一种融合蛋白、其生产方法及转基因水稻的生产方法

摘要

本发明涉及一种融合蛋白、其生产方法及转基因水稻的生产方法，该融合蛋白为植物种子胚乳表达Ex4‑TF融合蛋白，其基因序列中包括：植物胚乳特异性表达启动子pGluB‑5，植物胚乳储藏蛋白信号肽sp，艾塞那肽多肽Exendin‑4，连接Exendin‑4和人铁转运蛋白hTF的连接多肽(GGGGS)x3linker，人铁转运蛋白hTF，用于蛋白质纯化的组蛋白标签6xHis，以及植物GluB‑5基因转录终止子GluB‑5‑3’‑UTR。本发明利用GluB‑5启动子可以实现融合蛋白在整个胚乳中大量表达。同时还可利用水稻具有产量高，容易种植及管理，以及水稻种子耐储存、好提取等优点，实现Ex4‑TF融合蛋白药物的持续性生产，而不会造成浪费及短缺的问题，同时降低生产成本。

权利要求

1.一种融合蛋白的生产方法，其特征是包括如下步骤：

1)以水稻密码子优化并合成水稻种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白基因，其基因序列中包括：水稻胚乳特异性表达启动子pGluB-5，水稻胚乳储藏蛋白信号肽sp，艾塞那肽多肽Exendin-4，连接Exendin-4和人铁转运蛋白hTF的连接多肽(GGGGS)x3 linker，人铁转运蛋白hTF，用于蛋白质纯化的组蛋白标签6xHis，以及水稻GluB-5基因转录终止子GluB-5-3’-UTR；所述Ex4-TF融合蛋白基因有两种，艾塞那肽分别位于融合蛋白的N端和C端，分别称为Ex4-TF融合蛋白A基因和Ex4-TF融合蛋白B基因，其中，Ex4-TF融合蛋白A基因的DNA序列为SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；Ex4-TF融合蛋白B基因的DNA序列为SEQ ID NO.3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4；

其中水稻胚乳特异性表达启动子及GluB-5基因转录终止子的克隆方法为：根据水稻基因组中水稻GluB-5基因的启动子及转录终止子序列，设计引物，从水稻日本晴基因组DNA中通过PCR扩增并克隆该序列；

其中，水稻GluB-5启动子的5’引物如SEQ ID NO.13所示，水稻GluB-5启动子的3’引物如SEQ ID NO.14所示，水稻GluB-5基因转录终止子的5’引物如SEQ ID NO.15所示，水稻GluB-5转录终止子的3’引物如SEQ ID NO.16所示；

2)构建该Ex4-TF融合蛋白胚乳特异性表达的水稻双元表达载体，其具体包括如下步骤：体外连接GluB-5基因的启动子，Ex4-TF融合蛋白基因及转录终止子，以质粒CAMBIA1301为骨架，将Ex4-TF融合蛋白基因表达框克隆T-DNA的左右边界之间，形成的载体包括Ex4-TF融合蛋白基因、用于转基因检测的GUS报告基因和用于使被转化的水稻细胞抗潮霉素的HptII基因；

3)将所述Ex4-TF融合蛋白基因导入水稻愈伤组织细胞，并通过筛选获得遗传转化水稻植株。

2.如权利要求1所述的融合蛋白的生产方法，其特征是：所述Ex4-TF融合蛋白基因导入水稻愈伤组织细胞是采用农杆菌介导法。

3.如权利要求1所述的融合蛋白的生产方法，其特征是：所述通过筛选获得遗传转化水稻植株是通过潮霉素筛选。

4.一种融合蛋白，其特征是：通过权利要求1至3任一项所述生产方法获得。

说明书

一种融合蛋白、其生产方法及转基因水稻的生产方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种融合蛋白、其生产方法，尤其是一种重组艾塞那肽融合蛋白的植物种子表达系统，并及一种转基因水稻的生产方法。

背景技术

[0002] 糖尿病是世界性慢性多发病症。一型糖尿病是由于调节血糖的胰岛素分泌不足所引起，而二型糖尿病则是由于对胰岛素的利用不善或胰岛素抗性所引起。胰岛素是胰脏β细胞所分泌的用于调节血液中糖浓度的激素，胰岛素的缺失或非有效利用往往使患者血糖水平升高，如果不有效治疗会引起严重的并发症(如心脏病，中风，糖尿病视网膜病变，肾功能衰竭等)甚至死亡。

[0003] 糖尿病每年直接或间接地引起几百万人死亡。世界卫生组织数据显示，全球有3.47亿糖尿病患者，其中90％是2型糖尿病(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/en/)。中国是糖尿病第一大国，目前发病率为6.7％，高于国际平均水平的6.4％，中国糖尿病高危人群也在扩大，约有1.5亿。中国的糖尿病90％以上为二型糖尿病，防治糖尿病，对于提高我国国民素质有着至关重要的意义。

