一种革胡子鲶抗菌肽及提取方法

摘要

本发明属于生物纯化领域，具体提供了一种革胡子鲶抗菌肽，同时还提供了所述抗菌肽的纯化和提纯的方法，具体为1)原料初加工，将革胡子鲶加工副产物在冰浴下剪碎，用组织均质机磨碎，密闭容器中蒸煮；2)酶解步骤1)的原料加入缓冲液混合，然后加入蛋白酶酶解；3)分离步骤2)的酶解液先进性酶灭活，然后离心收集上清，加入一定量蔗糖后冷冻干燥，获得抗菌肽粗品；4)纯化步骤3)的抗菌肽粗品利用分子排阻色谱进行初步纯化，然后进行离子交换色谱分离、SDS‑PAGE电泳、反相高效液相色谱纯化，获得上述革胡子鲶抗菌肽。本发明提供的方法提纯简单，节约了成本以及多肽的损耗，提取效率高，可以用于工业化推广使用。

权利要求

1. 一种革胡子鲶抗菌肽，其氨基酸序列如下：F-S-G-C-A-L-A-E-G-H-W-H-C-H-C-R-S-I-E-E-A-G-G-T-C-A-V-F-F-K-E-T-C-T-C-T-Q-D，其分子量为4136.6。

2.权利要求1所述的革胡子鲶抗菌肽在制备抗嗜水气单胞菌药物中的应用。

3.权利要求1所述的革胡子鲶抗菌肽在制备水产养殖抗嗜水气单胞菌药物中的应用。

说明书

一种革胡子鲶抗菌肽及提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗菌肽及提取方法。

背景技术

[0002] 高密度、集约化养殖使水产养殖对象频发各种细菌性和病毒性疾病，在病害防治过程中，大量使用抗生素或其它药物，不仅导致病原体对药物产生耐药性，无法有效控制疾病的发生，而且药物残留也破坏了水环境的微生态平衡，还严重威胁人类的食品安全。因此，急需研发新型、绿色的生物防治药物和饲料添加剂。而加快对水产动物免疫防御机制的基础研究，调动、开发其自身的防御潜力，也是有效防止病害发生、开展健康养殖，实现养殖业可持续发展的重要战略之一。

[0003] 抗菌肽(Antimicrobial peptides)是动物体内诱导产生的具有广谱抗菌活性的多肽。诸多的研究显示：鱼类的抗菌肽不仅种类繁多、结构多样、抗菌谱广但抑菌活性有异，不同鱼类以及同一鱼类不同的组织器官中抗菌肽的种类不同、氨基酸序列同源性较低。革胡子鲶(Clarias gariepinus)是我国一种重要的淡水养殖鱼类，研究表明，该鱼皮肤和体表粘液、肠道、鳃和鳃上器官以及血清中均有抗菌蛋白/肽的存在，有关革胡子鲶非特异免疫因子的研究，2008年杨学明等[38]依据GenBank中鲶形目鱼类hepcidin基因的编码序列设计2对引物，采用套式PCR技术，从革胡子鲶肝脏中克隆了233bp的hepcidin基因cDNA片段；但目前未见该学者对克隆的此片段的后续研究报道。

发明内容

[0004] 革胡子鲶(Clariasgariepinus)隶属于鲶形目、胡鲶科、胡鲶属，原产于非洲，1981年引入我国。该鱼具有生长快、抗病力强、耐低氧、可高密度养殖等优点，具有广阔的市场前景。与其它养殖鱼类不同，因其肌间刺少，加工制品色泽、弹性好，因此有一定比例的商品鱼进入了加工领域，该鱼在加工的过程中有近50％的副产品产生。并且与其它鱼类相比，革胡子鲶有很强的抗逆性及抗病性。本发明申请单位与天津市德仁农业发展有限公司经多年的合作探索，使革胡子鲶的池塘养殖产量最高可达1700kg/亩，设施化高密度养殖最高产量可达近400kg/m3。如此高密度养殖的革胡子鲶仍能够健康生长，推测与其内在的免疫因子有关。

[0005] 每年革胡子鲶的产量仅在天津就可达近8000吨左右，与其它养殖鱼类不同，因其肌间刺少，加工制品色泽、弹性好，因此有一定比例的商品鱼进入了加工领域，在加工的过程中有近50％的副产品产生，如何利用这些加工副产品？其次，高密度、集约化养殖使水产养殖对象频发各种细菌性和病毒性疾病，但为何高密度养殖的革胡子鲶显示出很强的抗病性？对于上述问题未见他人的研究报道。因此，从革胡子鲶加工副产品中提取具有生物活性的抗菌肽，克隆抗菌肽等非特异免疫因子(溶菌酶、干扰素)基因、解析基因序列并分析高密度养殖革胡子鲶上述因子的基因组织表达特征，对挖掘革胡子鲶加工副产品的利用价值、实现基因工程化生产新型绿色抗菌药物和饲料添加剂以及深入探究革胡子鲶的抗病机理和免疫防御机制具有重要意义。

