一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针

摘要

本发明提供了一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针。该方法包括以下步骤：(1)设计引物和探针：P53上下游引物序列和P53探针序列分别见SEQ ID No:1、2和3；Claudin‑4上下游引物序列和Claudin‑4探针序列分别见SEQ ID No:4、5和6；(2)提取胰腺组织总RNA；(3)RNA浓度及纯度鉴定；(4)去除DNA；(5)real‑time PCR。通过设计特异性引物和探针，优化多重PCR条件，建立利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，该方法特异性好，灵敏度高，结果数据可靠，重复性强，与单个检测相比，可节约成本和时间。

权利要求

1.一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的试剂，其特征在于，由以下物质组成：用于检测基因Claudin－4和P53的引物、内参、探针、PCR反应体系；18sRNA作为定量内参；用于检测基因Claudin－4和P53的引物序列、内参引物序列、探针序列如下：P53 Forward primer：5’－CAAAAGTCTAGAGCCACC－3’；

P53 Reverse primer：5’－AATGTTTCCTGACTCAGAG－3’；

P53 probe：5’FAM－TCTGACTGCGGCTCCTCC－3’DABCYL；

Claudin－4 Forward primer：5’－GCCAGCAACTACGTGTAA－3’；

Claudin－4 Reverse primer：5’－CTCAGTCCAGGGAAGAAC－3’；

Claudin－4 probe：5’HEX－ACGGCTCCACTCTGTTCCTC－3’DABCYL；

18sRNA Forward primer：5’－GCAGCTAGGAATAATGGA－3’；

18sRNA Reverse primer：5’－GAATTTCACCTCTAGCGGCG－3’；

18sRNA probe：5’CY5－CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC－3’BHQ2；

PCR反应体系为20μL，包括P53上下游引物各0.4μL、P53probe 0.3μL、Claudin－4上下游引物各0.4μL、Claudin－4 probe 0.3μL、18sRNA上下游引物各0.3μL、18sRNA probe0.2μL、DNA模板3μL，去离子水补至20μL。

2.利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的引物组，其特征在于，该引物组序列为：P53 Forward primer：5’－CAAAAGTCTAGAGCCACC－3’和P53 Reverse primer：5’－AATGTTTCCTGACTCAGAG－3’和Claudin－4Forwardprimer：5’－GCCAGCAACTACGTGTAA－3’和Claudin－4Reverse primer：5’－CTCAGTCCAGGGAAGAAC－3’。

3.利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的探针，其特征在于，该探针序列为：P53 probe：5’FAM–TCTGACTGCGGCTCCTCC－3’DABCYL和Claudin－4 probe：5’HEX－ACGGCTCCACTCTGTTCCTC－3’DABCYL。

说明书

一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测

用引物和探针

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤标记物的检测方法技术领域，具体涉及一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针。

背景技术

[0002] 胰腺癌是一种高度恶化的消化系统肿瘤，临床表现无特异性，虽然近20年来医疗技术有了很大提高，但在诊断和治疗胰腺癌方面仍存在很多问题：早期的确诊率不高，手术死亡率较高，治愈率很低，我国胰腺癌的发病率位于常见肿瘤的第10位，致死率位居第4位。虽然胰腺癌患者的血清中含有较多的肿瘤标记物，如CAl9-9和CA242，以及癌胚抗原(CEA)等，但是现阶段血清学肿瘤标记物检测的灵敏度及特异性尚未尽如人意，故临床急需有效的联合检测以提高胰腺癌早期诊断率，改善整体治疗效果。胰腺癌基因肿瘤标记物可作为血清学肿瘤标记物的有效补充。

[0003] 上皮细胞间紧密连接骨架蛋白(Claudin)是细胞间紧密连接蛋白的主要结构之一，其表达具有组织特异性，在维持细胞急性和紧密连接屏障功能方面起着重要作用。紧密连接蛋白(Claudin)属于跨膜紧密连接蛋白，两个相邻的Claudin相互作用构成了细胞间的连接骨架，其完整性的破坏可引起细胞问黏附的丢失和肿瘤的扩散转移。有研究者发现Claudin中的主要成员Claudin-4在PanIN、原发性PDAC和侵袭性PDAC中高表达，而在正常胰腺导管上皮中低表达。还有一些研究者发现Claudin-4在癌组织中表达的阳性率明显高于胰腺正常组织，与胰腺炎相比，其表达与胰腺癌显著相关。有研究者使用4992个人类基因cDNA微阵列分析胰腺肿瘤，发现Claudin-4等基因上调，这为胰腺癌的早期诊断和良恶性胰腺病变的鉴别提供了可能。

