一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物、其制备方法及包含该共聚物的两亲性siRNA载体

摘要

本发明提供了一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物、其制备方法及包含该共聚物的两亲性siRNA载体。该制备方法包括，将聚乙二醇丙烯酸酯与多元胺、N,N’‑二(丙烯酰)胱胺通过迈克尔加成反应，制得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。本发明提供一种具有可降解、水溶性好和毒性低，且可用作siRNA载体的两亲性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其在作为核酸类药物载体时，所带的正电荷可以结合负电性siRNA。

权利要求

1.一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备方法，包括，将聚乙二醇丙烯酸酯与多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺通过迈克尔加成反应，制得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物；

其中，所述多元胺选自下列物质中的一种：

2.根据权利要求1所述的方法，其中还包括待所述迈克尔加成反应完成后，加入疏水的伯胺进行端基修饰；所述疏水的伯胺选自C12～C18的脂肪胺或4-苯基丁胺。

3.根据权利要求2所述的方法，所述疏水的伯胺选自十二胺、十八胺或油胺。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺的摩尔比为0.1:1:2。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺、所述疏水的伯胺的摩尔比为0.1:1:2:4。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述聚乙二醇丙烯酸酯的数均分子量为250～

20KDa。

7.根据权利要求2所述的方法，其中包括，

55～65℃下，将N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯，以及所述多元胺在二甲基亚砜溶剂中发生迈克尔加成反应，待反应完成后，向反应体系加入所述疏水的伯胺进行端基封端，然后在酸性溶液中透析，再用二次水透析，冻干得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。

8.一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，由权利要求1至7中任一项所述的方法制得。

9.一种两亲性siRNA载体，包括权利要求2所制得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。

说明书

一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物、其制备方法及包含该共聚物

的两亲性siRNA载体

技术领域

[0001] 本发明涉及一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物及其制备方法，具体为一种可用于两亲性siRNA载体的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着人类基因组计划的完成，人类进入后基因组时代。RNA干扰(RNAi)技术作为一种具有革命性的基因转录后调控的新技术，能快速、简便、有效地以序列特异性方式使目的基因沉默，又由于其特有的高效性和特异性，不仅成为基因功能研究的有力工具，还为特异性基因治疗提供了新的技术手段和应用前景，并日益成为后基因组时代基因功能和调控分析的有力工具。

[0003] 近10年来，在肿瘤、感染和糖尿病等疾病的治疗中RNAi就有可能成为一种新的治疗策略。与其它药物作用相比，基于RNAi治疗策略的适用性更强。而siRNA(小干扰RNA)设计是实现RNAi的有效途径，siRNA序列的优劣将直接影响RNA干扰的效果。目前RNAi的作用原理已经明晰，限制siRNA走向临床应用的关键因素是对siRNA的递送。如何将siRNA高效递送到特定细胞并发挥RNAi效应，同时减少对其它细胞的影响，都是研究者们正在致力解决的重要问题。寻找或设计安全低毒的非病毒载体用于SiRNA的递送成为RNAi治疗研究领域的焦点之一。

发明内容

[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种两亲性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备方法，包括，将聚乙二醇丙烯酸酯与多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺通过迈克尔加成反应，制得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物；其中，所述多元胺选自下列物质中的一种：

[0005]

[0006] 根据本发明的一实施方式，所述制备方法还包括待所述迈克尔加成反应完成后，加入疏水的伯胺进行端基修饰；所述疏水的伯胺选自C12～C18的脂肪胺、四苯基丁胺[0007] 根据本发明的另一实施方式，所述疏水的伯胺选十二胺、十八胺或油胺。

[0008] 根据本发明的另一实施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺的摩尔比为0.1:1:2。

[0009] 根据本发明的另一实施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺、所述疏水的伯胺的摩尔比为0.1:1:2:4。

[0010] 根据本发明的另一实施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺、所述聚乙烯酰亚胺的摩尔比为0.1:1:1.2:2。

[0011] 根据本发明的另一实施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯的数均分子量为250～20KDa。

[0012] 根据本发明的另一实施方式，所述聚乙烯酰亚胺的重均分子量为600～1800。

[0013] 根据本发明的另一实施方式，所述制备方法包括：55～65℃下，将N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯，以及三胺在二甲基亚砜溶剂中发生迈克尔加成反应，待反应完成后，向反应体系加入所述疏水的伯胺或聚乙烯酰亚胺进行端基修饰，然后在酸性溶液中透析，再用二次水透析，冻干得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。

[0014] 本发明还提供了一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，由上述任一项所述的方法制得。

[0015] 本发明进一步提供了一种两亲性siRNA载体，包括上述的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。

[0016] 本发明提供一种具有可降解、水溶性好和毒性低，且可用作siRNA载体的两亲性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其在作为核酸类药物载体时，所带的正电荷可以结合负电性siRNA。