[0004] 天然的艾塞那肽(Exendin-4)为非洲蜥蜴唾液分泌物，是一种39肽(Eng et al.,1992)，和人类肠促降糖激素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)有53％的同源性，其作用也和GLP-1类似(Alarcon et al.,2006)，且具有与GLP-1几乎完全一致的生物学效应。其与GLP-1的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸(Gly)，使其在血液中不易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ，dipeptidyl peptidase-Ⅳ,)分解，而GLP-1的相同位置则为极易被DPP-Ⅳ切断的丙氨酸(Ala)，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长(t1/2＝9.7h)。Exendin-4是一种强效GLP-
1受体激动剂，能模拟GLP-1这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽(Exenatide)的活性主要通过与人体胰脏GLP-1受体结合而介导，由环腺苷酸(cAMP)依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exendin-4的氨基酸结构及生物活性与GLP-1均具有相关性，故通常也被视为肠促胰岛素的一种。由于Exendin-4的降糖作用时间较长，延缓胃排空和抑制摄食冲动对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物开发的潜力巨大。

[0005] 研究发现，该蛋白质可以降低糖尿病人的血糖浓度，并改善β细胞功能的标记，而不会过度降糖而造成病人血糖浓度过低，在降糖过程中，还伴随着病人体重减轻，从而进一步减轻病人的痛苦。

[0006] GLP-1是由小肠endocrine L细胞分泌，受饮食刺激引起分泌。GLP-1分泌后随血液进入胰脏，并和胰岛β细胞上的受体(GLP-1R)结合，通过cAMP第二信使刺激胰岛素合成和β细胞增殖(Buteau et al.,1999；Stoffers et al.,2000；Furman et al.,2010)。GLP-1同时抑制血糖分泌(Orskov et al.,1988k Komatsu et al.,1989)，延缓胃排空(Wettergren et al.,1993；Willms et al.,1996；Nauck et al.,1997)，抑制食欲(Turton et al.,1996；Flint et al.,1998)，及阻止β细胞死亡(Farilla et al.,2002；Wang et al.,
2004)。但体内GLP-1的存活周期很短(半衰期约2分钟)，很快被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-IV)和其他蛋白酶所分解(Mentlein et al.,1993；Kieffer et al.,1995；Hupe-Sodmann et al.,1995)，因此极大地限制了GLP-1发展成治疗糖尿病药物的可能。

[0007] 艾塞那肽的发现使得二型糖尿病的治疗有了特效的治疗药物。和GLP-1类似，艾塞那肽也通过和GLP-1受体(GLP-1R)的结合( et al.,1993；Mann et al.,2010)，刺激胰岛素的合成(Thorens et al.,1993).但和GLP-1不同的是，艾塞那肽没有DPP-IV的切割位点，因此在体内更稳(Thum et al.,2002；Hupe-Sodmann et al.,1995)。艾塞那肽在体内的半衰期约9.7小时。化学合成的艾塞那肽(Exenatide)在2005年被美国医药局FDA批准作为二型糖尿病的特效药上市(Furman,2012)—美国Lily/Amylin医药公司将人工合成的艾塞那肽在美国市场开发为治疗二型糖尿病的药物并获得FDA批准，于2005年在美国市场上上市，商品名为百泌达(Byetta)。

[0008] 但化学合成的艾塞那肽在市场上价格非常昂贵，使得很多患者负担不起。为生产廉价的艾塞那肽，已有很多利用基因重组通过微生物发酵或转基因植物生产艾塞那肽的研究(Yi等2006，Yin et al.,2005；Kim et al.,2009；Zhou et al.,2008；Kwon et al.,2013；Choi et al.,2014)，并已经取得了很好的效果。

[0009] 但这些艾塞那肽的一个主要缺点是需要注射给药，而且在体内代谢快(半衰期9.7小时)，因此需要经常注射来维持血液血糖水平，给患者带来痛苦及不便。急需研发口服长效型艾塞那肽。

[0010] Kwon等(2013)通过艾塞那肽与霍乱毒素β亚基(CTB)的融合，并利用叶绿体的高效表达(Kwon等2013)生产融合蛋白，该蛋白可以通过CTB与小肠表皮细胞上的GM1受体的结合被吸收。与此类似，Choi等(2014)通过与铁转运蛋白(Tf)的耦合而产生在消化道不易被分解的融合蛋白Ex4-TF，由于在肠道上皮细胞膜上有铁转运蛋白(Tf)的受体，从而通过膜通道系统把该融合蛋白吸收到血液中，起到与血液注射艾赛那肽相似的效果，给药方便，也减轻了患者的痛苦。实验证明该融合蛋白可以：1.促进小鼠胰脏β细胞分泌胰岛素；2.促进β细胞增值；3.促进大鼠β细胞的分化(Choi J1,Diao H,Feng ZC,Lau A,Wang R,Jevnikar AM,Ma S.2014.A fusion protein derived from plants holds promising potential as a new oral therapy for type 2 diabetes.Plant Biotechnol J.12(4):425-35.doi:10.1111/pbi.12149.)。

[0011] 在这些方法中，通过叶绿体转化(Kwon等2013)，转基因烟草叶片表达或瞬间表达(Choi等2014)生产融合蛋白，一个显著的缺点是叶片等新鲜植物组织无法储藏，有时会由于没有及时提取而腐烂，造成浪费，同时也有时会在需要的时候不能及时生产需要的植物材料而影响药物的生产。虽然可以通过组织的冷冻干燥处理，将植物组织保持至15个月(Kwon等2013)，但这些处理会带来额外的费用，增加成本。

