一种猪支气管波氏杆菌菌株

摘要

本发明的目的提供一株猪支气管波氏杆菌YBB01株菌株，保藏编号为CCTCC M 2016606。本发明的猪支气管波氏杆菌YBB01株菌株对猪的毒力强、免疫原性好，并具有较好的交叉保护性。其制备的疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效。

权利要求

1.一种猪支气管败血波氏杆菌，其特征在于，所述的猪支气管败血波氏杆菌为猪支气管波氏杆菌YBB01株；其保藏编号为CCTCC M 2016606。

2.权利要求1所述的猪支气管败血波氏杆菌在制备疫苗中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。

4.权利要求1所述的猪支气管败血波氏杆菌在制备具有免疫源性的蛋白中的应用。

说明书

一种猪支气管波氏杆菌菌株

技术领域

[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪支气管波氏杆菌菌株。

背景技术

[0002] 猪支气管败血波氏杆菌病,又称波氏菌病,是一种重要的猪呼吸道系统疾病,以各种急慢性的呼吸道病症为特征,极易引起其它病原菌的混合和继发感染,全世界多数养猪业发达的国家均有此病发生,给养殖业带来了严重的经济损失。猪波氏杆菌病在全世界分布广泛,在欧洲、美国、加拿大、日本的感染率都很高,全世界已经有30％-50％的猪群受到波氏杆菌的感染。我国对猪波氏杆菌进行的流行学调查显示,我国多个省份和地区爆发严重,感染率高达61.1％。随着集约化程度的不断提高,对养猪业的危害也日趋严重。因此，就需要注射疫苗进行防治该病的爆发。

[0003] 但目前采取给动物注射疫苗以防控病菌传染的方法会导致病菌发生新的变异，致使疫苗失效；而且，自然界中突变的病菌也会导致现有的疫苗的免疫效果下降。因此，筛选新的抗原微生物就成为疫苗制备领域中的研究热点之一。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种猪支气管波氏杆菌菌株，从而为猪支气管波氏杆菌疫苗制备提供新的免疫源，从而弥补现有技术的不足。

[0005] 本发明所提供猪支气管败血波氏杆菌YBB01株(Bordetella bronchiseptica YBB01)，于2016年11月1日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016606。

[0006] 本发明的猪支气管波氏杆菌YBB01株用于制备疫苗；

[0007] 所述的疫苗，优选为灭活疫苗；

[0008] 本发明所筛选的YBB01株还可以用来制备具有免疫源性的蛋白，其制备的蛋白用于制备亚单位疫苗。

[0009] 本发明筛选的猪支气管波氏杆菌YBB01株的毒力强高、免疫原性好并具有较好的交叉保护性。其制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，YBB01株产生抗体快，重要的是免疫后能够抵御流行株的保护。

具体实施方式

[0010] 申请人筛选获得了一株猪支气管波氏杆菌YBB01株，从而促成了本发明。

[0011] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

[0012] 实施例1：猪支气管波氏杆菌YBB01株的筛选

[0013] 1.流行病学调查自2013年以来，发明人对猪支气管败血波氏杆菌的流行病学进行调查，并对部分猪场进行跟踪调查。调查结果发现，猪支气管败血波氏杆菌目前已在我国猪场广泛存在。

[0014] 2.细菌分离采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料，接种TSA培养基，于5％CO2条件下，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，进行培养并鉴定。

[0015] 3.细菌鉴定

[0016] 3.1形态观察取疑似菌落，涂片后革兰氏染色镜检，观察其细菌形态。

[0017] 3.2生化特性鉴定对可疑菌落进行葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇、卫矛醇、氧化酶、脲酶、硝酸盐还原、柠檬酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、谷氨酸脱羧酶、枸橼酸、明胶、甲基红、VP、吲哚半固体等生化试验，于37℃培养24～48h，观察结果。

[0018] 3.3PCR鉴定将上述初步鉴定的细菌进一步用PCR方法确定。用接种环取少许被检菌落于100μL无菌PBS,混匀,取1μL菌悬液作PCR模板。根据波氏杆菌fla基因(NO.AF232939)序列设计引物,P1:5′-GCTCCCAAGAGAGAAAGGCT-3′,P2:5′-GGTGGCGCCTGCCCTATC-3′,扩增片段大小为235bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0019] 4.毒力试验将分离的10株猪支气管波氏杆菌分别滴鼻注射8～10周龄健康易感仔9
猪各5头，3.0ml/头(活菌量均约为4.0×10CFU)，另取5头不攻毒作为对照。连续观察14日，记录试验猪的发病及死亡情况。试验结果表明，YBB01株毒力最强，5头仔猪发病，其中4头死亡。