附图说明

[0017] 图1为本发明实施例1的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征谱图；

[0018] 图2为本发明实施例2的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征谱图；

[0019] 图3为本发明实施例3的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征谱图；

[0020] 图4为本发明实施例4的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征谱图；

[0021] 图5为本发明实施例5的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征谱图；

[0022] 图6为本发明应用例1的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物典型的缓冲能力测试图；

[0023] 图7为本发明应用例2的复合物体外毒性的测试图；

[0024] 图8为本发明应用例3的复合物细胞内解离的测试图；

[0025] 图9为本发明应用例4的转染24小时后的共聚焦成像图。

具体实施方式

[0026] 体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。

[0027] 阳离子高分子材料在基因转染研究领域已经得到广泛的应用，如壳聚糖、葡聚糖和聚普鲁兰等。这些物质来自于自然界，因此生物相容性高；同时，它们具有的修饰位点多，易于功能化。

[0028] 本发明制备一种具有可降解、水溶液中可自组装、水溶性好和毒性低，且可用作siRNA载体的两亲性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其在作为核酸类药物载体时，所带的正电荷可以结合负电性siRNA。

[0029] 本发明的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(或月桂酸/聚酰胺胺共聚物)的制备方法包括，将聚乙二醇丙烯酸酯(或月桂酸丙烯酯)与多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺通过迈克尔加成反应，制得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物；所述多元胺的结构可以为：

[0030]

[0031] 其中，n＝2～6；R可以为下列结构中的一种：

[0032]

[0033] 优选地，多元胺选自N-叔丁氧基羰基-2,2′-亚氨基二乙胺、N-(2-羟乙基)-二乙胺、或下列物质中的一种：

[0034]

[0035] 进一步地，聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(或月桂酸/聚酰胺胺共聚物)的制备方法还可包括待迈克尔加成反应完成后，加入疏水的伯胺以进行端基修饰；疏水的伯胺R′-NH2可选自选自C12～C18的脂肪胺或四苯基丁胺

[0036] 优选为十二胺(C12H25-NH2)、十八胺(C18H37-NH2)、或油胺。

[0037] 本发明中，聚乙二醇丙烯酸酯、多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺的摩尔比优选为0.1:1:2；聚乙二醇丙烯酸酯、多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺及疏水的伯胺的摩尔比为0.1:
1:2:4；聚乙二醇丙烯酸酯的数均分子量优选为250～20kDa。

[0038] 本发明一实施方式的超支化两亲性siRNA载体聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备方法如下：

[0039] 以二甲基亚砜为溶剂，N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯(数均分子量为250～20kDa)在60℃下，与多元胺发生加成反应。反应72小时后，将温度降至50℃，然后向反应体系加入含过量的有疏水基团的伯胺进行端基修饰。然后在酸性溶液中透析3次，再用二次水透析1次，冻干得两亲性siRNA载体聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。

[0040] 上述制备路线如下：

[0041]

[0042] 第一步以N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯(重均分子量为5000)和多元胺为原料，以二甲基亚砜为溶剂，在60℃温度下搅拌聚合，历时72小时；第二步，待停止搅拌将反应温度降到50℃，向反应体系中加入十二胺或苯胺以修饰主干上的双键。

[0043] 下面，结合具体实施例对本发明的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备方法做进一步说明。

[0044] 实施例1

[0045] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备

[0046] 取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N,N-二甲基亚二丙基三胺(0.159g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反应瓶中，加入6mL二甲基亚砜溶解，在60℃下加热搅拌。搅拌72h后，向反应体系中加入十二胺(0.736g，4mmol)，并同时将反应温度降到50℃继续搅拌24h。反应结束后，用pH为1的盐酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，冻干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁谱图参见图1，相关数据如下所示：1H NMR(DMSO,ppm)δ＝0.87(t,24H,8CH3)；1.28(m,CH2)；2.15(s,42H,14CH2)；2.82-2.83(t)；3.50(m,CH2)；4.02ppm(t,2H,CH2).Mw＝～10kDa,PDI＝1.22。

[0047] 实施例2

[0048] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备

[0049] 取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N,N-二甲基亚二丙基三胺(0.159g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反应瓶中，加入6mL二甲基亚砜溶解，在60℃下加热搅拌。搅拌72h后，向反应体系中加入4-苯基丁胺(0.596g，4mmol)，并同时将反应温度降到50℃继续搅拌24h。反应结束后，用pH为1的盐酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，冻干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁谱图参见图2，相关数据如下所示：1H NMR(DMSO,ppm)δ＝1.28(t,8H,4CH3)；2.15(s,42H,14CH2)；2.82-2.83(t)；3.50-
3.60(m,2CH2)；4.02ppm(t,2H,CH2)；7.15-7.25(t,20H,CH2).Mw＝～9kDa,PDI＝1.94。