[0004] P53是肿瘤抑制基因，P53突变后细胞容易带着受损的DNA进入S期，使细胞遗传不稳定而产生突变和染色体畸变，导致细胞恶性变。有报导称50％～60％胰腺癌中存在突变型P53的过表达。胰腺癌关系最密切的抑癌基因为P53基因，约60％～80％的胰腺侵袭性肿瘤中发现该基因的失活，抑制细胞的凋亡并导致细胞的过度生长，且该基因在慢性胰腺炎中通常为阴性。P53突变在胰腺癌的发生过程中是具有高度特异性的肿瘤标志物。

[0005] 多重PCR即是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂盒操作过程与一般PCR相同。但由于多重PCR实验设计较一般PCR设计难度更大，除了需要考虑到引物与模板的特异性结合，还需要考虑引物与引物之间、引物与探针、产物与产物等之间的碱基配对结合，故其引物序列的设计是成功的关键，除此之外，为保证每个基因都得到有效的扩增，必须反复优化实验条件，包括反应体系及反应条件。

[0006] 目前，未见利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物Claudin-4、P53和18sRNA的方法的报导。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针，可简便、快捷的检测胰腺癌肿瘤标记物。

[0008] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0009] 一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，包括以下步骤：

[0010] (1)设计引物和探针：根据检测基因Claudin-4和P53，选择18sRNA作为定量内参，使用Beacon Designer 7软件设计引物和探针序列；

[0011] P53Forward primer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQ ID No:1)；

[0012] P53Reverse primer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQ ID No:2)；

[0013] P53probe：5’FAM-TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQ ID No:3)；

[0014] Claudin-4Forward primer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQ ID No:4)；

[0015] Claudin-4Reverse primer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQ ID No:5)；

[0016] Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQ ID No:6)；

[0017] 18sRNA Forward primer：5’-GCAGCTAGGAATAATGGA-3’(SEQ ID No:7)；

[0018] 18sRNA Reverse primer：5’-GAATTTCACCTCTAGCGGCG-3’(SEQ ID No:8)；

[0019] 18sRNA probe：5’CY5-CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC-3’BHQ2(SEQ ID No:9)；

[0020] (2)提取胰腺组织总RNA，此处用试剂盒mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(AM1561，Ambion)进行操作，具体过程如下：采用液氮研磨的方式破碎胰腺组织，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混匀，得裂解体系，然后加入1/10倍裂解体系体积的miRNA Homogenate Additive，冰上裂解10min，最后加入与裂解后溶液等体积的酚氯仿异戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接着于13500r/min离心5min，转移上清至新管，再加入1/3上清液体积的无水乙醇沉淀两次后过柱纯化得总RNA；

[0021] (3)RNA浓度及纯度鉴定：用酶标仪测定RNA浓度，15％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳鉴定RNA完整性；

[0022] (4)去除DNA以及合成cDNA，此处用试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Code No.RR047A，TakaRa)进行操作，具体操作如下：总RNA经gDNA Eraser处理去除基因组DNA，采用Random primer和Oligo dT Primer混合的RT Primer作为反转录引物，加入1.5μg总RNA，反应程序依次为37℃，15min，85℃，5s，具体过程按照PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书进行操作；

[0023] (5)real-time PCR，此处用试剂盒SsoAdvancedTM Universal Probes Super mix(bio-rad，1725282)进行操作，具体操作如下：根据步骤(1)中设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。

[0024] 进一步地，步骤(5)中荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括P53上下游引物各0.4μL、P53probe 0.3μL、Claudin-4上下游引物各0.4μL、Claudin-4probe 0.3μL、18sRNA上下游引物各0.3μL、18sRNA probe 0.2μL、DNA模板3μL，去离子水补至20μL。

[0025] 进一步地，步骤(5)中荧光定量PCR检测的扩增程序为扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性5s，61℃退火30s，共40个循环。

[0026] 利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的2种引物，该2种引物序列分别为：

[0027] P53Forward primer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQ ID No:1)；

[0028] P53Reverse primer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQ ID No:2)；

[0029] Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQ ID No:4)；

[0030] Claudin-4Reverse primer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQ ID No:5)。

[0031] 利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的2种探针，该2种探针序列分别为：

[0032] P53probe：5’FAM–TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQ ID No:3)；