[0012] 一个有效的解决办法是通过植物种子生物反应器来生产融合蛋白。利用种子胚乳特异性表达启动子表达融合蛋白，融合蛋白可稳定储藏于种子胚乳蛋白体中。由于农作物种子易储藏，可以在室温下储藏多年，而在冷藏仓库中可以储藏数十年，因此可以做到该蛋白药物的持续性生产，而不会造成浪费及短缺的问题，同时降低生产成本。

[0013] 但现有技术尚不能实现融合蛋白在整个胚乳中大量表达，以前的表达是仅在糊粉层或部分细胞中表达。

发明内容

[0014] 本发明的目的在于提供一种融合蛋白、其生产方法及转基因水稻的生产方法，使得艾塞那肽融合蛋白可以在整个胚乳中大量表达，从而可以通过植物种子进行生产。

[0015] 为此，本发明提出一种融合蛋白，该融合蛋白为植物种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白，其基因序列中包括：植物胚乳特异性表达启动子pGluB-5，植物胚乳储藏蛋白信号肽sp，艾塞那肽多肽Exendin-4，连接Exendin-4和人铁转运蛋白hTF的连接多肽(GGGGS)x3linker，人铁转运蛋白hTF，用于蛋白质纯化的组蛋白标签6xHis，以及植物GluB-5基因转录终止子GluB-5-3’-UTR。

[0016] 本发明还提出一种融合蛋白的生产方法，包括如下步骤：1)以植物密码子优化并合成权利要求1中所述植物种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白基因；2)构建该Ex4-TF融合蛋白胚乳特异性表达的植物双元表达载体；3)将所述Ex4-TF融合蛋白基因导入植物愈伤组织细胞，并通过筛选获得遗传转化植物植株。

[0017] 优选地，所述植物为水稻。

[0018] 本发明还提出一种转基因水稻的生产方法，包括如下步骤：1)设计有利于水稻表达的密码子偏好性；2)设计如权利要求1所述的植物种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白基因的DNA序列，并通过基因合成得到该植物种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白基因；3)通过克隆水稻种子胚乳特异性表达启动子，及水稻储藏蛋白3’-UTR表达终止子，将该植物种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白基因克隆到水稻基因表达框中；4)通过基因转化，获得转基因水稻。

[0019] 本发明利用GluB-5启动子可以实现融合蛋白在整个胚乳中大量表达。GluB-5启动子在水稻种子中表达强，而GluB-5基因的3’-UTR不仅起到表达终止的作用，还可以促进基因的表达。因此，通过使用GluB-5启动子及3’终止子可提高融合蛋白在水稻种子中的表达。

[0020] 同时，水稻具有产量高，容易种植及管理，以及水稻种子耐储存、好提取等优点。

附图说明

[0021] 图1是水稻种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白示意图，其中图1A和1B分别表示融合蛋白中艾塞那肽分别位于融合蛋白的N端和C端。

[0022] 图2A是本发明实施例水稻种子表达艾塞那肽融合蛋白的方案流程图。

[0023] 图2B是本发明实验检测流程图。

[0024] 图3A、3B分别是Ex4-TFa融合蛋白和Ex4-TFb融合蛋白用于水稻表达Ex4-TF融合蛋白的载体pCAMBIA1301-Ex4-TF的T-DNA结构图。

[0025] 图4A、4B分别是转基因水稻植株分化诱导培养基上的再生情况和培养瓶中的再生植株示意图。

[0026] 图5是GUS染色鉴定转基因水稻结果图。WT为野生型水稻愈伤组织，1-6为不同的转基因抗性愈伤组织。

[0027] 图6是PCR鉴定转基因植株结果图。Vector为植物双元表达载体为阳性对照，WT为野生型水稻DNA为阴性对照。

[0028] 图7是Southern Blot鉴定转基因植株艾塞那肽基因为探针进行杂交得到的条带结果图。其中0为野生型水稻DNA为阴性对照，1、8为单拷贝转基因事件；3、7为两个拷贝转基因事件；其他为多拷贝转基因事件。

[0029] 图8为Northern blot分析转基因在水稻种子中的表达，以合成艾塞那肽基因为探针进行杂交分析融合基因的表达结果图。WT为野生型水稻RNA为阴性对照，#1－5为转基因水稻RNA。

[0030] 图9为Western Blot分析融合蛋白基因在转基因水稻种子中的表达，以艾塞那肽抗体进行检测融合蛋白结果图，WT为野生型水稻蛋白为阴性对照。

[0031] 图10为Western Blot分析在转基因水稻种子中表达的融合蛋白的纯化，以艾塞那肽抗体进行检测融合蛋白结果图，#1－7为洗脱过程中各洗脱组分融合蛋白的含量。

具体实施方式

[0032] 本实施例的通过设计有利于水稻表达的密码子偏好性，设计融合蛋白基因的DNA序列，并通过基因合成得到该融合蛋白基因。通过克隆水稻种子胚乳特异性表达启动子，及水稻储藏蛋白3’-UTR表达终止子，将Ex4-TF融合蛋白基因克隆到水稻基因表达框中，通过基因转化，获得转基因水稻，通过Western分析可检测转基因水稻种子中融合蛋白，融合蛋白可稳定储藏于种子胚乳蛋白体中。由于农作物种子易储藏，可以在室温下储藏多年，而在冷藏仓库中可以储藏数十年，因此可以做到该蛋白药物的持续性生产，而不会造成浪费及短缺的问题，同时降低生产成本。

