担载型抗体高选择性吸附配基、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种担载型抗体高选择性吸附配基、其制备方法及应用。所述的吸附配基，由载体及结合于载体表面的吸附配基组成，所述的配基具有通式I的结构。该通式I中所述的X是S、O或NH；所述的Y是H或CH3；所述的n是不小于2的整数。本发明所述的吸附配基以聚乙二醇链为功能配基，并采用砜基结构连接载体和聚乙二醇链，能够高效地选择性结合免疫球蛋白(IgG)，并且有效抵抗血清杂蛋白的吸附。并且具有结构简单、制备方便、选择性高、蛋白吸附容量大的优点，是一种具有潜力的抗体吸附配基。

权利要求

1.一种高选择性吸附抗体的担载型吸附配基，由载体及结合于载体表面的吸附配基组成，其特征在于，所述的配基具有通式I的结构：通式I中，

所述的X是S、O或NH；

所述的Y是H或CH3；

所述的n是不小于2的整数；

所述的载体是琼脂糖凝胶微球或氨基功能化的二氧化硅微球。

2.根据权利要求1所述的高选择性吸附抗体的担载型吸附配基，其特征在于，所述的2≤n≤75。

3.根据权利要求1所述的高选择性吸附抗体的担载型吸附配基，其特征在于，所述的X是NH。

4.权利要求1所述的高选择性吸附抗体的担载型吸附配基的制备方法，包括如下步骤：(1)将载体分散于二乙烯基砜(DVS)溶液中，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；

(2)将乙烯基砜活化的载体材料分散于聚乙二醇溶液，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基；

其中，所述的聚乙二醇是氨基聚乙二醇、羟基聚乙二醇或巯基聚乙二醇。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将载体材料分散于体积浓度为0.5～30％的二乙烯基砜溶液中，使体系pH为8～11，并于20～60℃条件下反应1～12h；离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；

(2)将乙烯基砜活化的载体材料分散于浓度为1～50mM的氨基聚乙二醇溶液，使体系pH为8～11，并于20～60℃条件下反应1～12h；离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基。

6.权利要求1所述的高选择性吸附抗体的担载型吸附配基在抗体蛋白特异性识别与吸附中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗体蛋白特异性识别与吸附的环境条件包括：pH为5～9且有0～0.6M的NaCl存在。

说明书

担载型抗体高选择性吸附配基、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及一种新型抗体高选择性吸附配基及其应用。技术背景

[0002] 抗体蛋白具有优良的生理活性，在免疫学、生物化学和生物医学等领域有着广泛的应用。近年来，随着免疫学和基因工程学的快速发展，抗体的需求量越来越大，因此，获取低成本、高纯度和高生物活性的抗体蛋白已成为生物化工领域的重要研究方向。

[0003] 围绕抗体蛋白的物理化学性质将抗体蛋白从血浆或细胞培养基质分离发展了多种抗体蛋白纯化方法，包括盐析，非亲和层析和亲和层析等。盐析法利用高浓度的盐溶液破坏抗体表面的水化层，使抗体表面的电荷中和从而析出。该方法操作较为简单，但往往需要料液中抗体浓度较高，而且析出的抗体蛋白纯度和活性较低。

[0004] 非亲和层析包括排阻色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、反向色谱和羟磷灰石色谱等。排阻色谱法依据分子大小分离蛋白，配基通常为惰性载体，操作条件简单温和，但分离时间长，效率低。疏水作用色谱是利用目标产物和配基间疏水相互作用分离目标产物，该方法通常具有盐依赖性，得到的抗体蛋白纯度较低。离子交换色谱利用基质与蛋白之间的静电作用实现蛋白分离，该方法操作简单、分离效果好、料液处理量大，但通常需要对蛋白溶液进行前处理。

[0005] 亲和层析是在基质上引入特异性识别蛋白的活性生物分子(如酶底物、抗原等)从而达到分离蛋白目的。目前抗体蛋白生产工艺中使用最广泛的是蛋白A亲和层析，该方法结合抗体蛋白的特异性高，缺点是介质价格昂贵，纯化抗体蛋白的容量有限，且蛋白配基易降解脱落，重复使用次数有限，操作成本较高。

[0006] 综上所述，目前非亲和层析方法存在的主要问题是抗体蛋白吸附特异性不够高；蛋白A亲和层析法价格昂贵，并且存在蛋白配基降解脱落的问题。因此，寻找一种特异性高、成本低廉的新型抗体蛋白结合配基具有重要的意义。

