细胞-生物材料复合支架及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种细胞‑生物材料复合支架，所述复合支架包括支架基体和可缓慢释放细胞的粘性细胞悬液，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形成，其中，A为支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙间形成的混合层，n为3‑20的正整数；所述粘性细胞悬液包括细胞、负载细胞的载体和水，所述载体为生物相容性粘性材料。细胞在该复合支架上的分布密度可控、粘附率和细胞存活率均较好，可解决细胞在三维复合支架上生长缓慢、增殖和分化弱、促进组织再生能力弱的问题。本发明还提供了该复合支架的制备方法及应用。

权利要求

1.一种细胞-生物材料复合支架，其特征在于，所述复合支架包括支架基体和可缓慢释放细胞的粘性细胞悬液，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为由支架基体形成的支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙间形成的混合层，n为3-20的正整数；所述粘性细胞悬液包括细胞、负载细胞的载体和水，所述载体为生物相容性粘性材料，所述细胞负载在所述载体中，未接触到所述支架基体，所述混合层通过三维打印法制得。

2.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架中，所述细胞的分布密度5

为(4-10)×10个/支架；所述细胞包括骨髓干细胞、成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞和骨肉瘤细胞中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述粘性细胞悬液的粘度为80-200Pa·s。

4.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述粘性细胞悬液中，载体的质量分数为10-50％；所述载体包括透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖的一种或多种。

5.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述支架基体的原料为粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：交联剂：10-50％；

无机粘土：3-20％；

紫外光引发剂：0.05-0.1％；

水：30-86％；上述各原料组分的总质量百分含量为100％；其中，所述交联剂为带碳碳双键的生物相容大分子，所述生物相容大分子为聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶和透明质酸中的一种或多种。

6.如权利要求5所述的复合支架，其特征在于，所述交联剂的分子链的至少一端带有碳碳双键，所述交联剂的分子链中间为聚乙二醇的主链结构；所述聚乙二醇的主链结构的分子量为1000-10000。

7.一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将支架基体的原料配制成支架基体前驱体浆料；提供粘性细胞悬液，所述粘性细胞悬液包括细胞、可缓慢释放细胞的载体和水，所述载体为生物相容性粘性材料，所述细胞负载在所述载体中；

(2)采用多通道三维打印法进行打印，其中，一个通道用于控制所述粘性细胞悬液的打印，其余至少一个通道用于控制所述支架基体浆料的打印；

先打印所述支架基体前驱体浆料形成所述复合支架前驱体的底层，从第二层开始，交叉打印所述支架基体前驱体浆料与粘性细胞悬液，使所述粘性细胞悬液交叉排布在所述支架基体前驱体的空隙之间，形成一混合层，重复所述混合层的打印n次；最后打印所述粘性细胞悬液形成所述复合支架前驱体的顶层，得到细胞-生物材料复合支架前驱体，所述复合支架前驱体自底部自上形成A’C’nB的排布形式，其中，A’为支架基体前驱体层，B为粘性细胞悬液层，C’为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体前驱体的空隙间形成的混合层，n为3-20的正整数；

(3)将打印完的所述复合支架前驱体进行固化，得到细胞-生物材料复合支架，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙之间形成的混合层，所述细胞未接触到所述支架基体，n为3-20的正整数。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述三维打印开始前，校正打印中所用到的各通道的位置，以最先出料的所述支架基体前驱体浆料的枪头为基准，使与所用到的各通道相连的所有枪头的底部均在同一水平线上。

9.如权利要求1-6任一项所述的细胞-生物材料复合支架或如权利要求7-8任一项所述的细胞-生物材料复合支架的制备方法在制备组织修复材料中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，包括以下步骤：

取所述细胞-生物材料复合支架，加入细胞培养基，使其浸没于所述细胞培养基中，在

25-37℃下进行培养，使负载于所述载体中的细胞缓慢释放出来，并扩增、粘附于所述复合支架上，得到粘附细胞的细胞-生物材料复合支架。

说明书

细胞-生物材料复合支架及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种细胞-生物材料复合支架及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。其中，以生物材料为基础的支架材料的选择和构建是关键环节，将正常人体细胞种植到具有生物相容性的支架材料，待其在支架上增殖、分化至一定程度后，可以将粘附细胞的支架植入组织缺损或损失部位，达到组织修复的目的。理想的组织工程支架材料除了应具备优良的生物相容性、生物活性、可降解性以及良好的孔隙结构和力学性能外，还应该具备进一步促进细胞的黏附、增殖和分化，促进组织的再生等的能力。

