基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法

摘要

本发明公开了一种基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法，包括以下步骤：1、盐酸克伦特罗在酸性条件下加入亚硝酸钠溶液，进行重氮化反应；2、加入不同浓度双酚A，再加入稀氨水，再加入二次水稀释；3、步骤2反应液在410nm处有一可见吸收峰；用分光光度法检测双酚A；4、步骤2反应液在305nm有强的荧光发射，比同浓度的双酚A荧光信号增加3.2倍。该方法比同浓度的双酚A的吸光度、荧光信号增加了数倍，提高了荧光法与分光光度法检测双酚A的灵敏度；该方法简单、快捷、选择性好，可用于水环境中双酚A的检测，避免了有机溶剂的使用。

权利要求

1.基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法，包括以下步骤：

步骤1：盐酸克伦特罗在酸性条件下加入亚硝酸钠溶液，振荡，在0～5℃温度下进行重氮化反应；

步骤2：向步骤1溶液加入不同浓度双酚A，再加入稀氨水，再加入二次水稀释；

步骤3-1：步骤2反应液呈黄色，在410nm处有一可见吸收峰，区别于双酚A及盐酸克伦特罗在紫外可见范围内的吸收峰，且信号明显增强；且步骤2反应液吸光度与双酚A的浓度具有呈线性关系的范围，用分光光度法检测双酚A；

步骤3-2：步骤2反应液在305nm有强的荧光发射，比同浓度的双酚A荧光信号增加3.2倍，且步骤2反应液荧光信号的强度与双酚A的浓度有呈线性关系的范围，用于双酚A的荧光法测定。

2.根据权利要求1所述的基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法，其特征在于：步骤1中所述亚硝酸钠溶液的质量浓度为0.2mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法，其特征在于：最佳实验条件下，盐酸克伦特罗的浓度为3.0mg/L，亚硝酸钠为4.0mg/L，NH3·H2O为

160.0mg/L；荧光法测定双酚A的线性范围是5.0μg/L～2.5mg/L。

说明书

基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及环境内分泌干扰物质双酚A的检测方法，具体涉及荧光及分光光谱法应用，属于分析检测技术领域。

背景技术

[0002] 近几年流行病学研究发现激素类疾病(如：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及睾丸癌)的发病率有显著增长。科学家已证实：生殖内分泌相关肿瘤的发生可能与外环境中存在的内分泌干扰物有关。环境内分泌干扰物质是指能够引起生物体或其后代内分泌功能紊乱的任何外源物质。这类物质广泛存在于河流、土壤、大气及农产品中。它们可以通过食品、水、空气等进入机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢。

[0003] 环境内分泌干扰物质对人类及动物内分泌系统具有潜在的干扰作用，极其微量便会影响人类以及动物体的内分泌系统，产生负面作用，而且这种危害是长期甚至多代的。因而近些年来环境内分泌干扰物质受到世界各国环境科学家的重视，相关研究已成为生态环境科学的前沿课题。

[0004] 双酚A—酚类内分泌干扰物的一种，是一种人工合成的世界上使用最广泛的化合物之一，在日常生活中生产量大、应用广泛、在环境中普遍存在以及有明显的生殖激素效应，可通过直接接触迁移至食物中也可能扩散到水和空气中，通过各种途径摄入机体，会对原代和子代生殖系统和发育以及对脑和神经系统、免疫系统、内分泌系统等产生不良影响，能致癌、致畸、致突变等。由于许多双酚A的检测方法繁琐耗时，不便推广，而双酚A对人们造成的影响日益显著，因此建立简便、快速、高效的检测方法并研究双酚A对动物和人体健康的影响具有重要意义。

[0005] 中国专利CN103743715A采用同步荧光光谱结合偏最小二乘法检测双酚A。该方法避免了色谱及色谱－质谱联用持术等双酚A检测方法所用仪器昂贵、操作繁琐、复杂、费时等缺点，还提高了选择性。与常规的荧光分析法相比，使双酚A同步荧光光谱谱带变窄，且避免了苯酚等的干扰，但该方法的检测灵敏度仍受到双酚A本身的荧光信号强度较弱的限制。

