一种测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)LC‑MS/MS进行检测；(3)成分的定性分析。在珠芽蓼成分定性分析的基础上制备对照品溶液，还可以对其中绿原酸和没食子酸的含量进行测定。本发明首次对珠芽蓼中有机酸和黄酮两类活性成分中的10种物质同时进行测定，完善了珠芽蓼药材质量控制方法。采用LC‑MS/MS分析检测方法结合多波长切换程序，具有简便、稳定、快速、高效、灵敏度高、重复性好、干扰小的优点，能够在1小时内完成10种物质的检测，获得一张能够同时包含多个波长信息的色谱图。

权利要求

1.一种测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)供试品溶液的制备：将珠芽蓼粉末利用甲醇溶液提取制备成供试品溶液；所述甲醇溶液为50％甲醇水溶液；

2)高效液相色谱-质谱联用分析条件：

高效液相色谱条件：Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱，其尺寸为150mm×4.6mm×5μm，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速为0.8mL·min-1，DAD检测器检测波长：272nm、325nm、360nm，在不同时段切换，柱温30℃；进样量10μL；

流动相梯度洗脱程序为：

不同时段波长切换程序为：

质谱条件：四级杆质谱，离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子模式；离子扫描范围：100-1000m/z；碰撞诱导解离电压：70V；雾化压力：50psi；干燥气温度：350℃；干燥气流速：12L/min；毛细管电压：3000V；

3)成分分析：通过化学工作站检索NIST标准质谱图库，同时结合有关质谱图文献解析，定性分析确认珠芽蓼中有机酸类和黄酮类成分；所述有机酸类和黄酮类成分包括没食子酸、异绿原酸、表儿茶素二聚体、表儿茶素/儿茶素、紫丁香苷、绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷异构体、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备步骤包括：精密称取过3号筛的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密量取甲醇溶液30mL，称定重量，超声提取，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，再经0.22μm滤膜过滤。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述成分分析还包括定量分析，按如下步骤进行：(a)对照品溶液的制备：取需要定量测定成分的对照品加甲醇溶剂制成对照品溶液；

(b)标准曲线绘制：取对照品溶液稀释多个浓度，以对照品质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得出回归方程、相关系数及线性范围；

(c)样品含量测定：应用不同时段多波长测定后的HPLC图谱数据，按标准曲线法以峰面积计算样品中需要测定成分的含量。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述成分分析为对样品中没食子酸和绿原酸进行定量分析测定，按如下步骤进行：(a)对照品溶液的制备：

混合对照品：取没食子酸和绿原酸对照品加甲醇溶液制成没食子酸、绿原酸的混合对照品溶液；

没食子酸对照品溶液：取没食子酸加甲醇溶液制成没食子酸对照品溶液；

绿原酸对照品溶液：取绿原酸加甲醇溶液制成绿原酸对照品溶液；

(b)标准曲线绘制：取混合对照品溶液稀释，以没食子酸和绿原酸信噪比大于10的稀释液为定量限溶液，分别精密吸取定量限溶液10μL、混合对照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色谱仪，以对照品质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得出回归方程、相关系数及线性范围；

(c)样品含量测定：应用不同时段多波长测定后的HPLC图谱数据，按标准曲线法以峰面积计算样品中没食子酸和绿原酸成分的含量。

5.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述成分分析还包括对定量分析后进行有效性评价，其中包括系统适用性、专属性、定量限与线性、重复性、稳定性以及加样回收率。

6.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤1)所述供试品溶液的制备中的超声提取温度为55℃，超声时间为15min。

说明书

一种测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法

发明领域

[0001] 本发明属于采用现代分析检测手段对藏药材的质量进行检测的技术领域，更具体的说是利用多波长切换测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法。