[0033] Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQ ID No:6)。

[0034] 本发明提供的利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法及检测用引物和探针，具有以下有益效果：

[0035] 本发明提供的检测方法，采集一个标本便可同时进行Claudin-4、P53与内参18sRNA检测，采用探针法检测，本发明设计的引物和探针，特异性好，灵敏度高，结果数据可靠，重复性强，与单个检测相比，可节约成本和时间。

附图说明

[0036] 图1为胰腺组织总RNA电泳图；

[0037] 图2为多重PCR扩增曲线图；

[0038] 图3为多重PCR产物的电泳图；

[0039] 图4为CY5标记的18sRNA扩增效率图；

[0040] 图5为HEX标记的Claudin-4扩增效率图；

[0041] 图6为FAM标记的P53扩增效率图；

[0042] 图7为不同样本的Claudin-4相对表达量统计图；

[0043] 图8为不同样本的P53相对表达量统计图。

具体实施方式

[0044] 实施例1

[0045] 1、一种利用多重PCR检测多种胰腺癌肿瘤标记物的方法，包括以下步骤：

[0046] (1)根据检测基因Claudin-4(NCBI Reference Sequence:NM_001305.4)和P53(NCBI Reference Sequence:NM_001126112.2)，选择18sRNA(NCBI Reference Sequence:NR_003286.2)作为定量内参，使用Beacon Designer 7软件设计引物和探针序列；

[0047] P53Forward primer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQ ID No:1)；

[0048] P53Reverse primer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQ ID No:2)；

[0049] P53probe：5’FAM-TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQ ID No:3)；

[0050] Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQ ID No:4)；

[0051] Claudin-4Reverse primer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQ ID No:5)；

[0052] Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQ ID No:6)；

[0053] 18sRNAForward primer：5’-GCAGCTAGGAATAATGGA-3’(SEQ ID No:7)；

[0054] 18sRNA Reverse primer：5’-GAATTTCACCTCTAGCGGCG-3’(SEQ ID No:8)；

[0055] 18sRNA probe：5’CY5-CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC-3’BHQ2(SEQ ID No:9)；

[0056] (2)提取胰腺组织总RNA，此处用试剂盒mirVanaTMmiRNA Isolation Kit (AM1561，Ambion)进行操作，具体过程如下：采用液氮研磨的方式破碎胰腺组织，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混匀，得裂解体系，然后加入1/10倍裂解体系体积的miRNA Homogenate Additive，冰上裂解10min，再加入与裂解后溶液等体积的酚氯仿异戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接着于13500r/min离心5min，转移上清至新管，再加入1/3上清液体积的无水乙醇沉淀两次后过柱纯化得总RNA；

[0057] (3)RNA浓度及纯度鉴定：用Thermo Nano Drop 2000全波长酶标仪测定RNA浓度，15％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳鉴定RNA完整性，Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system成像；

[0058] (4)DNA去除与cDNA合成，此处用试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Code No.RR047A，TakaRa)进行操作，具体操作如下：总RNA经gDNA Eraser处理去除基因组DNA，采用Random primer和Oligo dT Primer混合的RT Primer作为反转录引物，加入1.5μg总RNA进行反应，反应程序依次为37℃，15min；85℃，5s；具体过程参照Prime TMScript  RT reagent Kit说明书；

[0059] (5)real-time PCR，此处用试剂盒SsoAdvancedTM Universal Probes Super mix(bio-rad，1725282)进行操作，具体操作如下：在Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪中进行扩增反应，用软件CFX Manager进行结果分析，扩增反应体系共20μL，具体成分见表1，扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性5s，61℃退火30s，共40个循环；

[0060] 表1real-time PCR扩增反应体系

[0061]

[0062] (6)多重PCR扩增效率检测

[0063] 取步骤(5)中多重PCR产物作为DNA模板，将其稀释10000倍作为初始浓度，然后再对初始浓度按10倍依次稀释5个梯度，每个梯度取3μL作为模板，按照步骤(5)中PCR体系及程序进行扩增反应，并用软件CFX Manager计算多重PCR扩增效率。

[0064] 2、结果

[0065] (1)胰腺组织总RNA浓度及纯度检测

[0066] 所提取的总RNA浓度在133-1273μg/μL，A260/A280比值在1.8～2.1之间，随机挑取5个样本进行琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system成像，RNA完整性良好，总RNA电泳图见图1。

