一种白樱花组织培养与快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，进行工厂化生产以满足市场需求。它包括以下步骤：樱花无菌苗获得、无菌苗继代培养、生根培养、组培苗的炼苗和移栽；采用本发明所提供的白樱花组培方法，无菌外植体获得和无菌苗诱导培养使用同一种培养基，简化了操作流程，降低了生产成本；这种方法可以在4‑5个月时间内建立一套完整的白樱花组培生产流程，从而进行工厂化生产，大大缩短了组织培养的繁殖周期，且生根率高，可以达到98％以上，为市场上快速提供大量樱花种苗提供可能。

权利要求

1.一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，其特征在于：包括白樱花无菌苗获得、无菌苗继代培养、生根培养和组培苗炼苗及移栽，具体操作步骤如下：(1)无菌苗的获得：剪取白樱花一年生健康幼嫩枝条，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，将枝条修剪成3-5cm长枝段，用2％洗衣粉浸泡3-5min，用流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.05％升汞消毒8-16min，无菌水冲洗6-8次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到诱导培养基中，先暗培养5-7d后转到正常光照下培养，10-12d后腋芽开始萌动，形成小芽；所述诱导培养基成分为：改良MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA或IBA0.01-0.03mg/L+GA30.5-1mg/L+白砂糖

30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0；

(2)无菌苗继代培养：将由腋芽萌动形成的小芽转接到增殖培养基上进行增殖培养，

26-30d后形成丛生芽，利用顶芽、茎段及基部芽团进行继代增殖；所述增殖培养基成分为：

改良MS+6-BA0.4-0.8mg/L+2-ip0.01-0.05mg/L+NAA或IBA0.01-0.1mg/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0；

(3)生根培养：选取继代培养中高度大于1.8cm的白樱花组培苗，保留3-4片展开叶，距离叶柄3-5mm处切割，基部叶片、叶柄及腋芽切除干净，接种到生根培养基中，10-12d开始形成新根，20d生根率达到98％以上；所述生根培养基成分为：1/2MS+NAA或IBA0.8-2.0mg/L+白砂糖20g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0；

(4)白樱花组培苗的炼苗和移栽：常温炼苗4-7d后，移栽入基质中培养3-4周，棚内湿度控制在80-90％，温度控制在22-30℃，待新根及新叶发出后逐渐揭膜通风，获得白樱花大棚生根苗；

所述步骤(1)中无菌苗的获得、步骤(2)中继代培养，其特征在于：所述改良MS培养基成分为：

CaCl2·2H2O 441mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；KNO3 2022mg/L；NH4NO3 1600mg/L；

NaH2PO4312mg/L；Na2·EDTA 37.25mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；KI 0.83mg/L；H3BO3 

6.2mg/L；MnSO4·4H2O 16.9mg/L；ZnSO4·7H2O 11.5mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·

5H2O0.03mg/L；CoCl2·6H2O 0.03mg/L；肌醇100mg/L；烟酸0.5mg/L；盐酸吡哆酸0.5mg/L；盐酸硫胺素0.1mg/L；甘氨酸2mg/L。

2.根据权利要求1所述的一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中无菌苗的获得，首先放在暗培养5-7d后，再放到正常光照下培养。

3.根据权利要求1所述的一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)无菌苗的诱导培养基、步骤(2)无菌苗增殖培养培养基、步骤(3)生根培养基配制好后均用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。

4.根据权利要求1所述的一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，其特征在于：所述培养均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照时间12-14h/d、光照强度2000-

3000lx，温度26±2℃。

5.根据权利要求1所述的一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(4)组培苗的炼苗和移栽：白樱花组培苗的炼苗和移栽：将生根的试管苗移至常温环境中，在常温下炼苗4-7d后，用清水洗净试管苗的根部培养基，用1‰多菌灵浸泡2min，在缓慢流水下冲洗干净，用1‰高锰酸钾浸泡2-3min，移栽入分层基质中，营养杯下层2/3为体积比园土：珍珠岩：蛭石：草炭＝2:2:2:1的混合基质，上层1/3为体积比珍珠岩：蛭石：草炭＝1:1:1的混合基质，控制棚内湿度80-90％，温度22-30℃，培养3-4周，待新根及新叶发出后逐渐揭膜通风，获得白樱花的大棚生根苗。