[0033] 如图1A、1B所示为水稻种子胚乳表达Ex4-TF融合蛋白，pGluB-5为水稻胚乳特异性表达启动子，sp为水稻胚乳储藏蛋白信号肽，Exendin-4为艾塞那肽多肽，(GGGGS)x3linker为连接Exendin-4和人铁转运蛋白(hTF)的连接多肽(其DNA序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)，hTF为人铁转运蛋白，6xHis是用于蛋白质纯化的组蛋白标签(其DNA序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)，GluB-5-3’-UTR是水稻GluB-5基因转录终止子。图1A和1B融合蛋白中，艾塞那肽分别位于融合蛋白的N端和C端。

[0034] 如图2A所示，水稻种子特异性表达艾塞那肽融合蛋白包括以下步骤：1.以水稻密码子优化并合成融合蛋白基因；2.构建融合蛋白胚乳特异性表达的植物双元表达载体；3.采用农杆菌介导法将融合蛋白基因导入水稻愈伤组织细胞并通过潮霉素筛选获得遗传转化水稻植株。

[0035] 如图2B所示，本实施例采用GUS染色、PCR、Southern Blot、Northern Blot以及Western Blot方法检测融合蛋白在水稻中的表达。

[0036] 以下对上述各个步骤进行详细说明：

[0037] 以水稻密码子优化并合成艾塞那肽融合蛋白基因：

[0038] 在网站(http://www.idtdna.com/CodonOpt)上以水稻密码子(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝311553)根据融合蛋白基因的氨基酸序列生成其基因的DNA序列(Ex4-TF融合蛋白A和Ex4-TF融合蛋白B)，并提交GenScript公司合成基因片段。其中，Ex4-TF融合蛋白A基因的DNA序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；Ex4-TF融合蛋白B基因的DNA序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

[0039] 水稻胚乳表达启动子及转录终止子的克隆：

[0040] 根据水稻基因组中水稻GluB-5基因的启动子(含该基因信号肽)及转录终止子序列，设计引物，其中，水稻GluB-5启动子的5’引物(SEQ  ID  NO.13)：5’－GAGAAAAGAAGATTTGCTGACCCCA-3’；水稻GluB-5启动子的3’引物(SEQ ID NO.14)：5’-AGCCATAGAACCATGGCAAAGGAG-3’。水稻GluB-5转录终止子的5’引物(SEQ ID NO.15)：5’-TAAACCCAAGGCATTATATACTAAA-3’；水稻GluB-5转录终止子的3’引物(SEQ ID NO.16)：5’-CATGACATGATCCGCTCCTCTCCCT-3’。从水稻日本晴基因组DNA中通过PCR扩增并克隆该序列，并通过基因测序的方法进行验证，其中，水稻GluB-5基因的启动子的DNA序列为SEQ ID NO.5，水稻GluB-5基因信号肽的DNA序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，及水稻GluB-5基因转录终止子的DNA序列为SEQ ID NO.8。(日本晴是水稻基因转化常用品种，转化效率高，其他水稻品种也可以。但优选品种是日本晴。)

[0041] 双元表达载体的构建：

[0042] 体外连接GluB-5基因的启动子(含该基因信号肽)，融合蛋白基因及转录终止子，以质粒CAMBIA1301为骨架(载体是基因转化常用载体，大部分实验室都有)，将融合蛋白基因表达框克隆T-DNA的左右边界(TL为左边界，TR为右边界)之间。并命名为pCAMBIA1301-Ex4-TRa及pCAMBIA1301-Ex4-TRb，其T-DNA结构如图3所示。其含有HptII基因，可以使被转化的水稻细胞抗潮霉素，该基因是由P35S(CaMV35S启动子)启动表达，由T35S(CaMV35S终止子)终止表达。贝伐单抗的轻链基因BLC(Bevacizumab Light Chain)和重链基因BHC(Bevacizumab Heavy Chain)分别表达翻译生成贝伐单抗的轻链和重链，这两个基因都是由PUbi(玉米泛素启动子)启动表达，TNos(胭脂碱合成酶基因终止子)终止表达。此外，该T-DNA区域还含有GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)，被转化的细胞经过组织化学染色后可以呈蓝色，该基因是由P35S(CaMV35S启动子)启动表达，由TNos(胭脂碱合成酶基因终止子)终止表达。

[0043] 图3A、3B是用于水稻表达Ex4-TF融合蛋白的载体pCAMBIA1301-Ex4-TF的T-DNA结构图。LB，RB分别为农杆菌T-DNA的左右边界，GluB-5-3’-UTR，pGluB-5分别为水稻种子储藏蛋白GluB-5的转录终止子及启动子，Ex4-TFa和Ex4-TFb分别为艾塞那肽融合蛋白基因a和b，SP为水稻种子储藏蛋白GluB-5的信号肽，35S Pro为花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，GUS为报告基因，Tnos为农杆菌基因转录终止子。Ex4-TFa融合蛋白:(SP)-(Exendin-4)-(GGGGS)x3-(hTf)-6xHis；Ex4-TFb融合蛋白:SP-6xHis-hTf-(GGGGS)x3-Exendin-4。

