血清中25-羟基维生素D的检测方法

摘要

本发明涉及一种血清中25‑羟基维生素D的检测方法。该方法包括如下步骤：样品前处理：在血清样品中加入含有25‑羟基维生素D内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心，取上清液用乙腈稀释，即得待测样品；所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1‑4；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1‑4倍；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。该方法前处理简单、大大缩短了检测时间，提高了样本的检测通量，检测精度高，成本低廉、特异性、抗基质干扰能力强。

权利要求

1.一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品前处理：在血清样品中加入含有25-羟基维生素D内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心，取上清液用乙腈稀释，即得待测样品；所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为

1：1-4；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1-4倍；

富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测；

所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化，再将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，再断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；

其中，富集柱为C6-Phenyl，4×2.0mm，分析柱为C18，100×2.0mm，3μm；流动相1：A相为甲醇，B相为水，流速为1.0-2.0mL/min；流动相2：C相为含0.09-0.11％甲酸的甲醇，D相为含

0.09-0.11％甲酸的水，流速为0.2-1.0mL/min；

流动相采用梯度洗脱的模式：0分时，流动相1中A相与B相的体积比为50:50，流动相2中C相与D相的体积比为70:30，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.25min后将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，

1.5min时流动相2中C相与D相的体积比为85:15；1.9min时断开富集柱与分析柱，用流动相1将富集柱中的残留杂质梯度洗脱至废液瓶中，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，5.5min时流动相2中C相与D相的体积比为90:10，5.6min时流动相2中C相与D相的体积比为95:5，6.6min时流动相2中C相与D相的体积比为70:30；整个梯度时间为

7.0-9.0min。

2.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，二维液相色谱的进样量为30-100μL，柱温为35-50℃。

3.根据权利要求1所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述流动相

1的流速为1.2-1.3mL/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6mL/min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述25-羟基维生素D内标物为25-羟基维生素D的C13标记物或氘代标记物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间4-8min。

6.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；

所述正离子模式中，目标定量离子对包括25-羟基维生素D2定量离子对和/或25-羟基维生素D3定量离子对；

目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：25-羟基维生素D2的母离子的质/荷比为413.0-413.8，对应的子离子的质/荷比为394.8-395.5；25-羟基维生素D3的母离子的质/荷比为401.0-401.8，对应的子离子的质/荷比为383.3-383.6。

7.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为38-

42psi，加热气压力为48-52psi，辅助加热气压力为48-52psi，加热气温度为445-455℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为7.5-8.5psi，电喷雾针电压为5400-5600V。

8.根据权利要求1-3任一项所述的血清中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括：25-羟基维生素D3定量离子对的去簇电压为104-106V，入口电压为9-11V，碰撞电压为16-18V，出口电压为12-14V；25-羟基维生素D3内标物的定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-15V，出口电压为11-13V；25-羟基维生素D2定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-16V，出口电压为12-14V；25-羟基维生素D2内标物的定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为

9-11V，碰撞电压为14-16V，出口电压为12-14V。

说明书

血清中25-羟基维生素D的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种血清中25-羟基维生素D的检测方法。

背景技术

[0002] 维生素D是一种脂溶性维生素，是固醇类衍生物，是维持人类身体健康必需的一种化合物。维生素D包括5种化合物，与健康密切相关的是维生素D2和维生素D3。维生素D2和维生素D3经肝脏的单氧化酶(25-羟基氧化酶)氧化形成25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。25-羟基维生素D在血液中的浓度高、循环周期长，因此成为维生素D在人体内的浓度指示剂，是人体维生素D营养状况的评价指标。

[0003] 维生素D3可由动物性维生素原(7-脱氢胆固醇)经紫外线270-300nm激活形成，维生素D2是由植物性维生素原(麦角固醇)经紫外线270-300nm激活形成的。因此维生素D2多存在于植物性食物中，维生素D3多存在于动物性食物中。维生素D2和D3长期被认为是生物学等价的，然而最近的报道表明这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差异(Armas etc，(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391)。