发明内容

[0007] 本发明的目的首先在于提供一种特异性高、成本低廉的新型抗体蛋白识别及吸附配基。本发明所述的担载型抗体高选择性吸附配基，由载体及结合于载体表面的吸附配基组成，所述的配基具有通式I的结构：

[0008]

[0009] 通式I中，

[0010] 所述的X是S、O或NH；

[0011] 所述的Y是H或CH3；

[0012] 所述的n是不小于2的整数。

[0013] 本发明进一步提供所述担载型抗体高选择性吸附配基的制备方法，该方法包括如下步骤：

[0014] (1)将载体分散于二乙烯基砜(DVS)溶液中，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；

[0015] (2)将乙烯基砜活化的载体材料分散于聚乙二醇溶液，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基。

[0016] 本发明所述的担载型抗体高选择性吸附配基以聚乙二醇链为功能配基，并采用砜基结构连接载体和聚乙二醇链，能够高效地选择性结合免疫球蛋白(IgG)，并且有效抵抗血清杂蛋白的吸附。

[0017] 基于此，本发明再一方面的目的在于提供所述担载型抗体高选择性吸附配基在在抗体蛋白特异性识别与吸附中的应用。

[0018] 所述应用的环境条件包括：pH为5～9且有0～0.6M的NaCl存在。其中pH优选7～8，最优选7.45；NaCl浓度优选0.15M。

附图说明

[0019] 本发明附图7幅，用以对本发明的进一步说明，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

[0020] 图1是实施例1制备硅纳米粒子担载的抗体蛋白特异性吸附配基各步产物1H NMR表征；

[0021] 图2是杂原子对配基选择性的影响；

[0022] 图3是聚乙二醇链长对配基选择性的影响；

[0023] 图4是溶液pH对蛋白选择性的影响；

[0024] 图5是溶液盐浓度对蛋白选择性的影响；

[0025] 图6是实施例1所制备的硅纳米粒子担载的抗体蛋白特异性吸附配基选择性吸附混合蛋白溶液中IgG凝胶电泳图；a蛋白分子量标准；b IgG蛋白对照；c BSA蛋白对照；d在0.2mg/mL IgG溶液中孵育的磁性纳米粒子；e在0.2mg/mL IgG溶液(含0.02mg/mL BSA)中孵育的磁性纳米粒子；f在0.2mg/mL IgG溶液(含0.2mg/mL BSA)中孵育的磁性纳米粒子；g在
0.2mg/mL IgG溶液(含2mg/mL BSA)中孵育的磁性纳米粒子；h在0.2mg/mL BSA溶液中的孵育磁性纳米粒子。

[0026] 图7本发明公布的配基选择性吸附血清溶液中IgG凝胶电泳图；a蛋白分子量标准；b IgG蛋白对照；c在0.2mg/mL IgG溶液中孵育的磁性纳米粒子；d在0.2mg/mL IgG溶液(含
10％血清)中孵育的磁性纳米粒子。

具体实施方式

[0027] 本发明所公开的担载型抗体高选择性吸附配基，由载体及结合于载体表面的吸附配基组成，其结构可以表示为通式II：

[0028]

[0029] 该通式II中，配基与载体经配基结构中的砜基结合，所述配基以通式I表示：

[0030]

[0031] 上述通式I和II中，所述的X是S、O或NH；优选NH；

[0032] 所述的Y是H或CH3；

[0033] 所述的n是不小于2的整数，优选2≤n≤75，尤其优选30≤n≤40。

[0034] 本发明的担载型抗体高选择性吸附配基中所述的载体是具有表面氨基或氨基功能化的亲水性微球。尤其优选氨基功能化的二氧化硅微球或琼脂糖凝胶微球。

[0035] 本发明进一步提供所述担载型抗体高选择性吸附配基的制备方法，包括如下步骤：

[0036] (1)将载体分散于二乙烯基砜(DVS)溶液中，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；

[0037] 其中，二乙烯基砜(DVS)溶液体积浓度为0.5～30％，优选5～20％[0038] 所述的反应条件pH为8～11，优选9～10。

[0039] 所述的反应温度20～60℃，优选20～40℃。

[0040] 所述的反应时间1～12h，优选8～12h。

[0041] (2)将乙烯基砜活化的载体材料分散于聚乙二醇溶液，反应后离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基。