[0044] 农杆菌介导的水稻转化:

[0045] 水稻愈伤组织的诱导:将成熟的日本晴种子去壳，用75％的酒精消毒30秒，再用5％次氯酸钠溶液消毒25分钟，无菌水漂洗3～5次，置无菌纸上，在超净工作台上吹干，接种于N6D2愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿接种12～15粒，于28℃暗培养4周，期间切除胚根，每两周继代一次。

[0046] 根癌农杆菌的活化:1)将含融合蛋白基因质粒的农杆菌(EHA105)接种在含有50mg/L的卡纳霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃，转速200转每分钟振荡培养18小时；2)取1ml培养好的农杆菌放在2ml灭菌的离心管中，转速6000转每分钟，离心5分钟收集菌体，用200μl的AAM液体培养基重悬菌体，取10μl菌液接种到50ml含有200μMAS(乙酰丁香酮)的AAM液体培养基中，28℃，转速160转每分钟振荡培养2小时，以备转化之用。

[0047] 农杆菌转化水稻胚性愈伤组织：1)浸染，选取直径为3～5mm的结构致密的愈伤组织颗粒，在制备好的AAM菌液中浸染10min；2)共培养，将浸染后的愈伤组织放在无菌滤纸上吸去组织表面的菌液，转接至共培养基N6D2-Co上，26℃暗培养3天；3)选择培养，将共培养3天的愈伤组织用含有0.01％吐温的无菌水漂洗5次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中漂洗10分钟，将愈伤组织放置无菌滤纸上，在超净工作台上晾干愈伤组织上的水，再转接至选择培养基N6D-Se上，28℃暗培养四周；4)分化培养，将抗性愈伤组织转接至分化培养基MS-Re上，16小时光照，8小时黑暗，28℃培养至分化出绿苗(图4)。将小苗转接至用灭菌瓶装的生根培养基MS-Hf上，培养2周后，洗净小苗根上的培养基转到水中培养3天，然后移栽到大田。

[0048] 图4A、4B为转基因水稻植株分化示意图，4A为分化诱导培养基上的再生情况；4B为培养瓶中的再生植株。

[0049] 其中，水稻组织培养所需培养基说明如下：

[0050] (1)N6D2培养基：3.9g/L Chu’s N6(Chu,1975)(CHP01-50LT，10402809，Caisson,USA)，N6维生素，(2mg/L甘氨酸，0.5mg/L烟酸，1.0mg/L维生素B1，0.5mg/L维生素B6)，0.1g/L肌醇，1.0g/L水解酪蛋白，0.5g/L脯氨酸，0.5g/L谷氨酰胺，2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，30g/L蔗糖，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌20分钟。

[0051] (2)N6D2-Co培养基：N6D2中加入10g/L葡萄糖，1M KOH调节pH5.5，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌10分钟，待培养基冷却到50℃，加入200uM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)。

[0052] (3)N6D2-Se培养基：N6D2培养基冷却到50℃，121℃，220KPa，灭菌20分钟，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素。

[0053] (4)MS-Re培养基：4.6g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，2.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，0.5mg/L萘乙酸NAA)，1.0mg/L激动素(KT)，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素。

[0054] (5)MS-HF培养基：2.3g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，30g/L蔗糖，1M KOH调pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B。

[0055] (6)AAM培养基：0.5g/L水解酪蛋白，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，0.9g/L谷氨酰胺，0.3g/L天冬氨酸，3g/L氯化钾，10mg/L五水硫酸锰，3.0mg/L硼酸，2.0mg/L七水硫酸锌，
0.25mg/L二水钼酸纳，0.025mg/L五水硫酸铜，0.025mg/L六水氯化钴，0.75mg/L碘化钾，
15mg/L二水氯化钙，25mg/L七水硫酸镁，4mg/L乙二胺四乙酸(EDTA)，15mg/L二水磷酸二氢钠，1mg/L烟酸，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1，100mg/L肌醇，176mg/L精氨酸，75mg/L甘[0056] 氨酸，1M KOH调节pH到5.2，0.22uM滤膜过滤除菌。

[0057] 转基因水稻的鉴定

[0058] GUS染色鉴定转基因水稻：转基因小苗叶片剪成2cm的小段置于2mL的离心管中；抗性愈伤组织用镊子分成小块，浸入GUS染色液中(100mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)，内含0.5mg/ml X-GluC、1％Triton X-100、1％DMSO和10mM EDTA)，抽真空15min，37℃保温12h，用85％的乙醇脱色几次，拍照，如图5所示，为GUS染色鉴定转基因水稻实验结果，其中WT为野生型水稻愈伤组织，1-6为不同的转基因抗性愈伤组织。

[0059] PCR鉴定转基因水稻：PCR反应溶液配制为，Premix Ex Taq Hot Start Version(该试剂为TAKARA公司产品，含PCR反应所需要的聚合酶、脱氧核苷酸混合物、缓冲液。在PCR反应时，仅需加入DNA模板及引物就可。其他PCR产品也可以)10μl，基因组DNA500ng，艾塞那肽合成基因的正向和反向引物10μM各1μl，双蒸水定容到20μl。PCR程序为：95℃5分钟，95℃20秒，60℃20秒，72℃1.5分钟，30个循环，72℃5分钟。PCR反应结束后，取5μL反应液电泳检测。