[0004] 人体血液中25-羟基维生素D的浓度较低一般为ppb级别，主要以蛋白DBP结合的形式存在，且人体血液组成复杂存在大量的高亲和力结合蛋白，因此直接检测存在严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低等缺点。为了降低基质干扰，提高特异性、灵敏度等，目前常采用方法有：方法1：离线-样本先经蛋白沉淀，再经过液液萃取或者液固萃取后进行氮吹浓缩得到待测样本，样本经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测；方法2：在线-样本先经蛋白沉淀后经过在线萃取装置得到待测物，再经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测。但是这两种方法存在如下的问题：方法1：前处理复杂、处理时间长(一个样本约2小时)、通量低、试剂成本高、对操作人员要求高；方法2：仪器投入大，且在线萃取的耗材成本高。

发明内容

[0005] 基于此，有必要针对现有技术的上述问题，提供一种血清中25-羟基维生素D的检测方法。该方法前处理简单并能有效去除基质干扰，可以同时快速检测并准确定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，灵敏度高、通量高。

[0006] 具体技术方案如下。

[0007] 一种血清中25-羟基维生素D的检测方法，包括以下步骤：

[0008] 样品前处理：在血清样品中加入含有25-羟基维生素D内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心，取上清液用乙腈稀释，即得待测样品；所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1-4；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1-4倍；

[0009] 富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。

[0010] 在其中一些实施例中，所述富集、分离和检测的步骤包括：先用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化，再将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，再断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；

[0011] 其中，富集柱为C6-Phenyl(4×2.0mm)，分析柱为C18(100×2.0mm，3μm)；流动相1：A相为甲醇，B相为水，流速为1.0-2.0mL/min；流动相2：C相为含0.09-0.11％甲酸的甲醇，D相为含0.09-0.11％甲酸的水，流速为0.2-1.0mL/min。

[0012] 本发明所述的二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪配置了两套泵，两套泵通过六通阀(或者其它可实现切换的方式)实现切换。起始模式下，富集柱与分析柱处于未连通状态，待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化后，0.25min切换六通阀使富集柱与分析柱连通，将待测样品洗脱至分析柱，1.9min六通阀切回起始模式，断开富集柱与分析柱，待测物在分析柱中经梯度洗脱至分离后进入质谱进行检测，富集柱中的残留杂质经梯度洗脱至废液瓶中。

[0013] 在其中一些实施例中，二维液相色谱的进样量为30-100μL，柱温为35-50℃。

[0014] 在其中一些实施例中，所述进样量为40-60μL，所述柱温为35-45℃。

[0015] 在其中一些实施例中，流动相采用梯度洗脱的模式：0分时，流动相1中A相与B相的体积比为50:50，流动相2中C相与D相的体积比为70:30，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；0.25min后将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，1.5min时流动相2中C相与D相的体积比为85:15；1.9min时断开富集柱与分析柱，用流动相1将富集柱中的残留杂质梯度洗脱至废液瓶中，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，5.5min时流动相2中C相与D相的体积比为90:10，5.6min时流动相2中C相与D相的体积比为95:5，6.6min时流动相2中C相与D相的体积比为70:30；整个梯度时间为7.0-9.0min。

[0016] 在其中一些实施例中，所述流动相1的流速为1.2-1.3mL/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6mL/min。

[0017] 在其中一些实施例中，所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1.5-2.5；所述上清液与所述乙腈的体积比为1：1.5-2.5倍。

[0018] 在其中一些实施例中，所述25-羟基维生素D内标物为25-羟基维生素D的C13标记物或氘代标记物。

[0019] 在其中一些实施例中，所述离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间4-8min。

[0020] 在其中一些实施例中，四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；

[0021] 所述正离子模式中，目标定量离子对包括25-羟基维生素D2定量离子对和/或25-羟基维生素D3定量离子对；

[0022] 目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：25-羟基维生素D2的母离子的质/荷比为413.0-413.8，对应的子离子的质/荷比为394.8-395.5；25-羟基维生素D3的母离子的质/荷比为401.0-401.8，对应的子离子的质/荷比为383.3-383.6。