[0050] 实施例3

[0051] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备

[0052] 取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N-(2-羟乙基)-乙二胺(0.118g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反应瓶中，加入6mL二甲基亚砜溶解，在60℃下加热搅拌。搅拌72h后，向反应体系中加入十二胺(0.736g，4mmol)，并同时将反应温度降到50℃继续搅拌24h。反应结束后，用pH为1的盐酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，冻干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁谱图参见图3，相关数据如下所示：1H NMR(DMSO,ppm)δ＝0.87(t,24H,8CH3)；1.24(m,CH2)；3.50-3.60(m,2CH2)；4.02ppm(t,2H,CH2).Mw＝～10kDa,PDI＝1.28。

[0053] 实施例4

[0054] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备

[0055] 取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N-(2-羟乙基)-乙二胺(0.118g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反应瓶中，加入6mL二甲基亚砜溶解，在60℃下加热搅拌。搅拌72h后，向反应体系中加入4-苯基丁胺(0.596g，4mmol)，并同时将反应温度降到50℃继续搅拌24h。反应结束后，用pH为1的盐酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，冻干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁谱图参见图4，相关数据如下所示：1H NMR(DMSO,ppm)δ＝1.38(t,8H,4CH2)；2.36(t,10H,5CH2)；3.50-3.60(m,2CH2)；4.02(t,
2H,CH2)；7.15-7.25(t,20H,CH2).Mw＝～9kDa,PDI＝2.01。

[0056] 实施例5

[0057] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备

[0058] 取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N-叔丁氧羰基-二亚乙基三胺(0.203g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反应瓶中，加入6mL二甲基亚砜溶解，在60℃下加热搅拌。搅拌72h后，向反应体系中加入十二胺(0.736g，4mmol)，并同时将反应温度降到50℃继续搅拌24h。反应结束后，用pH为1的盐酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，冻干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁谱图参见图5，相关数据如下所示：1H NMR(DMSO,ppm)δ＝0.87(t,3H,CH3)；1.24(m,20H,10CH2)；1.42(s,63H,21CH3)；3.50-
3.60(m,2CH2)；4.02(t,2H,CH2).Mn＝8533。

[0059] 在以上实施例1-5中所用来检测各聚合物结构仪器为瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司生产的布鲁克超导傅里叶核磁共振谱仪。

[0060] 实施例6

[0061] 罗丹明B修饰的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制备

[0062] 将罗丹明B-ITC与上述的伯氨基封端的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物进行反应，得到罗丹明B修饰的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(Rh-rHB)。

[0063] 应用例1

[0064] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物缓冲能力的测定

[0065] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的缓冲能力通过酸-碱滴定来测定。具体方法为：取含氨基总量为10mM的实施例1所得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(rHB)与实施例2所得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(nHB)，溶解在各10mL的水中，并用1M的HCl溶液将其pH调节到4。然后用0.1M的NaOH溶液滴定该溶液并记录相应的pH值，每次的滴加体积为20μL，当pH到9终止。共聚物缓冲能力的计算方程：

[0066] B＝d[OH]/dpH

[0067] d[OH]为NaOH的等分试样后的浓度差，dpH是在pH值相应地增加。

[0068] 图6所示的测定结果表明，聚合物具有良好的缓冲能力，当pH的变化范围为5-7.4。这个范围正好涵盖了细胞外环境较高的pH值和细胞内环境较低的pH值。

[0069] 在此测定溶液pH值所使用的仪器为上海标仪仪器有限公司生产的梅特勒pH计。

[0070] 应用例2

[0071] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物在体外的毒性测定

[0072] 共聚物的细胞毒性是评价其作为基因载体的重要参数之一。通过噻唑蓝(化学名：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，简称：MTT)实验研究聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物对BEAS-2B细胞的毒性，并且以聚乙烯亚氨(bPEI，25kDa)作为对照。

[0073] 制备siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的复合物：首先将实施例2所得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(rHB)均匀分散到1×PBS缓冲液中，作为原液。以后使用前轻轻混合聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物原液。然后依据氮磷比为1:0、5:1、10:1、20:1，将实验所用的RNA(抗血管生成素的干扰RNA)分别加入到4组聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的溶液中并漩涡10秒使之完全混合，再在室温下孵育25分钟，备用。PEI(25KDa)/RNA的制备方法与之类似。(氮磷比：聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的总氨基与siRNA的总磷酸基团的比)