发明内容

[0006] 针对现有技术中双酚A检测方法存在的上述问题，本发明提供一种能够提高荧光、分光光度法及以紫外、荧光为检测器的液相色谱法的灵敏度的基于重氮偶联反应的双酚A的检测方法。该方法比同浓度的双酚A的吸光度、荧光信号增加了数倍，提高了荧光法与分光光度法检测双酚A的灵敏度；该方法简单、快捷、选择性好，可用于水环境中双酚A的检测，避免了有机溶剂的使用。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1：盐酸克伦特罗在酸性条件下加入亚硝酸钠溶液，振荡，在0～5℃温度下进行重氮化反应；

[0010] 步骤2：向步骤1溶液加入不同浓度双酚A，再加入稀氨水，再加入二次水稀释；

[0011] 步骤3：步骤2反应液呈黄色，在410nm处有一可见吸收峰，区别于双酚A及盐酸克伦特罗在紫外可见范围内的吸收峰，且信号明显增强；且步骤2反应液吸光度与双酚A的浓度具有呈线性关系的范围，用分光光度法检测双酚A；

[0012] 步骤4：步骤2反应液在305nm有强的荧光发射，比同浓度的双酚A荧光信号增加3.2倍，且步骤2反应液荧光信号的强度与双酚A的浓度有呈线性关系的范围，用于双酚A的荧光法测定。

[0013] 进一步，步骤1中所述亚硝酸钠溶液的质量浓度为0.2mg/mL。

[0014] 进一步，最佳实验条件下，盐酸克伦特罗的浓度为3.0mg/L，亚硝酸钠为4.0mg/L，NH3·H2O为160.0mg/L；荧光法测定双酚A的线性范围是5.0μg/L～2.5mg/L。

[0015] 本发明的有益效果如下：

[0016] (1)利用盐酸克伦特罗重氮化物与双酚A的偶联反应，偶联产物在305nm处具有强的荧光发射信号且性能稳定，建立了双酚A的荧光检测新方法，可靠性高。

[0017] (2)偶联反应产物的可见吸收峰与双酚A的紫外吸收信号相比，波长红移且信号强度增敏约4倍，用可见分光光度计在410nm处光度法测定双酚A，检测信号在可见区，简化了检测仪器，降低了检测成本，且可以提高其分光光度法检测的灵敏度。

[0018] (3)该偶联显色具有反应前后溶液颜色的变化，可用于双酚A的半定量比色法测定。为发展快速、比色、试纸检测确定了基础。

[0019] (4)对氨基苯磺酸的重氮化物是常用的与酚类偶联显物的物质，但双酚A不能与对氨基苯磺酸的重氮化物发生反应，而与盐酸克伦特罗重氮化物的偶联反应条件温和，反应便捷快速。

[0020] (5)基于重氮偶联反应的水环境中双酚A的检测方法在水相进行，避免了有机溶剂的使用，荧光及分光光度法检测灵敏度得到提高，污染减小。

[0021] (6)同是内分泌干扰物的烷基酚类无干扰，方法的选择性好。

附图说明

[0022] 图1是盐酸克伦特罗、双酚A及偶联反应后产物的紫外－可见光光谱图；

[0023] 图2是同浓度的双酚A及偶联反应后产物的荧光光谱图。

具体实施方式

[0024] 本发明基于重氮偶联反应的水环境中双酚A检测方法，利用盐酸克伦特罗与亚硝酸钠生成重氮盐然后与双酚A发生偶联反应，偶联产物的最大吸收波长在可见光区，产物的吸光度及荧光强度明显增强。本发明的步骤如下：

[0025] ①利用盐酸克伦特罗在酸性条件下加入亚硝酸钠溶液适量，振荡，在0～5℃温度下进行重氮化反应。

[0026] ②向步骤①溶液加不同浓度双酚A，加入一定量的稀氨水，再加二次水稀释。

[0027] ③步骤②反应液呈黄色，在410nm左右有一可见吸收峰，区别于双酚A及盐酸克伦特罗在紫外可见范围内的吸收峰，且信号明显增强。且步骤②反应液吸光度与双酚A的浓度在一定范围内呈线性关系，可用分光光度法检测双酚A。