[0023] 在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为38-42psi，加热气压力为48-52psi，辅助加热气压力为48-52psi，加热气温度为445-455℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为7.5-8.5psi，电喷雾针电压为5400-5600V。

[0024] 在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括：25-羟基维生素D3定量离子对的去簇电压为104-106V，入口电压为9-11V，碰撞电压为16-18V，出口电压为12-14V；25-羟基维生素D3内标物的定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-15V，出口电压为11-13V；25-羟基维生素D2定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-16V，出口电压为12-14V；25-羟基维生素D2内标物的定量离子对的去簇电压为114-116V，入口电压为9-11V，碰撞电压为14-16V，出口电压为12-14V[0025] 本发明的血清中25-羟基维生素D的检测方法具有以下优点和有益效果：

[0026] (1)本发明检测方法前处理简单，不需要萃取，氮吹浓缩，复溶等，处理时间短，处理单个样本只需1.5-3min，处理一批(20个)也只需要5-8min，而常用的萃取法处理单个样本至少需120min，处理一批(20个)也至少需要150min。即本发明的检测方法大大缩短了检测时间，提高了样本的检测通量。

[0027] (2)本发明的检测方法在仪器投入方面比普通的液相色谱串联四级杆质谱仪仅增加了一个富集柱和一组泵，并且采用的富集柱简单、成本低且可重复使用数千次以上。相对于在线固相萃取，本方法的耗材成本至少降低10倍。即本发明的检测方法成本低。

[0028] (3)本发明的检测方法通过对前处理的参数以及富集、分离和检测的各参数(比如富集柱的选择、流动相的选择、流速等条件)进行了大量实验研究进行优化，使最后得到的检测方法可以有效去除基质干扰，特异性、抗基质干扰能力强。定量限低(1.2μg/L)，灵敏度高，精密度RSD小于10％，可以准确的定性或定量检测出人血清中极低浓度的25-羟维生素D含量。即与常用的检测相比，本发明的检测方法检测灵敏度高、精密度高、特异性强。

附图说明

[0029] 图1为实施例1人血清样品中25-羟基维生素D及其内标物的TIC图；

[0030] 图2为25-羟基维生素D3的标准曲线图；

[0031] 图3为25-羟基维生素D2的标准曲线图；

[0032] 图4为25-羟基维生素D2的线性回归曲线图；

[0033] 图5为25-羟基维生素D3的线性回归曲线图。

具体实施方式

[0034] 以下结合具体实施例对本发明的血清中25-羟基维生素D的检测方法进行进一步详细的说明。

[0035] 实施例1

[0036] 本实施例的25-羟基维生素D的检测方法，包括以下步骤：

[0037] 一、样品前处理

[0038] 将200μL人血清样品倒入到洁净的离心管中，加入400μL含有内标物(112μg/L 6d-25羟基维生素D3和50μg/L 3d-25羟基维生素D2)的乙腈溶液，漩涡混匀60s后，于离心机
12000r/min，4℃离心分离5min，取200μL上清液至棕色进样瓶中，再加入400μL乙腈，漩涡混匀60s后，即得待测样品，将其加载至液相色谱自动进样器中。

[0039] 二、富集、分离和检测

[0040] 自动进样器自动将50μL待测样品加载到二维液相色谱系统中，对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱仪LC-MS/MS进行富集、分离与检测。

[0041] 其中，富集柱为C6-Phenyl(4×2.0mm)；分析柱为C18(100×2.0mm,3μm)；柱温为40℃。

[0042] 该系统配置了两套泵，两套泵通过一个六通阀实现切换(也可以通过两个六通阀或者其它的方式进行切换)，六通阀3号位连接FLOW1(流动相1)，1号和4号位连接富集柱，5号位连接FLOW2(流动相2)，6号位连接分析柱，2号位连接废液瓶。

[0043] FLOW1流动相：A相为甲醇、B相为水，流速为1.2mL/min；FLOW2流动相：C相为含有0.1％甲酸的甲醇、D相为含有0.1％甲酸的水，流速0.5mL/min。