说明书

一种白樱花组织培养与快速繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种组织培养的方法，具体涉及一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，属于组织培养育苗技术领域。

背景技术

[0002] 樱花隶属于蔷薇科李亚科樱属，是著名的木本观赏花卉。起源于中国，是我国资源物种丰富，分布广泛的优良树种，约有45个品种在除东北、西北地区以外各地种植，在世界各地也均有生长，为日本国花。樱花大部分为落叶乔木,高5-25米,树冠广展,树皮呈灰褐色，花单生、散形或少花(通常在8朵以下)组成伞房总状花序。樱花既适用于庭院绿化美化，又可充当行道树使用，在山林中成片种植观赏效果更佳。并有很强的适应性和较强的抗污染能力。樱花因花色艳丽、气味幽香，是人们喜爱的园林观赏树种，每年樱花开放时都会吸引大量游客，带动了周边旅游业的发展，提高了人们的精神文化生活。

[0003] 樱属植物种子自然状态下不易萌发，传统的扦插、嫁接方法繁殖系数低，成苗慢。随着樱花在园林绿化建设中的广泛应用，市场上对樱花苗木的需求量增加。因此，传统的繁殖方法已远远不能满足生产上的需要。组织培养技术，选用优良单株作为外植体，保证了遗传性状的稳定，缩短其良种推广的周期,提升种苗质量,为市场上快速大量提供樱花优良苗木提供可能。

[0004] 朱育端在“东京樱花组培快繁技术研究”中，研究了植物激素、GA3对东京樱花组织培养的影响，诱导培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，芽的诱导率为95.83％；增殖培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA3 0.5mg/L；生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.5mg/L，生根率为95％以上。

[0005] 王光萍等在“福建山樱花的组组织培养及植株再生”的研究中，以一年生嫩枝作为外植体，诱导培养基为1/4MS+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L，芽的诱导率为87.5％；增殖培养基为MS+BA/KT1.0mg/L+IBA0.1mg/L+GA3 0.3mg/L，增值系数4以上；生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L+BA0.75mg/L，生根率为90％以上。

[0006] 黄宇翔等在“福建山樱花组培快繁研究”中，诱导培养基为1/4MS+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L，芽的诱导率为68.57％；增殖培养基为MS+BA1.0mg/L+GA3 0.3mg/L，增值系数为6；生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，生根率为92.1％。

[0007] 李勇等在“福建山樱花组培快繁技术”中，诱导培养基为MS+BA0.4mg/L+NAA0.3mg/L，芽的诱导率为84％；增殖培养基为MS+BA0.4mg/L+GA3 0.2mg/L，增值系数为4.14；生根培养基为1/2改良MS+IBA0.2mg/L+NAA0.2mg/L，生根率为91.6％。

[0008] 吕月良等在“福建山樱花不定芽诱导和植株再生规模化繁殖试验”中，诱导培养基为1/4MS+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L，芽的诱导率为68.57％；增殖培养基为MS+BA1.0mg/L+GA3 0.3mg/L，增值系数为6；生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，生根率为92.1％以上。

[0009] 王红梅等，在“垂枝樱花外植体灭菌及不定芽的诱导研究”中，对外植体选择、灭菌方法和程序、不定芽的诱导等环节进行了初步研究，诱导培养基为1/2MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L，分化率为68.3％。

[0010] 王玉珍等在“草樱花组培快繁技术的研究”中研究了激素配比、蔗糖、培养条件等组培苗工厂化生产关键技术，移栽成活率90％以上，理论上建立了草樱花工厂化生产工艺及试管苗培养标准。

[0011] 综上所述，可见近年来对樱花的组织培养和快繁技术的研究很多，多数都在樱花启动、增殖、生根和移栽方面做了较全面的试验，但是针对工厂化生产的试验还很少，且多数停留在理论层面上，实际投入生产的很少。本研究结合生产实际对白樱花茎段进行启动培养，采用GA3提高了植株诱导率；生根切割采用特定切割手法，使生根率达到98％以上，并且投入实际生产中，使试验数据更具真实性、准确性；生产中用白砂糖代替蔗糖，增加单瓶接种数量，降低了生产成本，更有利于实际生产。使组培技术理论用于实践，有利于推广樱花工厂化生产，推动我国樱花产业化发展。