[0067] 由图1可知，胰腺组织总RNA完整性较好，条带清晰无拖尾，可见28srRNA、18srRNA、5s rRNA三条带。

[0068] (2)多重PCR扩增曲线

[0069] 多重PCR扩增曲线见图2，其中，a为CY5标记的18sRNA的扩增曲线；b为HEX标记的Claudin-4的扩增曲线；c为FAM标记的P53的扩增曲线。由图2可知，随着荧光信号值不断积累增长，扩增曲线分背景信号器、对数增长期、平台期、NTC(no templet control)未出现扩增，数据可靠。

[0070] (3)对多重PCR产物进行电泳分析

[0071] 随机选取多重PCR产物，每种产物分别取10μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system成像，电泳结果见图3。

[0072] 由图3可知，每个样品均呈现3条条带，条带大小分别为70bp、150bp和200bp，由此可知，本发明设计的引物扩增产物，检测基因PCR扩增产物的大小与之相符，结果可靠。

[0073] 虽然从左边数第一个样品有一条条带不清晰，这是因为此样品对应的P53表达量比较低的原因，但此条带还是存在的。

[0074] (4)多重PCR扩增效率

[0075] 多重PCR扩增效率见图4-图6；其中，图4为CY5标记的18sRNA扩增效率图；图5为HEX标记的Claudin-4扩增效率图；图6为FAM标记的P53扩增效率图。

[0076] 图4中标准曲线线性R2＝0.995，扩增效率为91.8％，符合PCR扩增检测的要求。

[0077] 图5中标准曲线线性R2＝0.995，扩增效率为95.9％，符合PCR扩增检测的要求。

[0078] 图6中标准曲线线性R2＝0.996，扩增效率为90.7％，符合PCR扩增检测的要求。

[0079] 实验例

[0080] 根据2-△△CT法定量分析胰腺癌组织10例，胰腺癌远端正常组织10例，慢性胰腺炎组织7例的Claudin-4相对表达量，具体结果见表2和图7；P53相对表达量，具体结果见表3和图8。

[0081] 表2组织样本的Claudin-4相对表达量

[0082]样本编号 样本类型 Claudin-4相对表达量
1 Normal 0.53687
2 Normal 0.29032
3 Normal 0.50518
4 Normal 0.58400
5 Normal 1.08933
6 Normal 0.09421
7 Normal 0.21821
8 Normal 1.00749
9 Normal 0.53306
10 Normal 0.35515
11 chronic pancreatitis 0.18553
12 chronic pancreatitis 0.25406
13 chronic pancreatitis 0.36738
14 chronic pancreatitis 0.46622
15 chronic pancreatitis 0.61180
16 chronic pancreatitis 1.42901
17 chronic pancreatitis 0.35316
18 pancreatic cancer 10.58925
19 pancreatic cancer 6.11063
20 pancreatic cancer 1.14307
21 pancreatic cancer 1.37943
22 pancreatic cancer 0.84009
23 pancreatic cancer 2.84331
24 pancreatic cancer 0.58412
25 pancreatic cancer 1.06556
26 pancreatic cancer 2.00049
27 pancreatic cancer 1.23103

[0083] 图7为Claudin-4表达量统计结果，其中cancer为10例胰腺癌组织Claudin-4的相对表达量，normal为10例胰腺癌远端正常组织Claudin-4的相对表达量，cp为7例慢性胰腺炎组织Claudin-4的相对表达量，经多重t检验分析，结果表明胰腺癌组织Claudin-4的表达量远远高于另外两组(P<0.05)。

[0084] 表3组织样本的P53相对表达量

[0085]

[0086]

[0087] 表3为组织样本的P53相对表达量，图8为P53表达量统计结果。

[0088] 由表3和图8可知，胰腺癌组织的P53相对表达量均值为1.61832，胰腺癌远端正常组织的P53相对表达量均值为0.75167，慢性胰腺炎组织的P53相对表达量均值为0.59902，胰腺癌远端正常组织的P53相对表达量与慢性胰腺炎组织的P53相对表达量无明显差异。胰腺癌组织19号、20号、21号、25号、27号样本表达量高出平均水平，排除这几种样品，胰腺癌组表达量为0.82246，与正常和慢性胰腺炎组无明显差异。虽然P53的失活主要体现在基因的点突变，与其表达量关系不大。但这几个样品表达量比较高，很可能存在P53突变，导致P53蛋白水平过表达，成为导致肿瘤发生的重要因素之一，需要结合测序结果进行综合分析。