一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针及其应用转让专利
申请号 : CN201610870952.8
文献号 : CN106543251B
文献日 : 2018-11-30
发明人 : 张培盛
申请人 : 湖南科技大学
摘要 :
本发明公开了一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针及其应用。相比于现有的荧光检测技术，本发明的荧光探针能够快速的定位于肝细胞中，并能够对其中的一氧化氮进行原位高选择性实时的检测，另外，该探针还具有优良的水溶性、光稳定性，生物兼容性，较高的一氧化氮选择性，不受其他活性氧和活性氮等生物体内常见物种的干扰。在分析化学、生命科学、以及医学等技术领域有着巨大的应用前景。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无明显的毒副作用。
权利要求 :
1.一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针的分子通式是Gal-RHB，结构式为：。
2.一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针的制备，是通过以下步骤实现的：（1）将4-氨基-3-硝基苯酚和溴乙炔加入到丙酮中，再加入碳酸钾，加热回流反应10-20小时，除去溶剂，经过硅胶柱层析纯化，得到产物1；
（2）将产物1溶于1,4-二氧六环中，加入氯化亚锡，反应20-30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物2；
（3）将四乙酰基-α-D-溴化半乳糖和叠氮化钠溶解到二甲基亚砜中，室温反应20~
50min, 经过硅胶柱层析纯化，得到产物3；
（4）将罗丹明B溶解到二氯乙烷中，加入三氯氧磷，回流10-20小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物4；
（5）将产物4和产物2溶解到乙腈中，回流8-15小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物5；
（6）将产物5和产物3溶解到四氢呋喃和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和五水合硫酸铜，室温反应20-30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物6；
（7）将产物6和乙醇钠溶解到乙醇中，室温反应20 30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到~一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针；
所述制备方法具体的反应过程如下：
；
所述的荧光探针的分子通式是Gal-RHB，结构式为：。
说明书 :
一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分析化学、生命科学以及医学等技术领域，具体来说，涉及水溶性荧光探针在检测肝细胞中一氧化氮的应用。
背景技术
[0002] 一氧化氮（NO）作为信使分子在生理学和生物学上起着非常重要的作用，它的含量发生紊乱会与很多疾病有密切关系。因此进一步了解一氧化氮的功能和对一氧化氮的检测在生物研究和医疗诊断中有着重要的意义。另外，一氧化氮的变化可以反映人体的健康状况。肝组织是生物体重要组成部分之一，它在生物体中起着防止被氧化，生物体内一些物质的转化,同时具有分泌一些生物体内的蛋白质的功能。然而肝组织功能紊乱可能会引起多种疾病，如肝纤维化，糖尿病和肝癌等重大疾病。已经有大量的研究表明肝组织的这些疾病都会伴随着一氧化氮产生，同时一氧化氮过量也会诱导产生这些疾病。所以一氧化氮的恒定对于肝组织来说起着非常重要的作用，因此设计灵敏度高、特异性好的一氧化氮荧光探针具有重要意义。特别是特异性检测特定细胞组织中一氧化氮的小分子探针，对于研究一氧化氮在细胞内的分布情况及在生命活动中发挥的作用具有重要的意义。
