一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种α‑葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳；(b)将步骤(a)得到的发酵乳灭菌，离心取上清，超滤取低分子部分，冷冻干燥，得到α‑葡萄糖苷酶抑制剂。上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以脱脂乳作为培养基进行发酵，并经过灭菌，离心，超滤，冷冻干燥，制备得到α‑葡萄糖苷酶抑制剂，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α‑葡萄糖苷酶抑制剂的新用途，拓宽了α‑葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳所制备的α‑葡萄糖苷酶抑制剂的活性显著，稳定性好。

权利要求

1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳；

(b)将步骤(a)得到的发酵乳灭菌，离心取上清，超滤取分子量不大于10,000Da的部分，冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106～1x107cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6～12％。

4.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。

5.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵的温度为20℃～35℃。

6.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵的时间为3～12h。

7.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述离心的速度为8,000～12,000g，离心的时间为5～10分钟。

说明书

一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法。此外，本发明还涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂。

背景技术

[0002] 近年来，糖尿病在全世界广泛流行，目前已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大类严重危害人类健康的慢性疾病。随着我国经济、社会的迅速发展，膳食结构和生活方式的改变，人口老龄化速度的加快，糖尿病的患病率也呈现快速增加的趋势。在糖尿病患病率快速上升的同时，我国糖尿病的知晓率、治疗率及控制率明显偏低。糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对经济社会发展产生越来越严重的影响。

[0003] 根据发病机制不同，糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型)，后者约占糖尿病总数的85％以上。迄今为止，治疗II型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为：(1)促胰岛素分泌剂；(2)胰岛素增敏剂；(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)。由于α-GI具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，因此得到越来越多国内外研究者的青睐。

[0004] 研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)可有效地降低糖尿病人的餐后高血糖，作为口服降糖药的一种，其发生作用的场所位于小肠，作用方式是抑制小肠体内的α-葡萄糖苷酶活性，从而达到降低餐后高血糖的目的。如果使用者饮食中碳水化合物占50％以上，则降糖效果更为明显，因此其适用于以碳水化合物为主食的人群，尤其是中老年糖尿病患者。

[0005] 目前所发现的α-GI虽能克服传统降糖药的一些缺点，但其来源相对狭窄，主要集中于放线菌，导致α-葡萄糖苷酶抑制剂来源不足，这是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

[0006] 基于上述技术问题，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂制备的新方法，以牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333为发酵菌株，以脱脂乳作为培养基，发酵制得α-葡萄糖苷酶抑制剂。

[0007] 具体的，一方面，提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳；(b)将步骤(a)得到的发酵乳灭菌，离心取上清，超滤取分子量不大于10,000Da的部分，冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。

[0008] 进一步地，上述步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106～1x107cfu/mL。

[0009] 进一步地，上述步骤(a)中，脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6～12％。

[0010] 进一步地，上述步骤(a)中，发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。

[0011] 进一步地，上述步骤(a)中，发酵的温度为20℃～35℃。

[0012] 进一步地，上述步骤(a)中，发酵的时间为3～12h。

[0013] 进一步地，上述步骤(b)中，离心的速度为8,000～12,000g，离心的时间为5～10分钟。

[0014] 另一方面，还提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，由上述任一种制备方法制得。

[0015] 进一步地，上述α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤55mg/mL。

[0016] 上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以脱脂乳作为培养基进行发酵，并经过灭菌，离心，超滤，冷冻干燥，制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途，拓宽了α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳所制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性显著，稳定性好。

具体实施方式

[0017] 为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：

[0018] 在一个具体的实施方式中，提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于脱脂乳中进行发酵，得到发酵乳；(b)将步骤(a)得到的发酵乳灭菌，离心取上清，超滤取分子量不大于10,000Da的部分，冷冻干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。

[0019] 上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333，以脱脂乳作为培养基进行发酵，并经过灭菌，离心，超滤，冷冻干燥，制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵脱脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途，拓宽了α-葡萄糖苷酶抑制剂的来源。同时，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳所制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性显著，稳定性好。

[0020] 此外，上述技术方案中的制备方法极大简化了生产步骤，避免了传统复杂工艺可能带来的污染问题；其次，整个制备过程不涉及任何有机溶剂，因此从根本上杜绝了有机溶剂残留的问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用牛类芽孢杆菌这一种单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。

[0021] 进一步地，步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.25x106～1x107cfu/mL；较佳地为2.5x106～7.5x106cfu/mL，更佳地为5x106cfu/mL。

[0022] 进一步地，上述步骤(a)中，脱脂乳可以是新鲜的脱脂乳，也可以是配制而成的脱脂乳。优选的为配制的脱脂乳，配制的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为6～12％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入脱脂乳粉，混匀充分溶解后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。