发明内容

[0012] 本发明的目的在于，提供一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明的目的是提供一种白樱花组织培养方法，解决组培苗生产周期长，生产成本高等问题。

[0013] 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

[0014] 一种白樱花组织培养和快速繁殖方法，其特征在于：包括白樱花无菌苗获得、无菌苗继代培养、生根培养和组培苗炼苗及移栽，具体操作步骤如下：

[0015] (1)无菌苗的获得：剪取白樱花一年生健康幼嫩枝条，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，将枝条修剪成3-5cm长枝段，用2％洗衣粉浸泡3-5min，用流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.05％升汞消毒8-16min，无菌水冲洗6-8次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到培养基中，先暗培养5-7d后转到正常光照下培养，10-12d后腋芽开始萌动，形成小芽；所述诱导培养基成分为：改良MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA或IBA0.01-0.03mg/L+GA30.5-1mg/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0；

[0016] (2)无菌苗继代培养：将由腋芽萌动形成的小芽转接到增殖培养基上进行增殖培养，26-30d后形成丛生芽，利用顶芽、茎段及基部芽团进行继代增殖；

[0017] 所述增殖培养基成分为：改良MS+6-BA0.4-0.8mg/L+2-ip0.01-0.05mg/L+NAA或IBA0.01-0.1mg/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0。

[0018] (3)生根培养：选取权利要求(2)继代培养中高度大于1.8cm的白樱花组培苗，保留3-4片展开叶，距离叶柄3-5mm处切割，基部叶片、叶柄及腋芽切除干净，接种到生根培养基中，10-12d开始形成新根，20d左右生根率达到98％以上；所述生根培养基成分为：1/2MS+NAA或IBA0.8-2.0mg/L+白砂糖20g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0。

[0019] (4)白樱花组培苗的炼苗和移栽：常温炼苗4-7d后，移栽入基质中培养3-4周，棚内湿度控制在80-90％，温度控制在22-30℃，待新根及新叶发出后逐渐揭膜通风，获得白樱花大棚生根苗。

[0020] 其中，所述步骤(1)中无菌苗的获得、步骤(2)中继代培养，其特征在于：所述改良MS培养基含有成分为：

[0021] CaCl2·2H2O 441mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；KNO3 2022mg/L；NH4NO3 1600mg/L；NaH2PO4312mg/L；Na2·EDTA 37.25mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；KI 0.83mg/L；H3BO3 
6.2mg/L；MnSO4·4H2O 16.9mg/L；ZnSO4·7H2O 11.5mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·
5H2O0.03mg/L；CoCl2·6H2O 0.03mg/L；肌醇100mg/L；烟酸0.5mg/L；盐酸吡哆酸0.5mg/L；盐酸硫胺素0.1mg/L；甘氨酸2mg/L。

[0022] 其中，所述步骤(1)中无菌苗的获得，首先放在暗培养5-7d后，再放到正常光照下培养。

[0023] 其中，所述步骤(1)无菌苗的获得培养基、步骤(2)无菌苗继代培养培养基、步骤(3)生根培养基所需的碳源均由白砂糖替换了蔗糖。

[0024] 其中，所述步骤(1)中、以改良MS为基本培养基，含有下列浓度的物质：0.1-0.3mg/L 6-BA、0.01-0.03mg/LNAA或IBA、0.5-1mg/L GA3。

[0025] 优选的，所述步骤(2)中，以改良MS为基本培养基，含有下列浓度的物质：0.4-0.8mg/L 6-BA、0.01-0.05mg/L 2-ip、0.01-0.1mg/LNAA或IBA

[0026] 其中，所述步骤(1)无菌苗的获得培养基、步骤(2)无菌苗继代培养培养基、步骤(3)生根培养基配制好后均用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。

[0027] 其中，所述培养均在植物组培室采用日光灯照射进行光照培养，光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。