[0003] 目前，一些专利中也有报道检测一氧化氮的小分子荧光探针，如专利CN102617467A， CN103923641A，CN104194773A，CN105153214A，CN103073538A等，虽然这些专利中所涉及的一氧化氮小分子荧光探针均利用邻苯二胺与一氧化氮的反应特性而实现
对一氧化氮的检测，特异性好，灵敏度高。但其以邻苯二胺为识别基团，不具备肝细胞组织特异性定位功能，并且这些小分子荧光探针水溶性差，需要有机溶剂的参与。众所周知，有机溶剂因为其生物毒性，在生物方面的应用被极大的限制。此外，细胞内一氧化氮产生量较少，且性质活泼，实现肝癌细胞内一氧化氮的荧光检测具有一定的难度，因此设计灵敏度高、特异性好、无毒副作用的水溶性一氧化氮小分子荧光探针具有重要意义。特别是特异性检测特定细胞组织中一氧化氮的小分子探针，对于研究一氧化氮在细胞内的分布情况及在生命活动中发挥的作用具有重要的意义。
对一氧化氮的检测，特异性好，灵敏度高。但其以邻苯二胺为识别基团，不具备肝细胞组织特异性定位功能，并且这些小分子荧光探针水溶性差，需要有机溶剂的参与。众所周知，有机溶剂因为其生物毒性，在生物方面的应用被极大的限制。此外，细胞内一氧化氮产生量较少，且性质活泼，实现肝癌细胞内一氧化氮的荧光检测具有一定的难度，因此设计灵敏度高、特异性好、无毒副作用的水溶性一氧化氮小分子荧光探针具有重要意义。特别是特异性检测特定细胞组织中一氧化氮的小分子探针，对于研究一氧化氮在细胞内的分布情况及在生命活动中发挥的作用具有重要的意义。
发明内容
[0004] 针对于目前小分子荧光探针存在的不能特异性识别细胞组织，并且水溶性差，因有机溶剂导致的毒副作用等缺点，本发明的目的是提供一种特异性检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针及其应用，该水溶性荧光探针是以4-氨基-3-硝基苯酚、溴乙炔、四乙酰基-α-D-溴化半乳糖、叠氮化钠、罗丹明B、抗坏血酸钠为原料合成的水溶性荧光探针。进一步应用研究表明，该荧光探针能够实现对一氧化氮的高灵敏度、高选择性的快速检测。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案：一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针，其分子通式是Gal-RHB，结构式为：
[0006] 。
[0007] 一种检测肝细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针的制备，是通过以下步骤实现：
[0008] （1）将4-氨基-3-硝基苯酚和溴乙炔加入到丙酮中，再加入碳酸钾，加热回流反应10-20小时，除去溶剂，经过硅胶柱层析纯化，得到产物1；（2）将产物1溶于1,4-二氧六环中，加入氯化亚锡，反应20-30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物2；（3）将四乙酰基-α-D-溴化半乳糖和叠氮化钠溶解到二甲基亚砜中，室温反应20 50min, 经过硅胶柱层析纯化，得~
到产物3；（4）将罗丹明B溶解到二氯乙烷中，加入三氯氧磷，回流10-20小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物4；（5）将产物4和产物2溶解到乙腈中，回流8-15小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物5；（6）将产物5和产物3溶解到四氢呋喃和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和五水合硫酸铜，室温反应20-30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物6；（7）将产物6和乙醇钠溶解到乙醇中，室温反应20 30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到检测肝细胞中一氧化氮~
的水溶性荧光探针。