[0074] 将BEAS-2B细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板，然后在37℃下培养过夜。用新鲜的培养基换掉原培养基，并加入siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物复合物(w/w 50)和TransIT-TKO以每孔20nM siRNA的浓度，继续培养4h，然后更换新鲜的培养基。经过24h孵育，用含有MTT的培养基替换原培养基，继续孵育3h，然后在490nm波长下，测定其吸收强度，并绘制图表。如图7所示，其中每组测试自左向右依次表示24小时、48小时、72小时的状态，图7的结果显示单纯的共聚物与PEI均具有较高的细胞毒性，这是因为他们具有较强的正电荷。然而当共聚物与siRNA团聚成复合物后，其毒性明显下降，这是由于中和了正电荷并且形成了纳米级的颗粒。正如预期的那样，所有由还原的聚合物和siRNA形成的复合物显示比bPEI与siRNA形成复合物较低的细胞毒性。随着氮磷比从5增加到20，还原性复合物的细胞毒性显得微不足道。所有的还原性复合物表现出的具有极小的毒性在预定的三个时间点。

[0075] 在此测定MTT荧光强度所使用的仪器为美国Perkin Elmer公司生产的多功能酶标仪。

[0076] 应用例3

[0077] 聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物与siRNA复合物的细胞内解离的测定

[0078] 为进一步研究复合物在细胞内的降解，我们选用罗丹明B与CFP分别标记的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物与siRNA，然后通过共聚焦显微镜观察。

[0079] 将BEAS-2B细胞以5×104细胞/孔的密度接种于12孔板，然后在37℃下培养过夜。随后用含有siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物复合物的完全培养基替换12孔板中的原有培养基，随后在37℃下分别孵育1小时和24小时。孵育完成后将12孔板中的培养基弃掉，用PBS洗涤细胞，再用DAPI对细胞核进行染色，然后用PBS洗涤细胞，立刻用共聚焦显微镜进行观察。

[0080] 如图8所示，在1小时和24小时的两个时间点，在复合图片中均可以清楚的观察到分布在BEAS-2B细胞内外的黄色的荧光点，这是由红色荧光与绿色荧光重合引起的。相比于经复合物处理1小时细胞，经复合物处理过24小时的细胞有更多的红色荧光点聚集在细胞质内，这说明更多的siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物复合物被细胞摄取。经过复合物处理过24小时的细胞，可以看到更多的红色荧光散射点后细胞内的，这是因为聚合物的降解并将罗丹明片段释放所引起的。与此同时，绿色荧光的强度显著放大，可能还原触发诱导的细胞内siRNA的释放。因此，释放出siRNA分布到整个细胞质。此外，细胞的形态保持完全类似的在治疗全过程，这进一步验证了siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物复合物具有较低的毒性对于BEAS-2B细胞。

[0081] 此处用于测定各物质荧光信号的仪器为激光共聚焦(confocal)显微镜细胞实时成像系统,(尼康荧光显微镜+UltraVIEW VoX共聚焦单元)。

[0082] 应用例4

[0083] siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的复合物对CEM细胞的转染的测定[0084] 制备siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物复合物：聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(实施例1所得)被重新分散到1×PBS的PBS缓冲液中作为转染原液。使用前轻轻混合聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物原液，后将聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物与OptiMEM混合10秒钟为一个旋涡，并且在室温下孵育10分钟。然后将Cy3标记的siRNA(Cy3+siRNA)加到聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的混合溶液中并漩涡10秒使之混合均匀，再在室温下孵育25分钟。然后将siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的复合物(100uL)加到每一孔中含有300uL细胞完全培养基。然后通过前后轻轻的摇晃瓶中混合。(氮磷比：聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的总氨基与siRNA的总磷酸基团的比；Cy3：一种橙红色的荧光染料)

[0085] 将CEM细胞以每孔4×105的密度种于24孔板中，加300uL完全培养基。随后分别向每孔加入100uL复合物溶液，在不需要更换培养基的情况下于37℃下培养24小时。然后收集细胞，并用1×PBS缓冲液清洗。然后将细胞重新分散到PBS缓冲液中，用FACS分析。

[0086]  转染效率 细胞活性
  Cy3(+)(％) DAPI(-)(％)
仅CEM细胞 0.0 96.61
仅Cy3-siRNA(50nM) 14.0 98.42
仅共聚物(氮磷比为20) 0.0 99.13
共聚物+Cy3-siRNA(氮磷比为5) 34.8 98.80
共聚物+Cy3-siRNA(氮磷比为10) 17.9 98.20
共聚物+Cy3-siRNA(氮磷比为20) 68.4 99.14

[0087] 经过48小时的转染，我们清楚的观察到复合物(氮磷比为20)表现出良好的转染效率(＞60％)，且此条件下观察不到明显的细胞毒性。(<2％死细胞)。

[0088] 此处用测定各物质荧光信号的仪器为激光共聚焦(confocal)显微镜细胞实时成像系统,(尼康荧光显微镜+UltraVIEW VoX共聚焦单元)。

[0089] 除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

[0090] 本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。