[0006] 本发明的发明内容之一为提供一种革胡子鲶抗菌肽。

[0007] 本申请发明人及其团队一直致力于革胡子鲶的科学研究，申请人从革胡子鲶的体表粘液、皮肤、肠道、鳃和鳃上器官以及血清中分离提取了具有抑菌活性的抗菌肽；并初步建立了革胡子鲶肠道抗菌肽提取的分级盐析法。研究成果发表在Advanced Materials Research Vols.455-456(2012)pp 455-460，EI)。

[0008] 本发明从革胡子鲶加工后的副产物废弃内脏中也同样分离到了有明显抑菌活性的蛋白组份(图1中抑菌圈2-5)。研究成果已发表在Lecture Notes in Electrical Engineering(Optimization of Extraction Conditions for Crude Antibacterial Proteins/Peptides from Clarias gariepinus By-products，2015,333:547-555，EI)。图1：从革胡子鲶内脏中提取到了对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)(图A)及大肠杆菌(E.coli)(图B)均有抑菌活性的蛋白组分。

[0009] 抗菌肽的氨基酸序列测定

[0010] 申请人将得到的抗菌肽进行了氨基酸序列测定，测定结果如下：

[0011] F-S-G-C-A-L-A-E-G-H-W-H-C-H-C-R-S-I-E-E-A-G-G-T-C-A-V-F-F-K-E-T-C-T-C-T-Q-D,该多肽的分子量大小4136.6，计算机模拟的等电点pI＝5.59。通过NCBI blast比对，发现该肽为新发现的抗菌肽。

[0012] 对该蛋白组份进行了分离纯化，结果显示该肽的分子量大约在4.1KD左右(结果如图2泳道4所示)，并且显示了良好的理化稳定性。

[0013] 通过鸟枪质谱法鉴定，确定是未知的抗菌肽，通过Mascot搜索，其特征片段与人源抗菌肽Dermcidin(UniProtKB:P81605(DCD_HUMAN)有共同特征肽段,K.DAVEDLESVGK.G，K.ENAGEDPGLAR.Q,K.AVGGLGKLGK.D,如图3所示。

[0014] 到目前为止尚未检索到其它有关革胡子鲶抗菌肽的研究报道。本申请在前期研究基础上，将以我们前期研究中发现的分子量为4.1KD左右的抗菌肽为目标，研究其对水产动物常见病原菌—嗜水气单胞菌抑杀分子机制，为该抗菌肽的开发奠定基础。

[0015] 本发明的发明内容之二为提供一种革胡子鲶抗菌肽的提取方法。

[0016] 现有的提取革胡子鲶抗菌肽的方法主要为采用硫酸铵分级盐析，但这种方法，需要消耗大量硫酸铵，提取效率低，提取物进一步分离提纯困难。因此提供一种新的提取效率更高，更易于后续分离革胡子鲶抗菌肽提取方法，成为现有技术中亟待解决的问题。

[0017] 本发明以抗病力强、高密度养殖、健康的革胡子鲶为研究材料，从其加工副产物中分离提取具有生物活性的抗菌肽；建立革胡子鲶抗菌肽提取的技术方法，挖掘革胡子鲶加工副产品的利用价值，对提高水产品加工企业的综合效益具有重要意义。

[0018] 本发明通过酶解方法获得革胡子鲶抗菌肽，然后对上述抗菌肽进行了分离纯化。具体步骤如下：

[0019] 1)原料初加工

[0020] 将革胡子鲶加工副产物在冰浴下剪碎，用组织均质机磨碎，密闭容器中蒸煮；

[0021] 2)酶解

[0022] 步骤1)的原料加入缓冲液混合，然后加入蛋白酶酶解；

[0023] 3)分离

[0024] 步骤2)的酶解液先进性酶灭活，然后离心收集上清，加入一定量蔗糖后冷冻干燥，获得抗菌肽粗品；

[0025] 4)纯化

[0026] 步骤3)的抗菌肽粗品利用分子排阻色谱进行初步纯化，然后进行离子交换色谱分离、SDS-PAGE电泳、反相高效液相色谱纯化，获得上述革胡子鲶抗菌肽。

[0027] 作为优选的技术方案，其中革胡子鲶加工副产物为：革胡子鲶内脏、鳃和鳃上器官、头肾及其它组织；蒸煮条件为80℃，10min；酶用量为2％；离心分离条件为4℃，10000rpm，离心10min；蔗糖加入量为3％。分子排阻色谱为sephadex G-25；离子交换色谱分离为DEAE Cellulose DE52；反相高效液相色谱色谱柱为Cosmosil 5C18-PAQ。