[0042] 其中，所述的聚乙二醇包括但不限于氨基聚乙二醇、羟基聚乙二醇和巯基聚乙二醇，其中优选氨基聚乙二醇；

[0043] 所述的聚乙二醇的浓度为1～50mM，优选10～20mM；

[0044] 所述的乙烯基砜活化的载体材料与聚乙二醇的反应pH条件根据具体的原料类型有所偏好：含氨基聚乙二醇的反应pH为8～11，优选9～10；含羟基聚乙二醇的反应pH为10～12，优选11～12；含巯基聚乙二醇的反应pH为6～9，优选7～8。

[0045] 该步骤(2)所述的反应温度20～60℃，优选20～40℃。

[0046] 所述的反应时间1～12h，优选8～12h。

[0047] 容易理解，上述优选范围内的参数选择可以构成所述制备方法的优选的具体实施方式。

[0048] 作为举例，本发明所述的担载型抗体高选择性吸附配基的制备方法包括如下步骤：

[0049] (1)将载体材料分散于体积浓度为0.5～30％的二乙烯基砜(DVS)溶液中，使体系pH为8～11，并于20～60℃条件下反应1～12h；离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；

[0050] (2)将乙烯基砜活化的载体材料分散于浓度为1～50mM的氨基聚乙二醇溶液，使体系pH为8～11，并于20～60℃条件下反应1～12h；离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基。

[0051] 更为优选的实施方式中，所述的制备方法包括如下步骤：

[0052] (1)将载体材料分散于体积浓度为5～20％的二乙烯基砜(DVS)溶液中，使体系pH为9～10，并于20～40℃条件下反应8～12h；离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到乙烯基砜活化的载体材料；

[0053] (2)将乙烯基砜活化的载体材料分散于浓度为10～20mM的氨基聚乙二醇溶液，使体系pH为9～10，并于20～40℃条件下反应8～12h；离心分离，固体用无水乙醇洗涤，得到担载型抗体高选择性吸附配基。

[0054] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，实施例中选取免疫球蛋白(IgG)作为抗体蛋白模型，选取牛血清白蛋白(BSA)作为杂蛋白模型。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0055] 实施例1

[0056] 以硅纳米粒子为基底的层析介质的制备与表征

[0057] 取100mg硅纳米球，硝酸溶液(pH 4)处理30min，无水乙醇洗涤。加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液(2％，v/v)反应过夜。离心分离，无水乙醇洗涤。分散于DVS溶液(1M，pH 9.5)反应过夜。离心分离，无水乙醇洗涤。加入氨基三聚乙二醇单甲醚溶液(20mM，pH 9.5)超声分散，反应过夜。离心分离，无水乙醇洗涤。每一步均使用1H-NMR表征。结果如图1所示，在裸硅纳米粒子的谱图中，未观察到有机物谱峰；APTES修饰硅纳米粒子的谱图中，依次出现了与氨基相连的CH2峰，与Si相连的CH2峰；DVS修饰硅纳米粒子的谱图中，出现了乙烯基的特征峰；氨基三聚乙二醇单甲醚修饰的硅纳米粒子的谱图中出现了聚乙二醇链特征峰，同时乙烯基的特征峰消失，说明通过三步反应我们成功在硅纳米粒子表面固定了抗体特异性吸附配基。

[0058] 实施例2

[0059] IgG和BSA静态吸附

[0060] 根据实施例1中所述的步骤，使用NH2PEG2000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。取1mg二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性纳米粒子，分别再加入0.5ml IgG和BSA溶液(1mg/ml，pH 7.5)，超声分散，25℃孵育15分钟。磁铁分离，收集上清液，使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.5)洗涤磁性纳米粒子三次并收集洗涤液。用BCA试剂盒定量未被吸附的IgG和BSA浓度，并计算IgG和BSA的吸附量。

[0061] IgG吸附量＝原液中IgG含量－未被吸附的IgG含量

[0062] BSA吸附量＝原液中BSA含量－未被吸附的BSA含量

[0063] 实施例3

[0064] 杂原子对配基选择性的影响

[0065] 根据实施例1所述的步骤，分别使用SH PEG2000，NH2PEG2000和OH PEG 2000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。并且在二氧化硅包裹的磁纳米粒子氨基化之后，直接用NHS PEG2000偶联PEG2000制备不含砜基的配基结构作为对照。根据实施例2所述蛋白静态吸附方法，测定IgG和BSA在不同配基上的吸附量，结果如图2所示。只含PEG、不含砜基的配基对IgG和BSA的吸附量均比较低，表明了聚乙二醇链具有较好的抗蛋白吸附作用。而同时含砜基和PEG配基的对IgG有较高的吸附量，而对BSA吸附量较低，表明了砜基基团对IgG的识别作用。