背景技术

[0002] 珠芽蓼是蓼科植物珠芽蓼(Polygonum Viviparum L)的干燥根茎，《晶珠本草》中记载，然布(珠芽蓼)味甘、涩、酸，有止泻，镇肠寒痛的功效。可用于治风热，除时疫热，能调和和合紊乱，治衰老病，风湿病，亦能退烧、调经、收敛、止血等。《中国藏药》记载，珠芽蓼主含蒽醌、鞣质、多糖、黄酮苷、香豆精、有机酸、脂肪酸等成分，现有研究亦表明珠芽蓼中含有挥发油、鞣质、黄酮、多糖等多种成分，其中没食子酸和绿原酸等有机酸类成分具有抗氧化等作用，黄酮类成分具有较强的抗自由基作用和抗氧化能力。

[0003] 珠芽蓼记载于《中华人民共和国卫生部药品标准藏药(第一册)》，其中仅有对药材进行显微鉴别没有含量测定指标，不利于有效控制珠芽蓼的质量。目前有续艳丽等报道的《RP-HPLC法同时测定藏药珠芽蓼中牡荆素、槲皮苷和槲皮素的含量》和李居安等报道的《HPLC法同时测定珠芽蓼中没食子酸、绿原酸和槲皮素成分的含量》对珠芽蓼中的有机酸和黄酮类成分进行定量研究，都仅能对3种物质进行测定，不能全面反映药材的质量，无法实现对珠芽蓼药材进行全面和整体评价。

发明内容

[0004] 本发明目的在于针对以上缺陷和不足，建立一种不同时段多波长切换的LC-MS/MS图谱技术同时检测珠芽蓼中多种有机酸和黄酮类成分的方法。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 一方面，本发明提供了一种测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

[0007] 1)供试品溶液的制备：将珠芽蓼粉末利用甲醇溶液提取制备成供试品溶液；

[0008] 2)高效液相色谱-质谱联用分析条件：

[0009] 高效液相色谱条件：Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱，其尺寸为150mm×4.6mm×5μm，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速为0.8mL·min-1，DAD检测器检测波长：272nm、325nm、360nm，在不同时段切换，柱温30℃；进样量10μL；

[0010] 流动相梯度洗脱程序为：

[0011]

[0012] 不同时段波长切换程序为：

[0013]

[0014] 质谱条件：四级杆质谱，离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子模式；离子扫描范围：100-1000m/z；碰撞诱导解离电压Fragmentor：70V；雾化压力：50psi；干燥气温度：350℃；干燥气流速：12L/min；毛细管电压：3000V；

[0015] 3)成分分析：通过化学工作站检索NIST标准质谱图库，同时结合有关质谱图文献解析，定性分析确认珠芽蓼中有机酸类和黄酮类成分。

[0016] 在一些实施例中，供试品溶液的制备步骤包括：精密称取过3号筛的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密量取甲醇溶液30mL，称定重量，超声提取，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，再经0.22μm滤膜过滤。

[0017] 在一些实施例中，所述成分分析还包括定量分析，按如下步骤进行：

[0018] (a)对照品溶液的制备：取需要定量测定成分的对照品加甲醇溶剂制成对照品溶液；

[0019] (b)标准曲线绘制：取对照品溶液稀释多个浓度，以对照品质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得出回归方程、相关系数及线性范围；

[0020] (c)样品含量测定：应用不同时段多波长测定后的HPLC图谱数据，按标准曲线法以峰面积计算样品中需要测定成分的含量。

[0021] 在一些实施例中，所述成分分析为对样品中没食子酸和绿原酸进行定量分析测定，按如下步骤进行：

[0022] (a)对照品溶液的制备：

[0023] 混合对照品：取没食子酸和绿原酸对照品加甲醇溶液制成没食子酸、绿原酸的混合对照品溶液；

[0024] 没食子酸对照品溶液：取没食子酸加甲醇溶液制成没食子酸对照品溶液；

[0025] 绿原酸对照品溶液：取绿原酸加甲醇溶液制成绿原酸对照品溶液；

[0026] (b)标准曲线绘制：取混合对照品溶液稀释，以没食子酸和绿原酸信噪比大于10的稀释液为定量限溶液。分别精密吸取定量限溶液10μL、混合对照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色谱仪，以对照品质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得出回归方程、相关系数及线性范围；