[0028] 本发明的发明内容之三为提供一种革胡子鲶抗菌肽的应用。

[0029] 革胡子鲶抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。革胡子鲶抗菌肽在制备水产养殖抗菌药物中的应用。通过实验验证了本发明提取得到的革胡子鲶抗菌肽具有良好的抑菌性能，可以广泛应用于水产养殖抗菌药物中，也可以应用于其他抗菌药物的制备中，本发明为革胡子鲶加工中的副产物的再次利用提供坚实的基础，为革胡子鲶养殖、加工企业提供了很高的经济效益和环境效益。

[0030] 本发明带来的技术效果：克隆革胡子鲶抗菌肽等非特异免疫因子(溶菌酶、干扰素)的基因，分析高密度养殖革胡子鲶上述非特异免疫因子基因的表达特征。不仅为基因工程化生产新型、绿色抗菌药物和饲料添加剂提供技术支持和原材料，对减少水产养殖过程中抗生素和其它药物的使用以及药物残留对人类和环境的威胁具有重要的社会和环境效益；也为深入探究革胡子鲶的抗病机理和免疫防御机制奠定基础。

附图说明

[0031] 图1从革胡子鲶内脏中提取到了对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)(图1A)及大肠杆菌(E.coli)(图1B)均有抑菌活性的蛋白组分。

[0032] 图2分离纯化得到的多肽，泳道4

[0033] 图3与人源抗菌肽Dermcidin有共同特征肽段的图谱

[0034] 图4革胡子鲶多肽Sephadex G-25层析

[0035] 图5革胡子鲶多肽DEAE-cellulose DE52纯化

[0036] 图6SDS-PAGE电泳图

[0037] 图7RP-HPLC色谱图

[0038] 图8革胡子鲶多肽对嗜水气单胞菌的抑菌活性，(1号为图1中的组分Ⅰ，2号为组分Ⅱ，4号组分Ⅲ。3号为图2中的组分M。5号为土霉素阳性对照图，0号为阴性对照)。

具体实施方式

[0039] 实施例1革胡子鲶加工副产物酶解制备抗菌肽

[0040] 一、材料

[0041] 前期分离的革胡子鲶内脏，头肾及其它组织。

[0042] 二、实验方案

[0043] 1、酶的种类及酶解条件

[0044] 蛋白酶种类：Flavourzyme,Alcalase,Papain

[0045] Flavourzyme,pH:5-7，温度：大约50℃。Alcalase,pH：6.5-8.5，温度：60℃左右。Papain,pH：5.0-7.0，温度：65℃左右。对组织进行水解。

[0046] 实验步骤

[0047] 以下以Flavourzyme为例，其它酶，根据该酶的作用条件进行类似设计[0048] A:称取10g磨碎后的组织样品(湿重)，放到三角瓶中，然后按照1:1比例，加入0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 6.0),充分搅拌混合均匀，然后按照2％(m/m)比例加入酶0.2g,酶需要事先用少量的Tris-HCl缓冲液(pH 6.0)溶解至透明澄清后，再加到组织样品混合液中，然后再充分搅拌混合2min，然后在水浴摇床中震荡混合(温度50℃),摇床转速150rpm.该部分做4个时间梯度：

[0049] 30min,60min,90min,120min。所以需要称取4份组织进行实验。

[0050] B:水解结束后，进行酶灭活。80℃，保温15min。然后离心收集上清液(4℃，10000rpm,10min)。上清液需要记录体积，以及采用BCA法测量蛋白浓度。

[0051] C：上清液冷冻干燥，冷冻干燥后，称取干燥后的水解肽的重量，并记录。

[0052] 风味蛋白酶水解：

[0053] 表1酶与副产物的比例E/S

[0054]E/S 水解肽得率％ 肽粗品得率％
1％ 1.66 10.74
2％ 1.49 9.23
4％ 1.63 12.45
6％ 2.12 15.58

[0055] 表2：水解pH

[0056]pH 水解肽得率％ 肽粗品得率％
5.5 1.53 11.5
6 1.78 11.2
6.5 1.67 16.7
7 1.80 10.7

[0057] 表3：水解时间

[0058]时间min 水解肽得率％ 肽粗品得率％
30 1.64 12.1
60 1.65 11.8
90 1.54 14.2
120 1.65 13.7

[0059] 表4：水解温度

[0060]温度 水解肽得率％ 肽粗品得率％
46 1.68 11.4
50 1.55 11.5
54 1.45 10.5
58 1.31 9.56

[0061] 2、sephadex G-25层析

[0062] 上清液冻干后收集多肽粗品，并利用分子排阻色谱进行初步纯化，结果如下图所示，可以分成三个多肽组分，分别是组分Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ。然后对分离前后多肽回收率进行了计算，回收率达到75％。具体层析步骤参见图4革胡子鲶多肽Sephadex G-25层析。