[0066] NH2PEG2000和OH PEG2000配基的蛋白选择性均高于SH PEG2000配基的蛋白选择性，并且与SH PEG2000配基相比，二者的化学稳定性也更好，因此杂原子优选NH和O。考虑到羟基反应活性低，配基固定效率低，最优选氮原子。

[0067] 实施例4

[0068] 聚乙二醇链长对配基选择性的影响

[0069] 根据实施例1所述的步骤，分别使用氨基乙醇、NH2EG3、NH2PEG1000、NH2PEG2000和NH2PEG5000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。根据实施例2所述蛋白静态吸附方法，我们对NH2PEG链长的影响进行了评价，结果如图3所示。随着PEG链长增长，BSA的吸附量逐渐减少，而IgG的吸附量几乎不变；当PEG链长n大于40，BSA吸附量近乎维持恒定，因此优选PEG 2000(n＝30～40)作为最优链长。

[0070] 实施例5

[0071] 溶液pH对蛋白选择性的影响

[0072] 根据实施例1所述的步骤，使用NH2PEG2000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。根据实施例2所述蛋白静态吸附方法，检测IgG和BSA在pH＝5、6、7、7.45、8和9的条件下的吸附量，结果如图4所示。配基对IgG的选择性随着pH升高而升高，考虑高pH条件会降低蛋白活性，优选pH＝7.45，此时蛋白选择性IgG/BSA＝9.6。

[0073] 实施例6

[0074] 溶液盐浓度对蛋白选择性的影响

[0075] 根据实施例1所述的步骤，使用NH2PEG 2000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。根据实施例2所述蛋白静态吸附方法，固定溶液pH＝7.45，检测溶液NaCl浓度分别为0M、0.15M、0.3M和0.6M条件下，IgG和BSA的吸附量，结果如图5所示。随着NaCl浓度的增高，IgG和BSA的吸附量均降低，但蛋白选择性IgG/BSA升高，当NaCl浓度达到0.15M时，蛋白选择性IgG/BSA＝32.5。该结果表明NaCl的存在能有效提高蛋白的选择性，考虑到高NaCl浓度会降低IgG吸附量，优选0.15M NaCl(即生理条件)。

[0076] 实施例7

[0077] 二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性纳米粒子为基底、以NH2PEG2000为配基的层析介质在选择性吸附混合蛋白溶液中IgG实例

[0078] 根据实施例1所述的步骤，使用NH2PEG 2000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。取1mg磁性纳米粒子分别加入含有0.02、0.2、2mg/mL BSA的IgG溶液(0.2mg/mL)和BSA溶液(0.2mg/mL)，静态吸附15分钟，吸附介质经PBS洗涤三次后，采用凝胶电泳分析磁性纳米粒子上结合的蛋白，结果如图6所示。加入BSA溶液的磁性纳米粒子(条带h)未观察到蛋白条带，表明该配基能有效抗白蛋白吸附。加入IgG溶液(含BSA)的纳米粒子(条带d、e、f、g)仅能观察到IgG蛋白条带，表明该配基在混合蛋白溶液中能高选择性吸附IgG。

[0079] 实施例8

[0080] 二氧化硅包裹的四氧化三铁磁性纳米粒子为基底、以NH2PEG2000为配基的层析介质在选择性吸附血清溶液中IgG实例

[0081] 根据实施例1所述的步骤，使用NH2PEG 2000在二氧化硅包裹的磁纳米粒子表面固定抗体蛋白特异性吸附配基。取1mg磁性纳米粒子分别加入含有0、10％血清的IgG溶液(0.2mg/mL)，静态吸附15分钟，吸附介质经PBS洗涤三次后，采用凝胶电泳分析磁性纳米粒子上结合的蛋白，结果如图7所示。加入含血清的IgG溶液的纳米粒子(条带d)仅能观察到IgG蛋白条带，表明该配基在血清溶液中能高选择性吸附IgG。