[0044] 六通阀的起始模式为0，即富集柱与分析柱处于未连通状态，待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化，此过程中富集柱用FLOW1流动相进行洗脱；0.25min切换六通阀为1，即富集柱与分析柱连通，将待测样品洗脱至分析柱，此过程中富集柱与分析柱中的洗脱流动相均为FLOW2流动相；1.9min六通阀切回起始模式0，断开富集柱与分析柱，待测物在分析柱中经梯度洗脱(流动相为FLOW2流动相)至分离后进入质谱进行检测，富集柱中的残留杂质经梯度洗脱(流动相为FLOW1流动相)至废液瓶中。流动相的梯度洗脱如表1所示。

[0045] 表1 流动相的洗脱梯度

[0046]

[0047] 上述梯度下，25-羟维生素D2和25-羟维生素D3的保留时间分别为4.12min和4.28min。

[0048] 本实施例LC-MS/MS采用具有电喷雾电离源(ESI)的Applied Biochemistry API4500plus串联质谱分析仪作为检测器进行分析。其中，气帘气压力为40.0psi；加热气压力为50psi；辅助加热气压力为50psi；加热气温度为450℃；碰撞气为高纯氮气，压力为7psi；电喷雾针电压为5500V。

[0049] 其它质谱条件：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM，其条件参见表2。

[0050] 表2 多反应监测离子扫描MRM条件

[0051]

[0052] 待测物随流动相流出分析柱后，在压力的作用下进入质谱仪离子源，由六通阀控制进入离子源的样品通道，和进入切换时间。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量过滤器，只允许根据25-羟基维生素D及其内标物的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有25-羟维生素D及其内标物的特定质荷比m/z的母离子，具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中25-羟维生素D及其内标物的碎片离子(子离子)被选择通过，而其它离子被除去。参见表3，示出了被用于鉴别和定量的25-羟基维生素D的离子对的质荷比m/z。

[0053] 表3 25-羟基维生素D的质量转变表

[0054]

[0055]

[0056] 随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图(TIC图)(如图1所示)。

[0057] 三、定性判断和定量计算

[0058] (1)依据25-羟基维生素D、内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断25-羟基维生素D的存在。

[0059] 在相同试验条件下，检测样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致；检测样品的色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差(即表4中的最大允许误差)不超过表4规定的范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。

[0060] 表4 定性判断相对丰度的最大允许误差

[0061]相对丰度(K) K≥50％ 20％≤K≤50％ 10％≤K≤20％ K≤10％
最大允许误差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％

[0062] (2)采用内标标准曲线法定量，以25-羟基维生素D与内标物的峰面积比值计算样品中的25-羟基维生素D的含量。

[0063] 配置系列浓度的含有25-羟基维生素D的血清标准样品，用本实施例的上述方法进行样品前处理以及分离检测，以血清标准样品中25-羟基维生素D和内标物的峰面积的比值构建内标标准曲线，25-羟基维生素D3的标准曲线见图2，曲线的方程Y＝0.00409X+0.00337，R＝0.9999；25-羟基维生素D2的标准曲线见图3，曲线的方程为Y＝0.00124X+
0.000663,R＝0.9999，然后利用该标准曲线计算待测样品或质量控制物中的25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2的浓度。

[0064] 本实施例测得25-羟基维生素D3的峰面积为3.41×105，其内标物的峰面积为3.66×106，计算得到本实施例的人血清样品中25-羟基维生素D3的浓度为21.96ug/L；25-羟基维生素D2的峰面积为4.14×104，其内标物的峰面积为1.45×106，计算得到25-羟基维生素D2的浓度为22.49ug/L。

[0065] 实施例2 方法学验证实验

[0066] 本实施例对实施例1中的25-羟基维生素D的检测方法进行方法学验证实验。

[0067] 1、精密度(Precision)实验

[0068] 1.1批内精密度(Intra-assay)

[0069] a.取实际血清样本分别加标至低、中、高三水平，得到的样本进行批内精密度实验；

[0070] b.每个浓度水平的样本平行处理20个，每个进样1次；

[0071] c.计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD)，要求RSD小于20％；

[0072] d.表5和6即为批内精密度数据，批内精密度均小于5％，满足要求。

[0073] 表5 25-羟基维生素D2的批内精密度实验结果

[0074]