到产物3；（4）将罗丹明B溶解到二氯乙烷中，加入三氯氧磷，回流10-20小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物4；（5）将产物4和产物2溶解到乙腈中，回流8-15小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物5；（6）将产物5和产物3溶解到四氢呋喃和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和五水合硫酸铜，室温反应20-30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到产物6；（7）将产物6和乙醇钠溶解到乙醇中，室温反应20 30小时，经过硅胶柱层析纯化，得到检测肝细胞中一氧化氮~
的水溶性荧光探针。
[0009] 所述的荧光探针在检测生理体系中一氧化氮的应用。
[0010] 所述的荧光探针在检测肝癌细胞中一氧化氮的应用。
[0011] 所述的荧光探针在靶向肝癌细胞中一氧化氮及生物成像中的应用。
[0012] 一种检测肝癌细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针，是通过以下步骤实现的：
[0013] 将4-氨基-3-硝基苯酚和溴乙炔加入到丙酮中，再加入碳酸钾，加热回流反应10-20小时，除去溶剂，经过硅胶柱层析，得到产物1；将产物1溶于1,4-二氧六环中，加入氯化亚锡，反应20-30小时，经过硅胶柱层析，得到产物2；将四乙酰基-α-D-溴化半乳糖和叠氮化钠溶解到二甲基亚砜中，室温反应20 50min, 经过硅胶柱层析，得到产物3；将罗丹明B溶解到~
二氯乙烷中，加入三氯氧磷，回流10-20小时，经过硅胶柱层析，得到产物4；将产物4和产物2溶解到乙腈中，回流8-15小时，经过硅胶柱层析，得到产物5；将产物5和产物3溶解到四氢呋喃和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和五水合硫酸铜，室温反应20-30小时，经过硅胶柱层析，得到产物6；将产物6和乙醇钠溶解到乙醇中，室温反应20 30小时，经过硅胶柱层析，~
得到目标产物Gal-RHB。
二氯乙烷中，加入三氯氧磷，回流10-20小时，经过硅胶柱层析，得到产物4；将产物4和产物2溶解到乙腈中，回流8-15小时，经过硅胶柱层析，得到产物5；将产物5和产物3溶解到四氢呋喃和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和五水合硫酸铜，室温反应20-30小时，经过硅胶柱层析，得到产物6；将产物6和乙醇钠溶解到乙醇中，室温反应20 30小时，经过硅胶柱层析，~
得到目标产物Gal-RHB。
[0014] 根据上述制备方法制备的水溶性荧光探针，其具体的反应过程如下：
[0015]
[0016] 本发明采用将4-氨基-3-硝基苯酚、溴乙炔、四乙酰基-α-D-溴化半乳糖、叠氮化钠、罗丹明B、抗坏血酸钠为原料合成来制备所需要的水溶性荧光探针，该水溶性探针会随着一氧化氮浓度的增加出现显著的荧光增强现象，而且该荧光探针对一氧化氮的检测具有明显的高选择性响应，并且能达到高灵敏度检测的效果。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光化学探针成本投入较少，合成路线简单、后处理方便、可直接对肝癌细胞中一氧化氮实现快速特异性识别，适合放大生产和实际应用。尤其是在肝细胞中一氧化氮的检的应用有着极其重要的意义。
附图说明
[0017] 图1为制备的水溶性荧光探针的核磁图。
[0018] 图2为不同一氧化氮浓度时，荧光探针的荧光发射光谱变化图（λex = 550 nm），-6 -5 -5 -5[NO] = 0（a）、5×10 mol/L（b）、1×10 mol/ L（c）、1.5×10 mol/ L（d）、2×10 mol/ L（e）、2.5 ×10-5 mol/ L（f）、3×10-5 mol/ L（g）、3.5×10-5 mol/ L（h）、4×10-5 mol/ L（i）、4.5×10-5 mol/ L（j）、5×10-5 mol/ L（k）、5.5×10-5 mol/ L（l）、6×10-5 mol/ L（m）、
7×10-2 mol/ L（n）、8×10-2 mol/L（o）、9×10-2 mol/ L（p）、1×10-1 mol/ L（q）（注：该荧光探针浓度为5 μM，是用pH为7的缓冲溶液配制）。
7×10-2 mol/ L（n）、8×10-2 mol/L（o）、9×10-2 mol/ L（p）、1×10-1 mol/ L（q）（注：该荧光探针浓度为5 μM，是用pH为7的缓冲溶液配制）。