[0063] 3、革胡子鲶抗菌肽离子交换色谱分离

[0064] 采用阴离子交换树脂DEAE Cellulose DE52对图4中收集的抗菌肽组分Ⅱ进一步纯化。离子交换条件为：阴离子交换柱色谱DEAE-cellulose DE52柱经0.025M Tris-HCl(pH 6.5)缓冲液平衡2倍柱体积，然后样品用该缓冲液溶解后上样，上样后利用Tris-HCl(pH 
6.5)缓冲液冲洗1倍柱体积，然后进行NaCl梯度洗脱，浓度由0逐渐提高至0.8M，洗脱过程中速度为1ml/min。纯化结果如图3-5所示。收集主要组分M并进行抑菌活性检测，结果见图4，结果表明其对嗜水气单胞菌有良好的抑菌效果。通过计算多肽在离子交换前后的含量变化，计算出收率为70.2％。

[0065] 将组分M进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明主要成分为分子量大约为4.1KD附近的产物。见图6所示。RP-HPLC分离纯化抗菌肽：

[0066] 将得到的组分M通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行进一步的分离纯化。纯化条件为：色谱柱Cosmosil5C18-PAQ(10mm×250mm)。梯度洗脱条件：0-45min，流动相由A(0.1％(v/v)TFA)逐渐转变为80％乙腈(含有0.1％(v/v)TFA)。洗脱速度：1mL/min,检测波长：214nm。结果如图7所示，得到纯度很高的一个多肽峰，峰面积纯度达到98.07％。

[0067] 实施例2革胡子鲶抗菌肽抗菌活性试验

[0068] 1、抑菌活性检测

[0069] 以嗜水气单胞菌为指示菌，对通过Sephadex G-25获得的三个组分进行抑菌活性检测，发现组分Ⅱ及组分Ⅲ均表现出抑菌活性，但组分Ⅱ的抑菌活性更好，见图8。

[0070] 2、杯碟法抑菌试验

[0071] 将上述分离纯化得到的革胡子鲶抗菌肽样品进行抗菌活性分析。取少量干燥后的样品用无菌蒸馏水而配成10mg/ml，测量蛋白浓度(BCA)，然后进行抗菌活性分析。

[0072] 菌的活化培养及计数。吸取30μL保存的菌种转接到5mL液体培养基中，适宜温度下140r/min过夜培养(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌37℃；嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和柠檬酸杆菌30℃)。将菌原液稀释后，依照红细胞计数原则用血球计数板计数：CFU/mL＝5各方格
4
内细菌总数×5×10×稀释倍数。

[0073] 选取适宜的菌液浓度，对革胡子鲶抗菌蛋白/肽进行杯碟法抑菌试验(Ren et al，2002)。每个培养皿中加入20mL加热熔化的LB固体培养基，均匀摊布且凝固后，取稀释好的菌悬液加入到5mL熔化的固体培养基中，使其在底层培养基上均匀摊布。在培养皿底部作好相应标记后放入牛津杯(牛津杯高：10.00mm，内径：6.00mm，外径：8.00mm，)。

[0074] 将配置成一定浓度的样本(硫酸铵提取法获得蛋白100mg/mL)，在37℃下水浴30min后4℃8000r/min离心15min，取200μL上清液与阳性对照样本(土霉素)分别加入到牛津杯中，4℃静置12h，在适宜条件下培养24h，通过测量抑菌圈直径来判别样本抑菌活性的强弱(陶淑霞等，2009；李思明等，2008)。实验结果如下表所示。

[0075] 表5风味蛋白酶平均值及抑制嗜水气单胞菌结果

[0076]

[0077]

[0078] 由上述图表数据可见，本发明提取得到的革胡子鲶抗菌肽具有良好的抑菌性能，可以广泛应用于水产养殖抗菌药物中，也可以应用于其他抗菌药物的制备中，本发明为革胡子鲶加工中的副产物的再次利用提供坚实的基础，为革胡子鲶养殖、加工企业提供了很高的经济效益和环境效益。

[0079] 每年革胡子鲶的产量仅在天津就可达近8000吨左右，在加工的过程中有近50％的副产品产生，由于革胡子鲶加工中的副产物是要作为鱼的下脚料扔掉，如果能充分利用革胡子鲶的副产物来提取抗菌肽，将变废为宝，大大促进经济的发展。

[0080] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。