[0060] PCR引物序列为：合成艾塞那肽基因的5’引物(SEQ  ID  NO.17)：5’-CACGGAGAGGGCACTTTCACGTCCG-3’；合成艾塞那肽基因的3’引物(SEQ ID NO.18)：5’-ACTGGGGGGAGGAGCACCGCTTGAC-3’。

[0061] 如图6所示为PCR鉴定转基因植株结果图。Vector为植物双元表达载体为阳性对照，WT为野生型水稻DNA为阴性对照，1-10为不同的转基因水稻株系(所有株系都是含有转基因日本晴，不同在于转基因插入基因组中的位置)。PCR扩增全长DNA为117bp。

[0062] Southern blot鉴定转基因水稻：

[0063] 1)制备地高辛标记的探针：以艾塞那肽合成基因DNAPCR产物为模板，利用引物(合成艾塞那肽基因5’引物：5’-CACGGAGAGGGCACTTTCACGTCCG-3’；合成艾塞那肽基因3’引物5’-ACTGGGGGGAGGAGCACCGCTTGAC-3’)扩增制备地高辛标记的探针。PCR反应溶液为，模板DNA10ng，正反向引物各1μL，Premix Ex Taq Hot Start Version 15μl扩增的最佳反应程序，1μL的DIG-dUTP，双蒸水定容到30μL。PCR扩增反应程序为：95℃5分钟，95℃20秒，60℃20秒，72℃1.5分钟，30个循环，72℃5分钟。PCR反应结束后，取3μL反应液电泳检测。

[0064] 2)转基因水稻总DNA的酶解：转基因水稻叶片总DNA 15ug，用EcoR I进行酶解，37℃反应过夜。每个样品的酶解反应体系为：总DNA15ug，CutSmart缓冲液10μL，100U的EcoR I，双蒸水定容100μL。其中以野生型水稻基因组DNA作为阴性对照，质粒DNA为阳性对照。酶解反应结束后，上样5μL进行电泳检测，纯化，溶解在15μL双蒸水中，4℃备用或-20℃保存。

[0065] 3)酶解产物的电泳：将纯化后的酶解产物上样于1.0％琼脂糖凝胶，以5V/cm电压电泳3小时；拍照，标记分子量的位置；将凝胶放到0.2N盐酸中处理10分钟，用双蒸水漂洗一下；放入变性缓冲液中处理30分钟；放入中和缓冲液中处理30分钟。

[0066] 4)DNA印记到杂交膜：根据琼脂糖凝胶的大小，剪取大小合适的杂交膜，用双蒸水润湿；玻璃板放在托盘上，取1张3M滤纸，用转移缓冲液浸湿，放在玻璃板上，去除滤纸与玻璃板中的气泡。在托盘中加入适量转移缓冲液；将凝胶放在滤纸上，去除凝胶和印迹表面间的气泡；将杂交膜放在凝胶上面，并再次排气泡；将2张3M滤纸(比杂交膜稍大)转移缓冲液湿透后放在杂交膜上；在胶的周围放上一圈保险膜，防止液池中的液体直接流到凝胶上方的纸巾层(即“短路”现象)。在滤纸上放一叠吸水纸，然后压上重约300g的物体，转移过夜；将杂交膜在稀释10倍的转移缓冲液中漂洗一下，置于超净台下晾干，于80℃烘箱烘2小时。

[0067] 5)杂交：将烘烤后的膜用灭菌水润湿卷起，放入杂交管中，加入30ml杂交液，放在42℃预杂交2小时；倒掉预杂交液，再加入10ml新的杂交液于42℃预热；取出已经做好的探针，冰上融化，加入到已经预热的杂交液里，42℃杂交过夜。

[0068] 6)杂交后处理：倒出杂交液，在杂交管中倒入100ml洗脱缓冲液W1，室温下洗脱5分钟，重复一次。倒掉洗脱缓冲液W1，加入100ml洗脱缓冲液W2，于65℃洗脱15分钟，重复一次；取出膜，放入铺有保鲜膜的小平盘中，加入洗脱缓冲液W3，洗脱5分钟；倒掉洗脱缓冲液W3，加入50ml封闭液S1，室温孵育15分钟；倒掉封闭液S1，加入10ml地高辛抗体反应液S2，孵育
15分钟；将膜取出放入另一个盒子，加入100ml洗脱缓冲液W3，室温下洗脱15分钟，重复洗脱一次；加入20mL的检测缓冲液S3，孵育5分钟；倒掉检测缓冲液S3，加入2ml CSPD孵育5分钟；
将膜取出平铺在保鲜膜上，将其包裹起来，放在37℃孵育5分钟。

[0069] 7)显影和定影：将包好的膜放在暗匣子中，在暗房中将X-胶片放在包好的膜上，关闭暗夹，37℃放置30分钟；回暗室中取出胶片，放入显影液中浸泡2分钟，在水中冲一下，再放入定影液浸泡2分钟，在流水中冲洗胶片，取出晾干(图7)。