[0027] (c)样品含量测定：应用不同时段多波长测定后的HPLC图谱数据，按标准曲线法以峰面积计算样品中没食子酸和绿原酸成分的含量。

[0028] 在一些实施例中，所述成分分析还包括对定量分析后进行有效性评价，其中包括系统适用性、专属性、定量限与线性、重复性、稳定性以及加样回收率。

[0029] 在一些实施例中，所述甲醇溶液为50％甲醇水溶液。

[0030] 在一些实施例中，步骤1)所述供试品溶液的制备中的超声提取温度为55℃，超声时间为15min。

[0031] 在一些实施例中，所述有机酸类和黄酮类成分包括没食子酸、异绿原酸、表儿茶素二聚体、表儿茶素/儿茶素、紫丁香苷、绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷异构体、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

[0032] 本发明所述的多波长切换同时测定珠芽蓼中有机酸和黄酮类成分的方法所具有的积极效果在于：

[0033] ①本发明首次对珠芽蓼中有机酸和黄酮两类活性成分中的10种物质同时进行测定，完善了珠芽蓼药材质量控制方法。

[0034] ②本发明采用LC-MS/MS分析检测方法具有简便、稳定、快速、高效、灵敏度高、重复性好、干扰小的优点，能够在1小时内完成10种物质的检测，且分离度良好。在建立对照品标准曲线的基础上，还能够对其进行定量分析检测，从而获得极其丰富的信息量。

[0035] ③本发明通过多波长切换程序，在保证数据信息损失最小的前提下，获得一张能够同时包含多个波长信息的色谱图。

[0036] ④本发明的中供试品用50％甲醇为提取溶剂，料液比1:30，采用55℃超声15min提取后过滤即可直接检测，样品前处理步骤简单，提取效率也较高，无需过柱纯化，且液相色谱分离过程中干扰杂质少。

[0037] ⑤本发明采用以乙腈-水为流动相，加入0.1％的甲酸调节pH，使得各峰的峰形较好，分离时间适中且分离度良好，也达到了增加各成分的离子化效果。

附图说明

[0038] 图1不同时段多波长切换珠芽蓼成分的HPLC图谱，1-10分别为没食子酸、异绿原酸、表儿茶素二聚体、表儿茶素/儿茶素、紫丁香苷、绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷异构体、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

[0039] 图2没食子酸和绿原酸混合对照品溶液的HPLC色谱图。

[0040] 图3没食子酸和绿原酸对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液HPLC图谱的比较图。

[0041] 图4没食子酸对照品溶液的标准曲线。

[0042] 图5绿原酸对照品溶液的标准曲线。

具体实施方式

[0043] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

[0044] 实施例1

[0045] 1.试剂、药材、标准品和仪器

[0046] 1.1 试剂和药材

[0047]

[0048] 1.2 标准品

[0049]

[0050] 1.3 仪器

[0051]

[0052] 2.供试品溶液的制备

[0053] 精密称取过3号筛的珠芽蓼粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密量取30mL50％甲醇，称定重量，置于55℃超声仪中超声15min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，再经0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

[0054] 3.LC-MS/MS的液相色谱及质谱条件

[0055] 3.1 LC-MS/MS的液相色谱条件

[0056] Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，按表1进行梯度洗脱，流速：0.8mL·min-1，检测波长：272nm、325nm、360nm在不同时段的切换程序按表2进行。DAD检测器在不同时段进行多波长切换；柱温30℃；进样量10μL；

[0057] 表1 流动相梯度洗脱表

[0058]

[0059] 3.2 LC-MS/MS的质谱条件

[0060] 检测条件：四级杆质谱，离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子模式；离子扫描范围：100-1000m/z；碰撞诱导解离电压Fragmentor：70V；雾化压力：50psi；干燥气温度：350℃；干燥气流速：12L/min；毛细管电压：3000V；