[0003] 目前，制备组织工程支架的方法有很多，其中主流的三维打印技术虽然已经实现了按需制造任意形状的支架，但是构建出来的支架孔隙尺寸较大，无法获得微观尺寸的微孔，不能提供利于细胞生长的三维支撑环境，细胞在三维支架上的粘附率较低，大部分细胞在接种时落在培养皿中。因此，如何增强细胞在三维支架上的粘附程度，并精确控制不同种类细胞的在三维尺寸上的分布，通过体外培养获得与动物甚至人体组织或器官相似的三维构造体是目前三维打印技术应用于组织工程中所面临的一大难题。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明提供了一种细胞-生物材料复合支架及其制备方法，所述复合支架包括具有可设计性的三维支架基体，以及打印在三维支架基体上的可缓慢释放细胞的粘性细胞悬液，所述复合支架可以提高细胞在其上的粘附率、活性等。所述复合支架的制备方法中，首次将细胞与支架基体一起打印，其可控度高，细胞在复合支架上的粘附率和细胞存活率均较好。

[0005] 第一方面，本发明提供了一种细胞-生物材料复合支架，所述复合支架包括支架基体和可缓慢释放细胞的粘性细胞悬液，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为由支架基体形成的支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙间形成的混合层，n为3-20的正整数；所述粘性细胞悬液包括细胞、负载细胞的载体和水，所述载体为生物相容性粘性材料。

[0006] 本申请第一方面提供的所述复合支架包括支架基体，以及在所述支架基体上特定分布的粘性细胞悬液，该复合支架可以精确控制细胞在其上的分布状况等，增强细胞在其上的分布密度、粘附程度等，在所述复合支架用于组织工程支架中时，被负载的细胞可被缓慢释放出来，并粘附于所述支架基体的表面，生长、分化等，可解决细胞在三维复合支架上生长缓慢、增殖和分化弱、促进组织再生能力弱的问题。

[0007] 优选地，所述n为3-8的正整数。

[0008] 所述混合层中，粘性细胞悬液交叉分布在支架基体的空隙处，这样不致于影响支架基体结构。此时，由于细胞被负载在所述粘性细胞悬液中，未与所述复合支架相粘附，待后期对所述复合支架加入培养基进行培养后，细胞被缓慢释放出来，并粘附于所述复合支架的表面。

[0009] 所述细胞-生物材料复合支架的形状与三维打印时的程序设计有关，可根据不同需求设计程序，打印出不同形貌的三维复合支架。

[0010] 优选地，所述复合支架为规则的几何体(如长方体、正方体、圆柱体等，但不限于此)以及其他不规则的三维多孔结构。

[0011] 优选地，所述复合支架为立方体，其底面边长为10-30mm，高度为3-20mm，行间距为0.2-0.5mm。

[0012] 在本发明一实施例中，所述复合支架的大小为15mm×15mm的立方体，层数为5-10层。

[0013] 优选地，所述粘性细胞悬液的粘度为80-200Pa·s。所述粘性细胞悬液的粘度若太低，仍具有流动性，无法达到逐步释放细胞的目的；若其粘度过高，在进行三维打印时所采用的打印压力较大，对细胞损伤过大，影响细胞的存活率、生物活性等。

[0014] 优选地，所述复合支架中，所述细胞的分布密度为(4-10)×105个/支架。该分布密度与支架大小有关，可根据支架的形状参数(如长度、高度、宽度或直径等)来进行相应调整。

[0015] 所述细胞的种类根据所述复合支架的应用场所来决定。当所述复合支架用作骨组织工程支架中，所述细胞包括骨髓干细胞、成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞和骨肉瘤细胞中的一种或多种，但不限于此。

[0016] 优选地，所述粘性细胞悬液中，所述细胞被负载在所述载体中，未接触到支架基体。

[0017] 优选地，所述载体包括透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖的一种或多种。所述载体为生物相容性较好的材料，具有一定的粘度，并能溶解在水中，从而实现打印后的复合支架在细胞培养过程中，将细胞缓慢释放于支架上的目的。

[0018] 在本发明一实施例中，所述可缓慢释放细胞的载体为透明质酸。

[0019] 优选地，所述粘性细胞悬液中，载体的质量分数为10-50％。

[0020] 优选地，所述粘性细胞悬液中，细胞的密度为(0.5-10)×106个/mL。进一优选为(2-8)×106个/mL。更优选为4×106个/mL。

[0021] 优选地，所述支架基体层A中的支架基体与所述混合层C中的支架基体可以相同或不同。

[0022] 在本发明一实施方式中，所述支架基体的原料包括天然高分子、合成高分子、生物陶瓷的一种或多种，其中，所述天然高分子包括血纤蛋白、明胶、胶原、壳聚糖、透明质酸、透明质酸钠和海藻酸盐中的至少一种；所述合成高分子包括聚乳酸(PLA)、聚氨基酸、聚羟基乙酸(PGA)、聚乙烯醇(PVA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚己内酯中的至少一种；所述生物陶瓷包括羟基磷灰石、磷酸八钙、磷酸钙、偏磷酸钙、磷酸三钙和生物活性玻璃中的至少一种。所述生物活性玻璃含有Sr、B、Cu、P、Mg等元素。

[0023] 进一步优选地，所述支架基体的原料为所述天然高分子和/或合成高分子与所述生物陶瓷的混匀物。即，所述天然高分子和合成高分子中的一种或两种与所述生物陶瓷的混匀物。