[0019] 图3为各种离子对该荧光探针荧光强度的选择性对比数据图，加入后的离子的浓度均为5.0×10-5 mol/L，F0和F为各离子和过氧化物加入前后的荧光探针在以550 nm为激发波长，580 nm为发射波长处的荧光强度变化值（注：该荧光探针浓度为5 μM，是用pH为7缓冲溶液溶液配制）。
[0020] 图4为各种干扰物对荧光探针的荧光强度的干扰性对比数据图，加入后的各种离子的浓度均为5.0×10-5 mol/L，F0和F为各离子和过氧化物加入前后的荧光探针在以550 nm为激发波长，580 nm为发射波长处的荧光强度变化值（注：该荧光探针浓度为5 μM，是用pH为7缓冲溶液溶液配制）。
[0021] 图5是实施例1制备的Gal-RHB荧光探针对肝癌细胞（HePG2细胞）中一氧化氮的激光共聚焦成像。
具体实施方式
[0022] 下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0023] 实施例1：
[0024] 一种检测肝癌细胞中一氧化氮的水溶性荧光探针的制备，包括以下步骤：
[0025] （1）产物1的制备。
[0026] 将4-氨基-3硝基苯酚(3.0 mmol)加入20 mL丙酮中,然后加入溴代丙炔(4.5 mmol),搅拌均匀之后再加入K2CO3 (6.0 mmol)。加热回流反应14小时。待反应结束后停止，过滤，用二氯甲烷洗涤3-4次，然后用旋转蒸发仪浓缩过滤之后的滤液，再用层析硅胶法过柱,得到产物1。
[0027] 产物1 (1.2 mmol)溶于1,4-二氧六环(15 mL)中，然后用恒压滴液漏斗滴加二水合二氯亚锡(1.35 g, 6.0 mmol)和浓盐酸(3.0 mL)的混合物。待混合液滴加结束之后，在室温条件下反应48小时。待反应完全后，用氢氧化钠的水溶液中和反应液至中性。然后用二氯甲烷萃取四次(4×15 mL)，收集多次萃取的有机层，接着用无水硫酸钠干燥，然后用旋转蒸发仪旋干溶剂，最后粗产物通过层析硅胶柱来提纯得到产物2。
[0028] 将四乙酰基-α-D-溴化半乳糖(2.0 mmol)加入到干燥的二甲基亚砜(3 mL)，然后在避光的条件下加入NaN3(11 mmol)，将反应液在避光的室温条件下搅拌30分钟，反应完全之后。用15 mL蒸馏水稀释反应液，然后用40 mL乙酸乙酯萃取三次，收集有机层并用无水硫酸钠干燥，用旋转蒸发仪在真空下除去溶剂。用层析硅胶法过柱提纯，得到产物3。
[0029] 将罗丹明B(0.21 mmol)加入到1,2-二氯乙烷(10 mL)，然后加入1mL的三氯氧磷，在室温下搅拌5分钟。最后加热反应液使之回流反应4小时。然后将反应液冷却到室温，用旋转蒸发仪在真空下除去溶剂和三氯氧磷，得到产物4。
[0030] 用干燥的二氯甲烷溶解产物4 (0.21 mmol)，再往反应液中快速地加入干燥的三乙胺(1 mL)。然后在室温的条件下搅拌反应14小时。反应结束后，旋转蒸发仪除去大部分溶剂，初产物用层析硅胶法过柱提纯，得到产物5。
[0031] 把产物5(0.10 mmol)和四乙酰基-α-D-溴化半乳糖(0.20 mmol)加入到四氢呋喃和蒸馏水(V/V, 5 mL/2 mL)的混合液，通入氮气保护，然后加入抗坏血酸钠(6.0 mg, 0.03 mmol)，CuSO4·5H2O (3.75 mg, 0.015 mmol)，反应液在常温下搅拌24小时，反应结束后，反应混合液用蒸馏水洗三次，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸镁干燥，然后过滤取滤液。旋转蒸发仪在真空下旋干溶剂。初产物用层析硅胶法过柱提纯，得到产物6。
[0032] 把产物6 (0.105 mmol)加入到8mL的无水乙醇中，然后加入甲醇钠(1.26 mmol)，在常温的条件下搅拌反应24小时，待充分反应之后。用1 M的HCl水溶液将反应液中和至中性，用旋转蒸发仪在真空下旋干溶剂，初产物用硅胶法过柱提纯，得到目标产物Gal-RHB。
[0033] 实施例2：一氧化氮的检测实验。