[0020] 5.免疫原性根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBB01株菌株菌液分别调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射3～5周龄仔猪，2.0ml/头，每组5头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪采血并分离血清，使用间接血凝方法测定血清的抗体效价；并用本菌株进行滴鼻注射攻毒(活菌量均约为4.0×109CFU)。观察试验猪的发病及死亡情况。抗体检测结果表明，免疫组5/5均大于等于1:16,对照组5/5均小于等于1:4；攻毒保护结果表明，免疫组5/5保护,对照组5/5发病。

[0021] 6.交叉攻毒保护根据毒力试验结果，将YBB01株分离菌株菌液调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，颈部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(4.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。试验结果表明，免疫组仔猪均未发病或死亡，均5/5保护；而对照组仔猪，均
4/5-5/5发病。表明YBB01株所制备的猪支气管波氏杆菌灭活疫苗能抵御YBB01株及各地方分离株的攻击而起到保护作用。

[0022] 实施例2：猪支气管波氏杆菌YBB01株抗原的制备

[0023] 1.菌液培养采用发酵罐对YBB01株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和1％～3％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养8小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过24小时。

[0024] 2.灭活根据活菌计数结果，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，稀释至4.0×109CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。

[0025] 3.半成品检验

[0026] 3.1纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。

[0027] 3.2活菌计数按现行《中国兽药典》附录进行计数。

[0028] 3.3灭活检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。

[0029] 实施例3：疫苗的制备

[0030] 1水相配制检验合格的YBB01株抗原。

[0031] 2油相MONTANIDETM ISA 201VG佐剂(以下简称201佐剂)。

[0032] 3乳化水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟。

[0033] 3分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

[0034] 4成品检验

[0035] 4.1性状

[0036] 外观乳白色乳剂。

[0037] 剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。

[0038] 稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不大于0.5ml。

[0039] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

[0040] 4.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

[0041] 4.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

[0042] 4.4安全检验用3～5周龄健康易感仔猪5头，每头颈部肌肉注射疫苗4.0ml，观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。

[0043] 4.5效力检验

[0044] 4.5.1血清学方法取3～5周龄健康易感仔猪10头，其中5头颈部肌肉注射疫苗2.0ml/头，其余5头作非免疫对照。一次免疫后21日，按相同剂量和相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日对所有仔猪采血并分离血清，检测间接血凝抗体效价。免疫组5头仔猪的抗体效价均应≥1:16，对照组5头仔猪抗体效价均应≤1:4。

[0045] 4.5.2免疫攻毒法用3～5周龄健康易感仔猪10头，随机分为A、B两组，每组5头，其中A组为免疫组，均颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头，B组为非免疫对照组，均颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同方法和相同剂量进行二次免疫，二次免疫后14日9
进行攻毒。A、B组试验猪滴鼻注射YBB01株菌液3.0ml(活菌量约为4.0×10 CFU/头)。观察14日，免疫组猪均应至少4头保护，对照组猪均应至少4头发病。

[0046] 实施例4：免疫交叉保护试验

[0047] 用YBB01株制备的灭活疫苗，颈部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有免疫仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(4.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。攻毒后，免疫组仔猪均未发病或死亡，均5/5保护；而对照组仔猪，均4/5-5/5发病。表明YBB01株所制备的猪支气管波氏杆菌灭活疫苗能抵御YBB01株及各地方分离株的攻击而起到保护作用。详细结果见表1。

[0048] 而且，发明人用各地方分离株制备疫苗，免疫仔猪后，再用本发明筛选的YBB01株进行攻毒实验；结果表明其它分离株疫苗的免疫效果远低于本发明YBB01株制成的灭活疫苗的效果。因此YBB01株可作为猪波氏杆菌病灭活疫苗的候选菌株。

[0049] 表1：YBB01株疫苗对不同菌株的免疫交叉保护试验结果

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