[0028] ④步骤②反应液在305nm有强的荧光发射，比同浓度的双酚A荧光信号增加3.2倍，且步骤②反应液荧光信号的强度与双酚A的浓度在一定范围内呈线性关系，用于双酚A的荧光法测定。

[0029] 最佳实验条件下，盐酸克伦特罗的浓度为3.0mg/L，亚硝酸钠,4.0mg/L；NH3·H2O,160.0mg/L.荧光法测定双酚A的线性范围是5.0μg/L～2.5mg/L

[0030] 本发明的方法既用于双酚A的检测，结果令人满意。此方法具有稳定、准确、便捷、快速和灵敏度较高等特点。

[0031] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

[0032] 实施例一

[0033] ①准确称取10.0mg的双酚A，然后加入0.5mL无水乙醇溶解，加水定容于100.0mL棕色容量瓶中，配制成0.1mg/mL的双酚A储备溶液。以该储备溶液逐渐稀释，配制成不同浓度的双酚A系列标准溶液。

[0034] ②利用偶联产物λem305nm的荧光信号优化实验条件：探讨亚硝酸钠的用量、重氮化反应时间、偶联反应酸度、偶联剂的用量、偶联反应时间和偶联反应温度的影响。荧光法的最佳实验条件为，酸度0.01mol/L，重氮化时间5min，重氮化温度为0度，盐酸克伦特罗的浓度为3.0mg/L，亚硝酸钠，4.0mg/L，氨水的浓度为160.0mg/L。

[0035] ③在优化的实验条件下，测定双酚A的线性范围是5.0μg/L～2.5mg/L，相关系数为0.9952。平行测定11次的相对标准偏差为3.2％，重现性好。结果满意、与标准方法比较无显著性差异。可利用荧光法测定末知浓度水样中双酚A的含量。

[0036] 实施例二

[0037] ①准确称取10.0mg样品处理：装饮料或瓶装水塑料瓶剪至0.5cm*0.5cm碎片，称取碎片1.000g于碘量瓶中，加入50ml二次纯净水，放入水浴锅中70℃恒温加热90min，冷却至室温后取一定量的溶液进行测定。

[0038] ②同实施例一②。

[0039] ③对①分别做三个平行样品，平行测定三次，标准加入法测定。回收率在94.5～103.6％之间，附合要求。

[0040] 实施例三

[0041] ①同实施例一①。

[0042] ②利用偶联产物在410nm可见吸收优化实验条件：探讨亚硝酸钠的用量、重氮化反应时间、偶联反应酸度、偶联剂的用量、偶联反应时间和偶联反应温度的影响。分光光度法的最佳实验条件为，酸度、重氮化时间、重氮化温度与实施例一相同，盐酸克伦特罗的浓度为16mg/L，亚硝酸钠的浓度为12mg/L，氨水的浓度为200mg/L。

[0043] ③利用光度法测定双酚A的线性范围是0.24mg/L～8.4mg/L，相关系数为0.9955。平行测定11次的相对标准偏差为0.22％，重现性好。结果满意、与标准方法比较无显著性差异。可利用此偶联分光光度法测定末知浓度水样中双酚A的含量。

[0044] 实施例四

[0045] 图1是盐酸克伦特罗、双酚A及一定实验条件下偶联反应后产物的紫外－可见光光谱图。其中，a:8.08mg/L盐酸克伦特罗；b:10.2mg/L双酚A；c:偶联反应后产物；含3.6mg/L双酚A。

[0046] 实施例五

[0047] 图2是同浓度的双酚A及偶联反应后产物的荧光光谱图。其中，偶联反应后产物激发光谱(a)(λem＝305nm)和发射光谱(b)(λex＝276nm)；双酚A溶液激发光谱(c)(λem＝305nm)和发射光谱(d)(λex＝276nm)；双酚A的浓度均为1.5μg mL-1。

[0048] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。