[0075]

[0076] 表6 25-羟基维生素D3批内精密度实验结果

[0077]

[0078]

[0079] 1.2 批间精密度(Inter-assay)

[0080] a.取预先配制好的低、中、高三水平的质控品，进行批间精密度实验；

[0081] b.每个水平的样本分别做4个平行，即检测得4组数据，连续测定5天；

[0082] c.计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD),要求RSD小于20％；

[0083] d.表7和8即为批间精密度数据，批间精密度均小于11％，满足要求。

[0084] 表7 25-羟基维生素D2批间精密度实验结果

[0085]

[0086]

[0087] 表8 25-羟基维生素D3批间精密度实验结果

[0088]

[0089]

[0090] 2、分析灵敏度和线性范围(Analytical Sensitivity and Analytical M--eas urement Range and Linearity Study)

[0091] 2.1 方法定量限与线性范围(Limit of Quantitation and Linearity)[0092] a.配制空白基质；

[0093] b.配置标准曲线；

[0094] c.每个浓度的样本平行处理6个，分别检测一次；

[0095] d.计算各浓度样本的平均值、RSD和回收率；

[0096] e.方法定量限的确定标准：RSD小于20％且回收率在85％-115％范围内的最低浓度点视为定量限浓度，即LOQ；

[0097] f.线性范围的确定标准：RSD小于20％，回收率在85％-115％范围内，且以理论浓度比率与实际信号响应峰面积比率绘制成的回归曲线R2>0.98，即满足线性范围的要求；

[0098] g.验证实验数据如表10和表11与图4和图5所示，25-羟基维生素D2的LOQ为2.08ug/L，线性范围为2.08-100ug/L；25-羟基维生素D3的LOQ为2.08ug/L，线性范围为
2.08-100ug/L。

[0099] 表9 回归曲线中的曲线点浓度

[0100]

[0101]

[0102] 表10 25-羟基维生素D2定量限实验结果

[0103]

[0104] 表11 25-羟基维生素D3定量限实验结果

[0105]

[0106]

[0107] 2.2 方法检出限(Limit ofDetection)

[0108] a.收集浓度均在定量限LOQ附近的病人样本；

[0109] b.平行处理此病人样本20个，分别检测1次；

[0110] c.计算各浓度样本的平均值、SD和方法检出限(LOD)；

[0111]

[0112] d.实验结果如表12和表13所示，25-羟基维生素D2的LOD为0.48ug/L，25-羟基维生素D3的LOD为0.54ug/L。

[0113] 表12 25-羟基维生素D2方法检出限试验结果

[0114]

[0115]

[0116] 表13 25-羟基维生素D3方法检出限试验结果

[0117]

[0118]

[0119] 2.3 结论(Summary oftheAMR study)

[0120] 表14 25-羟基维生素D2分析灵敏度与线性范围结果汇总

[0121]

[0122] 表15 25-羟基维生素D3分析灵敏度与线性范围结果汇总

[0123]

[0124] 3.方法准确度-回收率(Recovery)

[0125] a.收集一批混合血清样本，测得基础浓度，分别加标至高、中、低三水平的样本，进行加标回收率实验；

[0126] b.未加标及加标样品，每个平行处理3个，分别进行检测，计算加标样品的回收率结果，回收率在85-115％范围内，认为方法准确；

[0127]

[0128] c.回收率实验结果如表16和表17所示。由结果可知，方法的回收率在95.42-105％之间，满足要求。

[0129] 表16 25-羟基维生素D2加标回收率试验结果

[0130]

[0131]

[0132] 表17 25-羟基维生素D3加标回收率试验结果

[0133]

[0134]

[0135] 由上述的检测结果显示本发明的25-羟基维生素D的检测方法检测血清样品或者质控物质结果准确，定量限为2.08μg/L，检测限为0.48-0.54μg/L，精密度RSD<5％，加标回收率在95％-105％之间，前处理时间约1.5min，检测效率高。说明本方法准确可靠，精密度高、灵敏度高、检测通量高、成本低。

[0136] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0137] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。