[0028] 其中，所述步骤(4)组培苗的炼苗和移栽：

[0029] 白樱花组培苗的炼苗和移栽：将生根的试管苗移至常温环境中，在常温下炼苗4-7d后，用清水洗净试管苗的根部培养基，用1‰多菌灵浸泡2min，在缓慢流水下冲洗干净，用
1‰高锰酸钾浸泡2-3min，移栽入分层基质中，营养杯下层2/3为体积比园土：珍珠岩：蛭石：
草炭＝2:2:2:1的混合基质，上层1/3为体积比珍珠岩：蛭石：草炭＝1:1:1的混合基质。控制棚内湿度80-90％，温度22-30℃，培养3-4周，待新根及新叶发出后逐渐揭膜通风，获得白樱花的大棚生根苗。

[0030] 本发明的有益效果：

[0031] 1.本发明的白樱花组织培养方法，外植体启动、诱导阶段，先进行暗培养处理，后放到正常光照下培养，接种到含有低浓度的NAA、IBA和GA3培养基中，缩短了芽的萌发时间，增加了芽萌发数量。10-12d后腋芽开始萌动，萌动率85％；18-20d后转接到继代培养基中，缩短了组培周期。

[0032] 2.继代种苗接种到生根培养基中，将高度大于1.8cm的种苗距离叶柄下3-5mm处切割，贴茎秆将叶柄和腋芽切除干净，20d后，生根率可以达到98％以上。

[0033] 3.增加单瓶接种数量，采用白砂糖替代蔗糖。降低了单株生产成本，有利于樱花组培工厂化生产推广。

具体实施方式

[0034] 以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0035] 实施例1

[0036] 白樱花组织培养和快速繁殖方法，它按照以下步骤顺序进行：

[0037] (1)白樱花无菌苗的获得：

[0038] 剪取白樱花一年生健康幼嫩枝条，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，将枝条修剪成3-5cm长枝段，用2％洗衣粉浸泡3-5min，用流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.05％升汞消毒8-16min，无菌水冲洗6-8次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到培养基中，先暗培养5-7d后转到正常光照下培养，10-12d后腋芽开始萌动，形成小芽；所述诱导培养基成分为：MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA或IBA0.01-0.03mg/L+GA30.5-1mg/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0。启动培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。启动培养20d，启动率71.7％。

[0039] (2)无菌苗继代培养：

[0040] 将启动培养20d后形成的小芽转接到增殖培养基上进行增殖培养，26-30d后形成丛生芽，利用顶芽、茎段及基部芽团进行继代增殖；所述增殖培养基成分为：MS+6-BA0.4-0.8mg/L+2-ip0.01-0.05mg/L+NAA或IBA0.01-0.1mg/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0。继代培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间
12～14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。增殖培养周期28±2天，增殖系数3.6。

[0041] (3)生根培养：

[0042] 选取继代种苗高度大于1.8cm的白樱花组培苗，保留3-4片展开叶，距离叶柄3-5mm处切割，基部叶片、叶柄及腋芽切除干净，接种到生根培养基中，10-12d开始形成新根，20d左右生根率达到98％以上；所述生根培养基成分为：1/2MS+NAA或IBA0.8-2.0mg/L+白砂糖20g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH5.6-6.0；生根培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。生根培养周期28±
2天，生根率98％以上。

[0043] (4)白樱花组培苗的炼苗和移栽：

[0044] 常温炼苗4-7d，前3-5d封盖放到光照、湿度适宜的棚内炼苗，后1-2d将盖子旋开搭在瓶子上炼苗。用清水洗净试管苗的根部培养基，用1‰多菌灵浸泡2min，在缓慢流水下冲洗干净，用1‰高锰酸钾浸泡2-3min，移栽入分层基质中，营养杯下层2/3为体积比园土：珍珠岩：蛭石：草炭＝2:2:2:1的混合基质，上层1/3为体积比珍珠岩：蛭石：草炭＝1:1:1的混合基质。控制棚内湿度80-90％，温度22-30℃，培养3-4周，待新根及新叶发出后逐渐揭膜通风，获得白樱花的大棚生根苗，大棚移栽成活率达到85％以上。