[0034] 取17个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的溶液3 mL（该荧光探针浓度为5 μM，是用pH为7的水溶液配制），然后分别将浓度为[NO] = 0（a）、5×10-3 mol/L（b）、1×10-2 mol/ L（c）、1.5×10-2 mol/ L（d）、2×10-2 mol/ L（e）、2.5 ×10-2 mol/ L（f）、3×10-2 mol/ L（g）、3.5×10-2 mol/ L（h）、4×10-2 mol/ L（i）、4.5×10-2 mol/ L（j）、5×10-2 mol/ L（k）、5.5×10-2 mol/ L（l）、6×10-2 mol/ L（m）、7×10-2 mol/ L（n）、8×10-2 mol/L（o）、9×10-2 mol/ L（p）、1×10-1 mol/ L（q）的3 µL次一氧化氮液加入17个样品瓶中，常温下搅拌10 min后，以550 nm为激发波长，分别测定这些样品的荧光强度，得17个样品的荧光发射光谱变化图，见图2。测定结果表明：该荧光探针的荧光强度随着一氧化氮浓度的逐渐增加而逐步上升。
[0035] 实施例3：其它离子和过氧化物影响的选择性检测实验。
[0036] 取18个5 mL样品瓶，分别装入实施例1中所得的荧光探针溶液3 mL（该荧光探针浓度为5 μM，是用pH为7的水溶液配制），然后分别将浓度为5.0×10-2 mol/L的（H2O2、HClO、1O2、AA、NO、NO3-、NO2-、OH.、GSH、Cys、CNS-、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Ca2+）各取3µL加入另外前18个样品瓶中，18号样品为空白样。然后分别测定18个样品在550 nm波长激发，580 nm波长发射处的荧光发射强度，结果见图3。测定结果表明：除了一氧化氮外，其它上述各种离子和过氧化物对所制备的荧光探针的荧光强度没有明显影响。
[0037] 实施例4：其它离子和过氧化物共存的影响的对比检测实验。
[0038] 取18个5 mL样品瓶，分别装入实施例1中所得的荧光探针溶液3 mL（该荧光探针浓1
度为5 μM，是用pH为7的水溶液配制），先分别向前17个样品加入NO，然后将H2O2、HClO、O2、AA、NO3-、NO2-、OH.、GSH、Cys、CNS-、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Ca2+依次加入到1到16号样品瓶中，其中各离子和过氧化物浓度均为为5.0×10-2 mol/L，加入的量均为3 µL。然后分别测定18个样品在550 nm波长激发，580 nm波长发射处的荧光发射强度，结果见图4。测定结果表明：
其它上述各种离子和过氧化物共存时对所制备的荧光探针的荧光强度没有明显影响。
度为5 μM，是用pH为7的水溶液配制），先分别向前17个样品加入NO，然后将H2O2、HClO、O2、AA、NO3-、NO2-、OH.、GSH、Cys、CNS-、Mn2+、Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Ca2+依次加入到1到16号样品瓶中，其中各离子和过氧化物浓度均为为5.0×10-2 mol/L，加入的量均为3 µL。然后分别测定18个样品在550 nm波长激发，580 nm波长发射处的荧光发射强度，结果见图4。测定结果表明：
其它上述各种离子和过氧化物共存时对所制备的荧光探针的荧光强度没有明显影响。
[0039] 实施例5：Gal-RHB对肝癌细胞中一氧化氮的荧光显微成像
[0040] 向含有肝癌细胞株（HePG2）的培养皿中，加入浓度为0.05-0.1M的Gal-RHB的水溶液，与细胞培养液混合均匀后，使Gal-RHB在培养液中的终浓度达到5 µM。染色5min后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，然后将该培养皿置于37℃恒温培养箱中进行孵育24小时，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。结果如图5所示。 实验结果发现，染有Gal-RHB的肝癌细胞中呈现出较强的红色荧光，实验结果表明Gal-RHB具有较好的细胞膜透过性，能够定位于肝癌细胞中。Gal-RHB能够用于肝癌细胞中内源性的一氧化氮进行检测。
[0041] 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明所作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。