环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的引物及方法转让专利
申请号 : CN201611077019.1
文献号 : CN106520977B
文献日 : 2019-08-27
发明人 : 兰成忠 , 阮宏椿 , 姚锦爱 , 吴玮
申请人 : 福建省农业科学院植物保护研究所
摘要 :
本发明公开了一种环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的引物及方法，所述引物包括一组外引物F3/B3和一组内引物FIP/BIP，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO.1‑4所示。所述方法包括：提取待测样品DNA；以DNA为模板，采用所述的引物进行LAMP等温扩增；在LAMP扩增产物中加入荧光染料进行显色，观察LAMP扩增产物的颜色，对产物进行分析，判断是否存在苜蓿根腐病菌。所述的引物及其快速LAMP检测方法可在生产实践中对苜蓿根腐病菌进行快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，并且操作简便易行，为苜蓿根腐病的防治提供可靠的技术和理论依据。
权利要求 :
1. 一种环介导恒温扩增法检测苜蓿根腐病菌的引物，其特征在于，包括一组外引物F3/B3和一组内引物FIP/BIP，所述引物序列如下： F3: 5’- CACCAAA CCCTCTTGGCG-3’，B3:
5’- GGCGACATACCAATGACGG-3’，FIP: 5’- TTACCG AGCTCAGCGGCTTC-CGCATCACGTGGTTCACA-
3’，BIP: 5’- TGGGTCCTTG ACAAGCTCAAGG-GGGAGTCTCGAACTTCCAGA- 3’。
2.一种环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的方法，其特征在于，包括：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；
（3）LAMP反应条件：64℃温育60 min；
（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在苜蓿根腐病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在苜蓿根腐病菌。
3. 根据权利要求2中所述的一种环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的方法，其特征在于，步骤（2）所述的LAMP反应混合液由以下组分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，
20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。
4.如权利要求1所述的引物在苜蓿根腐病的早期诊断和病菌的监测、鉴定上的应用。
说明书 :
环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的引物及方法
技术领域
[0001] 本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及苜蓿根腐病菌的环介导等温扩增（LAMP）检测引物及其快速检测方法，可用于苜蓿根腐病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于苜蓿根腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
背景技术
[0002] 苜蓿（Medicago sativa）为豆科苜蓿属多年生草本植物，是世界和我国最主要的优良豆科牧草，被誉为“牧草之王”。苜蓿产量高，蛋白质含量高，适口性好，而且根系发达，具有生物固氮能力，有利于其他植物的生长和水土保持，在发展畜牧业生产、改善生态环境等方面发挥着不可替代的作用。目前苜蓿栽培面积已占我国多年生牧草的30%以上，占全部牧草的25%，随着苜蓿新品种的不断引进，栽培技术、水肥水平的不断提高，苜蓿根腐病的发生也日趋严重，苜蓿根腐病是苜蓿生产上一种毁灭性的真菌土传病害，常导致苜蓿产量大幅下降、品质降低，田间发病率一般达5%～7%，重病地达15%～21%，更严重的发病率达92%，严重影响苜蓿的广泛应用，给苜蓿生产构成一定威胁，成为限制苜蓿产业开发和生态建设的主要因素之一。
[0003] 国内外学者对于苜蓿根腐病的病原进行了大量的研究，目前为止，引起该病的病原菌大致有以下几种：苜蓿疫霉菌（Phytophthora megasperma）、镰刀菌属真菌（Fusarium spp.）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和腐霉属卵菌（Pythoum spp.）等。苜蓿根腐病病原菌较为复杂，但多与镰刀菌有关，其中茄镰刀菌（Fusarium solani）为优势病原菌之一。本研究以苜蓿根腐病菌---茄镰刀菌为研究对象，建立该病原菌的快速检测、鉴定技术，为苜蓿根腐病的准确诊断和及时防治提供技术支持和理论依据。
[0004] 病害的准确诊断是病害防控的基础，长期以来，真菌分类和鉴定的经典方法是依据真菌的形态学和解剖学表型特征及生境特点来进行。运用形态学进行鉴定，方法简单易行，不需要昂贵的仪器，但需要有病征或获得真菌的纯培养，更要有丰富的鉴定经验和足够的文献资料。以形态结构为基础的分类系统在一定程度上受人为因素的干扰，而且真菌的形态和解剖结构复杂多变，获得其有性或无性器官需较长时间，有些种类真菌不易甚至不能形成有性繁殖结构，形态相似的种和变种难以区分；有些真菌形态变异大，分类、鉴定的依据不太稳定；有些真菌形态特征很难进行定量描述，容易造成误差，这些因素给分类鉴定带来诸多不便，以至于病原菌传统的形态学和解剖学分类、鉴定方法不能满足病害快速、准确鉴定、诊断的需求。
[0005] 随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为病原菌的分类鉴定提供了技术条件。如血清学免疫学技术、常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等技术为病原菌的分类鉴定提供了灵敏度高、快速的检测技术。但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR 等，PCR技术检测时间较长，需要依赖贵重、精密的PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员，因而提高了检测成本，并限制了其应用范围，不利于基层生产上推广应用，限制了这些先进方法的推广应用。
[0006] 环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃ 65~℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109 1010个拷贝数。由于~
LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低，LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于苜蓿根腐病菌的LAMP检测国内外均未见报道。
LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低，LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于苜蓿根腐病菌的LAMP检测国内外均未见报道。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供环介导等温扩增法检测苜蓿根腐病菌的引物及方法，针对现有技术中对苜蓿根腐病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了苜蓿根腐病菌新的分子检测方法，对苜蓿根腐病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。
[0008] 实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：
[0009] 1. 苜蓿根腐病菌LAMP检测特异性引物组合物的设计：通过测定苜蓿根腐病菌（Fusarium solani）和其它镰孢菌（Fusarium spp）的translation elongation factor 1-alpha gene(EF-1alpha)基因序列，对镰刀属及其它病原菌不同种间EF-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套苜蓿根腐病菌特异性LAMP引物组，由1对外引物F3/B3和1对内引物FIP/BIP组成，其引物序列如下：F3: 5’- CACCAAACCCTCTTGGCG-3’，B3: 5’- GGCGACATACCAATGACGG-3’，FIP: 5’- TTACCGAGCTCAGCGGCTTC-CGC ATCACGTGGTTCACA-3’，BIP: 5’- TGGGTCCTTGACAAGCTCAAGG-GGGAG TCTCGAACTTCCAGA- 3’。
[0010] 2. 苜蓿根腐病菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：
[0011] （1）提取待测样品基因组DNA。
[0012] 用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30 60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） ~
溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
[0013] 用于检测植物组织中存在苜蓿根腐病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；
[0014] 用于检测土壤样品中存在苜蓿根腐病菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。
[0015] （2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】
12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；
12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；
[0016] （3）LAMP反应条件：64℃温育60 min；
[0017] （4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在苜蓿根腐病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在苜蓿根腐病菌。
[0018] 本发明的有益效果：本发明建立了苜蓿根腐病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中苜蓿根腐病菌的检测，或用于苜蓿根腐病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。
[0019] 本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
[0020] 1、特异性强、结果可靠：靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区( Internal transcribed space ,ITS )，然而许多学者认为该靶标不能够很明确的区分镰孢属真菌及尖孢镰孢菌不同专化型。发明人以普通PCR技术检测苜蓿根腐病菌的研究中发现EF-1alpha基因序列在Fusarium种内及尖孢镰孢菌不同专化型不同菌株间具有一定的保守性，种间存在丰富的变化，是相比rDNA‐ITS、β‐tubulin序列更好的分子检测靶标。本发明分析了苜蓿根腐病菌EF-1alpha基因和其他镰孢菌在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的LAMP引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明利用所设计出的LAMP引物基础上建立了苜蓿根腐病菌LAMP检测方法，苜蓿根腐病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明LAMP检测方法特异性强，结果可靠。
[0021] 2、灵敏度高：本发明对苜蓿根腐病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性；
[0022] 3、快速：应用本发明检测方法，可在1～1.5h 得到检测结果，而以往的PCR或巢式PCR检测需4～6h才可得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速；
[0023] 4、应用性好：本发明LMAP扩增反应在一个温度下扩增，不需要昂贵的PCR扩增仪，便于基层推广使用；
[0024] 5、检测结果直观，肉眼可判断：本发明扩增产物可通过加显色剂进行染色，绿色为阳性，即待测样品中含苜蓿根腐病菌，橙色为阴性，说明待测样品中不含苜蓿根腐病菌，肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像。
附图说明
[0025] 图1 为本发明苜蓿根腐病菌的LAMP特异性检测。1-3为苜蓿根腐病菌，4-5分别为黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病、燕麦镰刀菌，6为阴性对照，1-3号显示绿色荧光。
[0026] 图2 为本发明苜蓿根腐病菌LAMP检测灵敏性。1-9模板DNA浓度分别为1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，10为阴性对照，1-6号显示绿色荧光。