[0023] 进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵温度为20℃～35℃；较佳地为25℃～35℃；更佳地为30℃。

[0024] 进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵时间为3～12h；较佳地为6～12小时；更佳地为6小时。

[0025] 进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵方式为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；较佳地为150～250rpm；更佳地为200rpm。

[0026] 结合实施例和比较例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵脱脂乳，再经过灭菌、离心、超滤和冷冻干燥后得到的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果明显下降。而在优选范围之内，接种量、脱脂乳浓度、发酵温度和时间相互影响，使得牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性更佳。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性低于优选的接种量范围；当接种量过多时，一定时间后菌种个体因生存空间及营养的限制而死亡或停滞生长，不利于代谢物的积累，也使得最终获得的α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性低于优选的接种量范围。又例如，当发酵温度低于优选范围值时，菌种代谢缓慢，会导致α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性有所降低。还例如，发酵的振荡速度低于优选范围时，菌种发酵的溶氧量不够，生产和代谢受到限制，导致α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性降低。

[0027] 进一步地，上述步骤(b)中，超滤的截留分子量为1,000～10,000Da；较佳地为1,000～5,000Da，更佳地为1,000Da。

[0028] 结合实施例及对比例1亦可知，在优选的截留分子量之外时，α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果明显下降。

[0029] 进一步地，上述步骤(b)中，灭菌的温度较佳地为95℃～125℃，更佳地为98～110℃，最优地为100℃；灭菌的时间为5～20分钟，更佳地为10～18分钟，最优地为15分钟。

[0030] 进一步地，上述步骤(b)中，离心的速度较佳地为8,000～12,000g，更佳地为10000～11000g；离心的时间较佳地为5～10分钟，更佳地为6～8分钟。

[0031] 进一步地，上述步骤(b)中，上述的冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。

[0032] 在另一个具体的实施方式中，提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，由上述的任一种制备方法制得。

[0033] 上述制备方法具备上述有益效果，因此，由上述制备方法所制得的α-葡萄糖苷酶抑制剂也具备相应的有益效果，此处不再赘述。

[0034] 进一步的，上述α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50≤55mg/mL。结合实施例亦可知，上述α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性显著高于其他常规脱脂乳发酵菌株。

[0035] 下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。

[0036] 实施例1

[0037] 1、材料与方法

[0038] (a)种子(发酵菌种)的制备：将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333(该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为2.5x108cfu/mL。

[0039] (b)脱脂乳的制备：将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。

[0040] (c)待测样品制备：将α-葡萄糖苷酶抑制剂溶解于无菌水中，pH调节至6.80，，再4℃、10,000rpm离心10min，取上清，pH调节至6.80，再次4℃、10,000rpm离心10min，取得的上清即可用于α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测。

[0041] α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测：取100μL待测样品于1.5mL EP(Eppendorf)管，接着加入50μLα-葡萄糖苷酶(100mU/mL，sigma，美国)，混匀，37℃温育15min，然后加入80μL 2mM的PNPG(sigma，美国)，混匀，37℃反应15min，最后加入80μL 0.2M的Na2CO3终止反应，再4℃、10,000rpm离心2min，取200μL上清于96孔微孔板(Greinerbio-one，德国)，在405nm波长下用Spectra Max M5多功能酶标仪(MolecularDevices,美国)测定吸光度值。待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性如以下公式所示：

[0042]

[0043] 其中：阴性对照组为空白脱脂乳替代待测样品；

[0044] 阴性空白组为0.1M、pH＝6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)替代阴性对照组中的α-葡萄糖苷酶；

[0045] 样品空白组为PBS替代待测样品组中的α-葡萄糖苷酶。

[0046] α-葡萄糖苷酶半抑制率浓度IC50的测定：以倍半稀释的方法将待测样品溶液进行稀释，获得不同浓度的待测样品组，利用上述检测方法测定不同浓度的待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，根据浓度与α-葡萄糖苷酶抑制率构成的线性关系计算得出样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度(IC50)。

[0047] 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备

[0048] 将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量2％(v/v)无菌接种于10％(w/w)脱脂乳，30℃、200rpm培养6小时得发酵乳。

[0049] 将发酵乳95℃灭菌20min，8,000g离心10min取上清，超滤(Mwco＝1,000Da)(超滤设备Pellicon 0.1M2及超滤膜都购买自密理博公司，下同)取低分子量部分，冷冻干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品A。

[0050] 3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

[0051] 将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品A以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品A对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝42mg/mL。

