，超声使溶解；

[0038] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液2ml中，在温度60℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，即得到普通脂质体；

[0039] 将普通脂质体溶液以1mL/min的流速通过具有细孔径的针头注入到2ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附30min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为80nm，平均包封率为92.4％(n＝3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0040] 实施例4

[0041] 精密称取大豆卵磷脂800mg、氢化大豆卵磷脂100mg、胆固醇160mg、毛菊苣总倍半萜提取物40mg置锥形瓶中，加入5ml无水乙醇，超声使溶解；

[0042] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液2ml中，在温度45℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，得到普通脂质体；

[0043] 将普通脂质体溶液以1.5mL/min的流速通过具有细孔径的管道注入到4ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附30min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为120nm，平均包封率为91.7％(n＝
3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0044] 实施例5

[0045] 精密称取大豆卵磷脂3000mg、氢化大豆卵磷脂500mg、胆固醇640mg、毛菊苣总倍半萜提取物160mg置锥形瓶中，加入20ml无水乙醇，超声使溶解；

[0046] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液5ml中，在温度50℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，得到普通脂质体；

[0047] 将普通脂质体溶液以3mL/min的流速通过具有细孔径的针头注入到5ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附40min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为150nm，平均包封率为93.1％(n＝3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0048] 实施例6

[0049] 精密称取蛋黄卵磷脂2000mg、胆固醇200mg、毛菊苣总倍半萜提取物60mg置锥形瓶中，加入15ml无水乙醇，超声使溶解；

[0050] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝6.8磷酸盐缓冲溶液5ml中，在温度50℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，得到普通脂质体；

[0051] 将普通脂质体溶液以2mL/min的流速通过具有细孔径的针头注入到4ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附30min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为100nm，平均包封率为92.2％(n＝3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0052] 实施例7

[0053] 精密称取磷脂酰胆碱1200mg、胆固醇160mg、毛菊苣总倍半萜提取物50mg置锥形瓶中，加入10ml无水乙醇，超声使溶解；

[0054] 将所得溶液加入到恒温60℃的pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液3ml中，在温度60℃水浴条件下磁力搅拌1h，除去乙醇，再用400W超声细胞粉碎仪探头超声150次，得到普通脂质体；

[0055] 将普通脂质体溶液以1mL/min的流速通过具有细孔径的针头注入到3ml 2％吐温80的Fe3O4磁性纳米粒混悬液中，恒温振荡，待脂质体溶液滴加完毕后温度55℃水浴30min，静置吸附30min后进行分离，冷冻干燥，得到粒径为110nm，平均包封率为91.6％(n＝3)的毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒。

[0056] 实施例8

[0057] 体内药效实验

[0058] 研究毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒对小鼠体内急性和免疫性肝损伤的保护作用。

[0059] 实验药物

[0060] 受试药：毛菊苣总倍半萜提取物(SRF，中科院新疆理化技术研究所自制)、毛菊苣总倍半萜磁性脂质体纳米粒(SRF-MLN，中国医学科学院药物研究所自制)；阳性对照药：联苯双酯滴丸(北京协和药厂生产)。

[0061] 实验动物

[0062] 7-9周昆明种雌性小鼠，体重18～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2014-0023。

[0063] 小鼠分组及给药

[0064] 抗急性肝损伤：昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为正常组、模型组、SRF溶液组、高、中、低剂量的SRF-MLN溶液和阳性药组(联苯双脂)，每组6只。从造模第1d起，尾静脉注射SRF(25mg/kg)溶液和SRF-MLN低、中、高剂量(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg)，灌胃联苯双脂滴丸(150mg/kg)，连续给药10d，空白对照组和模型组分别注射等体积的生理盐水。

[0065] 抗免疫性肝损伤：除正常组小鼠外，其余各组于第1d给药前15min小鼠尾静脉注射BCG生理盐水溶液后，从造模第1d起，尾静脉注射SRF(25mg/kg)溶液和SRF-MLN低、中、高剂量(6.25mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg)，灌胃联苯双脂(150mg/kg)，连续给药10d，空白对照组和模型组分别注射等体积的生理盐水，末次给药15min后小鼠尾静脉注射LPS生理盐水溶液，禁食24h后处理样品。

[0066] 样本采集与处理

[0067] 于末次给药后禁食24h，从小鼠眼静脉丛取血，收集血清，于4℃存放，眼球取血后拉颈处死小鼠，迅速解剖，剪取肝右叶相同部位，洗净后加4℃预冷生理盐水于匀浆器中研磨，冰浴中制备10％匀浆，3000r/min离心15min，取上清液，按照试剂盒说明书测定含量。同时，取肝右叶相同部位，用4％多聚甲醛固定或置于温度-80℃冰箱存放。

[0068] 生化指标检测

[0069] 将血液收集与促凝管中，温度4℃静置30min，于1500rpm离心20min，用移液枪吸取上层淡黄色血清，随后根据各检测试剂盒，测定血清中ALT和AST和肝匀浆液中MDA和SOD的含量。

[0070] 表1SRF-MLN对CCl4致小鼠急性肝损伤模型的影响(n＝6)

[0071]

[0072] 与空白组比较，△△P<0.01，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

[0073] 表2SRF-MLN对小鼠免疫性肝损伤模型的影响(n＝6)

[0074]

[0075] 与空白组比较，△△P<0.01，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

[0076] SRF-MLN能明显拮抗上述2种肝损伤动物模型ALT、AST活性、肝MDA含量的升高和SOD活性的降低，具有抑制肝细胞脂质过氧化、稳定肝细胞膜结构的作用；能提高肝组织SOD的活力，使肝细胞的抗氧化能力增强，从而抵御肝细胞的氧化应激和过氧化，使肝细胞免受损伤，从而达到治疗肝损伤的目的。