[0027] 图3 为本发明检测方法对发病植株和带菌土壤中苜蓿根腐病菌的检测。1为阳性对照，2为阴性对照，3为发病根部组织，4为健康根部组织，5为发病茎杆组织，6为健康茎杆组织，7为发病根部土壤，8为高压灭菌土壤， 1、3、5、7号显示绿色荧光。
具体实施方式
[0028] 以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
[0029] 实施例 1：苜蓿根腐病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物的设计及引物特异性验证
[0030] 1.供试菌株基因组DNA的提取
[0031] 采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30 60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得~
到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。
[0032] 表1 供试菌株
[0033]
[0034]
[0035]
[0036] 2.苜蓿根腐病菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物的设计
[0037] 通过测定苜蓿根腐病菌（Fusarium solani）和其它镰孢菌（Fusarium spp）的translation elongation factor 1-alpha gene(EF-1alpha)基因序列，对镰刀属及其它病原菌不同种间EF-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套苜蓿根腐病菌特异性LAMP引物，由1对外引物F3/B3和1对内引物FIP/BIP组成，其引物序列如下：F3: 5’- CACCAAACCCTCTTGGCG-3’，B3: 5’- GGCGACATACCAATGACGG-3’，FIP: 5’- TTACCGAGCTCAGCGGCTTC-CGC ATCACGTGGTTCACA-3’，BIP: 5’- TGGGTCCTTGACAAGCTCAAGG-GGGAG TCTCGAACTTCCAGA- 3’。
[0038] 3. 苜蓿根腐病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证
[0039] 以表1供试菌株的DNA为模板，利用外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在苜蓿根腐病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在苜蓿根腐病菌。
[0040] 4.引物特异性验证结果
[0041] LAMP扩增结果表明，供试的苜蓿根腐病菌显色结果可观察到绿色荧光，其余镰刀菌和真菌显色结果为橙色（附图1），说明所设计的苜蓿根腐病菌外引物F3/B3和内引物FIP/BIP可以将苜蓿根腐病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于苜蓿根腐病菌快速可靠的检测和鉴定。
[0042] 实施例2：苜蓿根腐病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定
[0043] 1.不同浓度基因组DNA的制备
[0044] 用无菌超纯水对苜蓿根腐病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。
[0045] 2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察
[0046] 以不同浓度的苜蓿根腐病菌基因组DNA为模板，利用外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM(NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。
[0047] 3. LAMP扩增灵敏度检测结果
[0048] LAMP扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的苜蓿根腐病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色，说明所设计的苜蓿根腐病菌外引物F3/B3和内引物FIP/BIP通过LAMP扩增，对苜蓿根腐病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（附图2）。
[0049] 实施例3：发病组织中苜蓿根腐病菌的LAMP检测
[0050] 样品采集：从陕西、甘肃、宁夏采集苜蓿根腐病发病症状典型的根部、茎杆（离地表4-6cm处）及健康根部和茎杆带回实验室备用；
[0051] 植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。
[0052] 扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4， 1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。
[0053] 检测结果：检测结果（附图3）表明，苜蓿根腐发病的黄瓜根、茎部通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在苜蓿根腐病菌，而健康根、茎及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在苜蓿根腐病菌，该套技术能用于植物组织中苜蓿根腐病菌的快速分子检测。
[0054] 实施例4：带菌土壤中苜蓿根腐病菌的LAMP检测
[0055] 样品采集：从陕西、甘肃、宁夏苜蓿根腐病发病严重的田块采集植株根部土壤带回实验室备用，以高压灭菌的土壤为对照；
[0056] 土壤DNA提取：采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。
[0057] 扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外引物F3/B3和内引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH4)2SO4，20 mM KCl，16 mM MgSO4， 1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。
[0058] 检测结果：检测结果（附图3）表明，苜蓿根腐病发病严重田块土壤DNA通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在苜蓿根腐病菌，而高压灭菌土壤及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在苜蓿根腐病菌，该套技术可用于土壤中苜蓿根腐病菌的快速分子检测。
[0059] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。