[0070] 8)Southern blot所需试剂：

[0071] 变性缓冲液：20g/LNaOH，87.75g/L NaCl；中和缓冲液：60.05g/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)，87.75g/L NaCl，37％的浓盐酸调节pH7.2；转移缓冲液(20×SSC)：175.3g/LNaCl，88.2g/L柠檬酸三钠4M盐酸调节pH7.0；洗脱缓冲液W1：2×SSC；0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)(M/V)；洗脱缓冲液W2：0.5×SSC；0.1％SDS；洗脱缓冲液W3：11.607g/L马来酸，8.775g/L NaCl，用固体NaOH调节pH值至7.5，用前加入0.3％吐温20；检测缓冲液S3：12.1g/L Tris，5.85g/LNaCl，调节pH 9.5；杂交液：70g/L SDS，50％甲酰胺，25％20XSSC，2％脱脂奶粉(罗氏)，50ml 1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)，1.0g/L十二烷基肌胺酸钠；封闭液S1：1％脱脂奶粉(M/V)溶解在洗脱缓冲液W3中；地高辛抗体反应液S2：将Anti-Digoxigenin-AP以10000转每分钟离心5分钟，吸取上层溶液以1：10000溶解于封闭液S1。

[0072] 图7为Southern Blot鉴定转基因植株结果图，是艾塞那肽基因为探针进行杂交得到的条带。其中0为野生型水稻DNA为阴性对照，1、8为单拷贝转基因事件；3、7为两个拷贝转基因事件；其他为多拷贝转基因事件。

[0073] Northern blot分析转基因在种子中的表达：

[0074] 1)水稻总RNA的提取：采用QIAGEN RNeasy Mini Kit RNA提取试剂盒提取水稻种子总RNA。

[0075] 2)水稻总RNA质量的检测及定量：取样品1μL上样于0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压大约5min后，紫外灯下观察。定量时，取样品1μL+99μLDEPC H2O，混匀后，在Eppendorfs核酸定量检测仪(Eppendorfs AG22331，Hamburg)上测260nm、280nm处的吸收值，计算出RNA的产量和浓度。

[0076] 3)RNA样品的变性处理：取1μg质粒DNA进行酶解，做阳性对照；取15μgRNA，加入等量的Denaturation Buffer；同时取3μgRNA Marker，40～80pg酶切好的质粒DNA，也分别加入等量的Denaturation Buffer。60℃温育20min，置冰上冷却。

[0077] 4)RNA的甲醛凝胶变性电泳：用透明胶带将胶板的两端封闭，插入胶梳；配胶(1.5％)，在三角烧瓶中加入110mLDEPC-H2O、15mL 10×MOPS电泳缓冲液、2.25g琼脂糖，加热融化，冷却至65℃后，加入25mL 37％的甲醛溶液，倒入胶板，待其凝固；在电泳槽中加入1×MOPS电泳缓冲液，将胶放入电泳槽中；取变性好的样品，加入0.2倍体积的BPB-Solution和1μLEB，混匀点样，70V电压电泳3.5h。

[0078] 5)转膜：将胶放在DEPC-H2O中振荡处理15min；紫外灯下观察，拍照，标记分子量的位置，切胶；其余步骤同Southern Blot。

[0079] 6)Northern blot分析：杂交温度为50℃，洗脱缓冲液W3代替Southern Blot的W2，其余步骤同Southern Blot(图8)。

[0080] 7)缓冲液和试剂的配制：

[0081] 10×MOPS电泳缓冲液：用700mL水溶解41.8g丙磺酸(MOPS)，用2mol/LNaOH调pH值至7.0。加20mL 1mol/L乙酸钠和20mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0)。用水定容到1L。加1mLDEPC处理过夜后过滤灭菌。

[0082] RNA变性缓冲液：取0.8mL 10×MOPS电泳缓冲液，加入2mL甲酰胺，1.3mL37％甲醛，0.04mL 0.5M EDTA，定容到4mL，-20℃保存备用。

[0083] 5×BPB-Solution：溴酚兰(0.2％)；甘油(50％)；1×MOPS。

[0084] 洗脱缓冲液W3溶液：0.1×SSC；0.1％SDS。

[0085] 图8为Northern blot分析转基因在水稻种子中的表达结果图，为以合成艾塞那肽基因为探针进行杂交分析融合基因的表达。WT为野生型水稻RNA为阴性对照，#1-5为转基因水稻RNA，其中转基因株系#5的表达量最高，#1的表达量最低(转基因表达量受基因位置及拷贝数的影响，之间的差异可能反应他们之间的不同，但具体情况并不是本发明的重点，一般选择表达量高的株系即可)。

[0086] Western Blot分析融合蛋白在转基因水稻中的表达:

[0087] 1)样品制备：以转基因水稻种子为材料，在液氮中研磨。称取30mg研磨好的组织加入30ul 2XSDS缓冲液，旋涡振荡，70℃温育10分钟，13000转每分钟离心10分钟，取上清到新的离心管中。