[0061] 表2 不同时段多波长检测表

[0062]

[0063] 4.多波长切换珠芽蓼的HPLC图谱的成分鉴定

[0064] 实验结果见图1，定性分析通过化学工作站检索NIST标准质谱图库，同时结合有关质谱图文献解析，确认珠芽蓼中有机酸类和黄酮类成分如表3所示：

[0065] 表3 珠芽蓼中成分鉴定结果

[0066]

[0067] 实施例2 没食子酸和绿原酸的定量分析

[0068] 在实施例1的基础上，还可对没食子酸和绿原酸进行定量分析。

[0069] 1.对照品溶液的制备：

[0070] 混合对照品：取没食子酸和绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1mL含没食子酸0.086mg、绿原酸0.173mg的混合对照品溶液，即得；

[0071] 没食子酸对照品溶液：取没食子酸适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1mL含没食子酸0.0216mg的对照品溶液；

[0072] 绿原酸对照品溶液：去绿原酸适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1mL含绿原酸0.945mg的对照品溶液。

[0073] 2.含量测定

[0074] 本发明所述的珠芽蓼药材质量控制方法，将4份不同来源的珠芽蓼样品分别按照实施例1中“2.供试品溶液的制备”方法进行样品制备，依次测定计算没食子酸和绿原酸的含量(n＝3)。其结果见表4；

[0075] 表4 四批珠芽蓼样品含量测定结果，mg/g，n＝3，x±s

[0076]

[0077]

[0078] 3.含量测定方法的有效性评价

[0079] 本发明所述的含量测定方法进行有效性评价，其中包括系统适用性、专属性、定量限与线性、重复性、稳定性以及加样回收率。

[0080] 3.1 系统适用性实验

[0081] 精密吸取混合对照品溶液适量，按前述色谱条件，连续进样6针，测定峰面积，计算没食子酸的峰面积RSD为0.22％(n＝6)，绿原酸的峰面积RSD为0.67％(n＝6)。2种成分分离度均大于1.5，拖尾因子在0.8-1.2，理论塔板数大于5000，说明系统适应性良好。

[0082] 3.2 专属性实验

[0083] 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液(50％甲醇)适量，按前述色谱条件，分别进样1针，记录对照品溶液的色谱图以及对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液三者的叠加图，见图2和图3。结果显示，对照品中没食子酸和绿原酸与供试品中各峰的保留时间一致，且空白对照溶液没有干扰。

[0084] 3.3 定量限与线性

[0085] 取混合对照品溶液稀释，以没食子酸和绿原酸信噪比大于10的稀释液为定量限溶液。分别精密吸取定量限溶液10μL、混合对照品溶液3μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入色谱仪，以对照品质量(μg)为横坐标，峰面积(105)为纵坐标，作出标准曲线，分别见图4和图5。得出回归方程、相关系数及线性范围，见表5。

[0086] 表5 线性方程

[0087]

[0088] 3.4 稳定性

[0089] 取珠芽蓼按前述方法制备成供试品溶液，分别于0、4、8、12、24h注入HPLC仪，记录两种成分的峰面积并计算RSD，均小于2.0％，结果表明样品在24h内稳定。

[0090] 3.5 重复性

[0091] 精密称取同批次样品6份，按前述方法制备供试品溶液，测得峰面积，计算2种成分的含量，其RSD均小于2.0％，说明方法重复性好。

[0092] 3.6 加样回收率试验

[0093] 取已知含量的珠芽蓼0.25g，精密吸取浓度为0.02161mg·mL-1没食子酸对照品溶液1mL，浓度为0.9454mg·mL-1的绿原酸对照品1mL加入到6份样品中，按前述方法进行样品制备，测定分析，计算平均回收率，结果见表6。

[0094] 表6 加样回收率试验结果(n＝6)

[0095]

[0096] 最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。