[0045] 实施例2

[0046] 诱导、继代培养基本培养基的优化。为了提高白樱花的诱导率和增殖系数，对诱导培养和继代培养的基本培养基进行改良优化，改良MS母液的具体成分如下：

[0047] CaCl2·2H2O 441mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；KNO3 2022mg/L；NH4NO3 1600mg/L；NaH2PO4312mg/L；Na2·EDTA 37.25mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；KI 0.83mg/L；H3BO3 
6.2mg/L；MnSO4·4H2O 16.9mg/L；ZnSO4·7H2O 11.5mg/L；Na2 MoO4·2H2O 0.25mg/L；
CuSO4·5H2O0.03mg/L；CoCl2·6H2O 0.03mg/L；肌醇100mg/L；烟酸0.5mg/L；盐酸吡哆酸
0.5mg/L；盐酸硫胺素0.1mg/L；甘氨酸2mg/L。

[0048] 除了诱导和继代基本培养基替换成改良MS母液外，其他步骤方法同实施例1，使用改良MS为基本培养基，诱导率可以达到85％，增殖系数达到5.85，都有明显提高。

[0049] 实施例3

[0050] 启动培养基的筛选，以改良MS为基本培养基，采用L8(27)正交设计(如表1)，筛选不同种类、浓度激素对白樱花诱导率的影响，每个处理接种20瓶，每瓶接种3株，重复3次。其余方法步骤均与实施例1相同。

[0051] 表1不同种类、浓度激素对白樱花诱导率的影响

[0052]

[0053] 试验结果如表2：

[0054] 表2不同种类、浓度激素对白樱花诱导率的影响

[0055]

[0056] 由上表可知，使用不同种类和浓度的激素对白樱花进行诱导培养，诱导率不同。其中GA3对白樱花芽的诱导效果最显著，其次是6-BA，生长素NAA和IBA效果不明显。赤霉素和细胞分裂素具有打破植物休眠的作用，加快了白樱花腋芽的萌发。当GA3、6-BA、IBA浓度分别为1.0mg/L、0.3mg/L和0.03mg/L时，白樱花的外植体诱导率可以达到85％。

[0057] 实施例4

[0058] 白樱花生根培养基配方的优化，用继代培养所得的组培苗进行生根培养，将1.8cm以上的健壮苗切割下来，分成单株接种在生根培养基中，进行生根培养。以1/2MS为基本培养基，采用L9(34)正交设计，添加不同质量浓度的IAA、IBA和NAA诱导根的生成，研究不同植物生长调节剂浓度对白樱花瓶内生根的影响，以不添加任何激素的1/2MS培养基作对照。每个处理接种15瓶，每瓶接种6株，重复3次。除生根培养基配方与实施例1不同外，其余方法步骤均与实施例1相同。

[0059] 表3白樱花瓶内生根的因素水平表

[0060]

[0061] 表4不同植物生长调节剂组合对试管苗生根的影响

[0062]

[0063] 由表4可知，在白樱花生根培养基中添加生长素有利于根的生成，且不同浓度的IAA、IBA和NAA对白樱花根的形成的诱导效果不同。在白樱花生根培养基中添加NAA和IBA，生根率高于添加IAA的培养基，未添加任何生长素的1/2MS培养基不利于樱花生根。当培养基中IBA和NAA的浓度≥1.5mg/L时，白樱花的生根率可以达到100％，但是为了节约成本，进行工厂化生成，可以将IBA和NAA的浓度控制在1.0-1.5之间，生根率可以达到98％以上。

[0064] 实施例5

[0065] 重复实施例1操作过程，将培养基中的蔗糖用白砂糖替代；将增殖培养时的单瓶接种数量由原来的5株变为单瓶接种8株；将生根培养时的单瓶接种数量由原来的6株变为10株；继代和生根周期变为26±2d。增殖系数变为5.5；生根率变为95.5％。与实施例1中周期28±2d时增殖系数为5.85，生根率为98％相差不多，但是单瓶接种数量，降低了生产成本，更适合工厂化生成。

[0066] 利用樱花的组织培养和快速繁殖获得的组培苗，与传统的樱花扦插、嫁接繁殖方法相比具有抗病性强、生长整齐一致等优点。跟国内外同类生产方法相比，我们更针对生产实际，充分考虑了组培生产周期长和生产成本高的问题。通过改进组培方法和生产流程，降低了组培生产成本，为短时间内提供市场大量健康、优质的樱花苗木提供可能。

[0067] 以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。