[0052] 实施例2

[0053] 1、材料与方法

[0054] (a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

[0055] (b)脱脂乳的制备：将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。

[0056] (c)待测样品制备：同实施例1。

[0057] 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备

[0058] 将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量0.5％(v/v)无菌接种于12％(w/w)脱脂乳，35℃、100rpm培养12小时得发酵乳。

[0059] 将发酵乳125℃灭菌5min，10,000g离心8min取上清，超滤(Mwco＝5,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品B。

[0060] 3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

[0061] 将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品B以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品B对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝49mg/mL。

[0062] 实施例3

[0063] 1、材料与方法

[0064] (a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

[0065] (b)脱脂乳的制备：将质量百分比为6％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。

[0066] (c)待测样品制备：同实施例1。

[0067] 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备

[0068] 将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量4％(v/v)无菌接种于6％(w/w)脱脂乳，20℃、300rpm培养3小时得发酵乳。

[0069] 将发酵乳120℃灭菌10min，12,000g离心5min取上清，超滤(Mwco＝10,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品C。

[0070] 3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

[0071] 将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品C以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品C对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝55mg/mL。

[0072] 实施例4

[0073] 1、材料与方法

[0074] (a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

[0075] (b)脱脂乳的制备：将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。

[0076] (c)待测样品制备：同实施例1。

[0077] 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备

[0078] 将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3％(v/v)无菌接种于8％(w/w)脱脂乳，25℃、250rpm培养5小时得发酵乳。

[0079] 将发酵乳100℃灭菌15min，10,000g离心6min取上清，超滤(Mwco＝1,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品D。

[0080] 3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

[0081] 将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品D以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品D对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝46mg/mL。

[0082] 实施例5

[0083] 1、材料与方法

[0084] (a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

[0085] (b)脱脂乳的制备：将质量百分比为9％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得所需浓度的脱脂乳。

[0086] (c)待测样品制备：同实施例1。

[0087] 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备

[0088] 将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1％(v/v)无菌接种于9％(w/w)脱脂乳，28℃、150rpm培养9小时得发酵乳。

[0089] 将发酵乳115℃灭菌12min，11,000g离心8min取上清，超滤(Mwco＝5,000Da)取低分子量部分，冷冻干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制剂产品E。

[0090] 3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

[0091] 将α-葡萄糖苷酶抑制剂产品E以上述方法制备为待测样品后测定其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果表明该产品E对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50＝50mg/mL。

[0092] 效果实施例1冷藏条件下α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制效果的稳定性

[0093] 将实施例1-5制备的产品A、B、C、D和E分别装入密封袋后，置于冷藏条件(8℃)保存0、10、20和30天后取出，分别测定各样品对α-葡萄糖苷酶的半抑制率浓度IC50值，结果如表
1所示。

[0094] 表1冷藏条件下α-葡萄糖苷酶抑制剂产品抑制效果的稳定性

[0095]

[0096] 由表1可知，所有测试的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品在冷藏(8℃)保存30天后，对α-葡萄糖苷酶抑制活性稳定保持在同一水平，稳定性较好。

[0097] 对比例1

[0098] 将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度以及超滤截留分子量逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品，各组所得α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果如表2所示。

[0099] 表2不同方法制备所得α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果

[0100]

[0101]

[0102] 从表2所示的结果中可以得出，将所述α-葡萄糖苷酶抑制剂产品的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度，发酵时间、发酵振荡的速度以及超滤截留分子量调整到优选范围之外的时候，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333依然可以发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂，但是产物的α-葡萄糖苷酶抑制效果明显下降。

[0103] 对比例2

[0104] 参考实施例1所述方法，比较由牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，具体操作如下：

[0105] 1、材料与方法

[0106] (a)种子(发酵菌种)的制备：

[0107] 干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。

[0108] 嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLM17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。

[0109] (b)脱脂乳的制备：同实施例1。

[0110] (c)待测样品制备：同实施例1。

[0111] 2、α-葡萄糖苷酶抑制剂产品的制备

[0112] 将各菌株以2％(v/v)接种量无菌接种于10％(w/w)脱脂乳，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，牛类芽孢杆菌30℃、200rpm振荡培养)6h，获得相应的发酵乳。

[0113] 将上述发酵乳按照实施例1中所述方法进行灭菌，离心，超滤，冷冻干燥，制备得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。

[0114] 3、α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的测定

[0115] 上述不同菌株制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果如表3所示：

[0116] 表3不同菌株制备的α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制效果

[0117]

[0118] 由表3可知，其他常规发酵菌株不具有发酵脱脂乳产生α-葡萄糖苷酶抑制剂的能力，而牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333可以发酵脱脂乳，最后得到α-葡萄糖苷酶抑制剂，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性非常显著。

[0119] 以上对本发明所提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。