[0088] 2)电泳分离：将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad MiniⅡ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板。按如下体积配制10％分离胶8.0ml，混匀：3.0ml ddH2O；2.1ml 1.0mol/LTris-HCl pH＝8.8；2.8ml 30％Acr-Bis；80ul10％SDS；56ul 10％AP；6ul TEMED。向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20分钟后胶即可聚合。按如下体积配制6％浓缩胶3.0ml，混匀：2.0ml ddH2O；400ul 1.0mol/LTris-HCl pH＝6.8；600ul 30％Acr-Bis；36ul 
10％SDS；24ul 10％AP；4ul TEMED。将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。待胶凝聚后，慢慢拔出样品梳。装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样10μl，100V电泳2小时。

[0089] 3)转膜：卸下胶板，剥离胶，将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将PVDF膜放入甲醇浸泡饱和3-5秒钟放入转移缓冲液中平衡10min。装配转移三明治：从下向上依次为3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸，每层放好后，用试管赶去气泡。插上电极，20V，45分钟。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

[0090] 4)免疫杂交与显色：将膜放入双蒸水中浸泡10分钟，取出放入20ml5％脱脂奶粉的封闭液中室温孵育1小时。加入稀释1000倍的艾塞那肽抗体，4℃缓慢摇动孵育过夜。15ml TBS-T洗3次，每次5min。加入稀释2000倍的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，缓慢摇动室温孵育1小时。15ml TBS-T洗3次，每次5min。蛋白检测按照Thermo Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂盒操作。

[0091] 图9为Western Blot分析融合蛋白基因在转基因水稻种子中的表达结果图，为以艾塞那肽抗体进行检测融合蛋白，WT为野生型水稻蛋白为阴性对照，#1-5为转基因水稻，其中转基因株系#2的表达量最高，#1的表达量最低。(蛋白质的表达不一定和RNA表达一致，对于本研究来讲，蛋白质的表达量更重要，因为我们最终想要的是蛋白质。)

[0092] 图9结果表明，通过水稻密码子优化的基因可以在水稻种子中表达

[0093] 转基因水稻种子中融合蛋白的纯化

[0094] 7.1种子破碎：将水稻种子研磨成粉，用磷酸盐缓冲液(PB)(25mM PB 50mM NaCl，pH7.5)在室温下溶解1小时，然后用乙酸调节pH为5，沉淀2小时，再12000g离心10min取上清。

[0095] 7.2装填层析柱：利用镍离子金属螯合亲和层析介质Ni-NTA琼脂糖装填层析柱，用5-10倍介质体积的缓冲液A(10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，用高浓度NaOHl调节pH值至8.0)平衡亲和柱。

[0096] 7.3过柱：在7.1中上清中加入等体积的2x组蛋白标签蛋白结合缓冲液(5mM咪唑，500mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.9)，上柱。

[0097] 7.4洗柱：用5-10倍柱体积的洗柱液(10mM咪唑，20mM Na2HPO4，500mM NaCl)洗柱，清除未结合的杂质蛋白。

[0098] 7.5洗脱：用10倍体积的洗脱液(500mM咪唑，20mM Na2HPO4，500mM NaCl)洗脱融合蛋白，分别收集各组分洗脱液并通过western进行分析。融合蛋白在7体积洗脱液中可完全洗出。(亲和柱的体积如果是1ml,那么1倍柱体积的洗脱液就是1ml，“7体积”即7个柱体积)[0099] 图10为Western Blot分析在转基因水稻种子中表达的融合蛋白的纯化结果，以艾塞那肽抗体进行检测融合蛋白，#1-7为洗脱过程中各洗脱组分融合蛋白的含量。融合蛋白产物在体积1-7间被洗脱。(实验室纯化用1-5克的植物材料提取，1ml的亲和柱，1-7体积即是1-7ml洗脱液。)

[0100] 图10实验结果说明，通过水稻密码子优化的基因不仅可以在水稻种子中表达，还可以通过亲和层析进行提纯。因此，本发明提供了一种完全可以实施的艾塞那肽融合蛋白通过植物种子进行生产的方法。

[0101] 本发明实施例通过艾塞那肽和铁转运蛋白的融合可以产生稳定的融合蛋白，而且可以通过口服的形式给药，药物在肠道细胞被铁转运蛋白的受体所识别并转运到血液中，从而发挥作用，起到注射艾塞那肽类似的治疗效果。

[0102] 本发明是通过植物种子生物反应器来生产融合蛋白。利用水稻储藏蛋白基因在种子胚乳中特异表达的特点，通过转基因方法，利用水稻储藏蛋白启动子驱动融合蛋白基因在水稻种子中进行特异表达，通过设计有利于水稻表达的密码子偏好性，设计融合蛋白基因的DNA序列，并通过基因合成得到该融合蛋白基因。通过克隆水稻种子胚乳特异性表达启动子，及水稻储藏蛋白3’-UTR表达终止子，将Ex4-TF融合蛋白基因克隆到水稻基因表达框中，通过基因转化，获得转基因水稻，检测转基因水稻种子中融合蛋白，融合蛋白可稳定储藏于种子胚乳蛋白体中。由于农作物种子易生产和储藏，可以在室温下储藏多年，而在冷藏仓库中可以储藏数十年，因此可以做到该蛋白药物的持续性生产，而不会造成浪费及短缺的问题，同时降低生产成本。