[0024] 在本发明另一实施方式中，所述支架基体为凝胶支架。优选地，所述三维凝胶支架由无机粘土、交联剂(带碳碳双键的生物相容大分子)、紫外光引发剂通过紫外光聚合而成。

[0025] 优选地，所述支架基体的原料为粘土基水凝胶基质，包括如下质量百分含量的原料组分：

[0026] 交联剂：10-50％；

[0027] 无机粘土：3-20％；

[0028] 紫外光引发剂：0.05-0.1％；

[0029] 水：30-86％；

[0030] 上述各原料组分的总质量百分含量为100％；其中，所述交联剂为带碳碳双键的生物相容大分子，所述生物相容大分子为聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、透明质酸中的一种或多种。

[0031] 本发明通过上述特定质量配比的各种原料的协同作用，获得的所述粘土基水凝胶基质(即粘土基水凝胶打印浆料)具有适宜的打印粘度和强度，在紫外光交联前具有一定的预形状。在常温下可以将所述粘土基水凝胶基质打印成力学强度、拉伸性能较好的稳定凝胶支架前驱体，便于后期对凝胶复合支架前驱体进行统一的紫外光固化，得到三维凝胶复合支架。所述粘土基水凝胶基质适用于批量打印制得三维打印凝胶支架，大大提高了三维打印效率，非常适合工业化生产。

[0032] 在紫外光的作用下，本申请的所述粘土基水凝胶基质中，所述交联剂的碳碳双键之间发生交联，形成的聚合物长链穿插在无机粘土的有序片层结构中，形成三维网络结构的水凝胶，使得凝胶形状得以保持，同时无机粘土也充当物理交联的作用，其与带碳碳双键的生物相容大分子之间形成的氢键作用、范德华力等，也使得打印出的三维凝胶支架的强度进一步提高，充分发挥物理交联与化学交联的协同效应。提高凝胶支架的稳定性。

[0033] 所述无机粘土可以选自高岭土、膨润土、蒙脱土、锂皂石(laponite，锂藻土)、锂蒙脱石(hectorite)、贝得石、皂石、硅镁石、硅酸镁铝、其它硅酸铝和各种其它天然和/或合成的粘土，以及它们的组合。

[0034] 优选地，所述无机粘土的粒径不超过500nm。进一步优选为50-200nm。

[0035] 在本发明的一优选实施方式中，所述无机粘土为锂皂石粘土。该锂皂石粘土可以在水中快速剥离分散成单片层，形成无色透明的胶体分散液，稳定性好。该粘土可以为购买自Rockwood公司的Laponite XLG。Laponite XLG是合成的层状粘土(layeredclay)，与天然蒙脱石类似。

[0036] 本申请中，无机粘土的加入，可有效提高水凝胶支架的强度，无机粘土相当于充当了物理交联剂的作用。此外，控制所述无机粘土的含量可以调控所述粘土基水凝胶基质的粘度，使所述粘土基水凝胶基质具有一定的预形状，可以实现先打印后固化。

[0037] 优选地，所述粘土基水凝胶基质的粘度为30-350Pa·s。待打印的所述粘土基水凝胶基质应该具有一定的粘度，粘度过高，流动性较差，打印时需要的压力过大，且材料不容易混匀；溶液黏度过低，流动性太高，打印时塑形困难，支架会发生塌陷，无法保持预形状。本申请中，将无机粘土的含量控制在3％-20％之间，可以使所述粘土基水凝胶基质的粘度控制在30-350Pa·s。

[0038] 进一步优选地，所述无机粘土的质量百分含量为5-15％。更优选为8-15％。当所述无机粘土的质量百分含量提高至8％以上，所述粘土基水凝胶基质达到较高的黏度，其打印成的凝胶支架前驱体经固化后，凝胶支架的拉伸率可以达到5000％左右，力学强度有了明显提高。

[0039] 优选地，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

[0040] 交联剂：10-50％；

[0041] 无机粘土：5-15％；

[0042] 紫外光引发剂：0.05-0.1％；

[0043] 水：35-84％；

[0044] 上述各原料组分的总质量百分含量为100％。

[0045] 进一步优选地，所述粘土基水凝胶基质的粘度为50-250Pa·s。更优选为100-200Pa·s。

[0046] 本申请中，带碳碳双键的生物相容大分子的成胶效果较好，在所述无机粘土与水形成的分散液中，不需要额外添加化学交联剂，经紫外光聚合，即可得到强度较高的凝胶结构。形成的三维凝胶支架基体的毒性低，细胞相容性好。在提供细胞生长所需的三维环境的同时，对细胞起到促进其黏附、生长与增殖的作用。

[0047] 在本发明一实施方式中，所述交联剂的分子链的至少一端带有碳碳双键。所述交联剂可以为甲基丙烯酸、丙烯酸或聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)修饰的明胶、透明质酸、聚乙烯醇、聚乙烯醇等。例如可以是甲基丙烯酸修饰的明胶，丙烯酸修饰的透明质酸、甲基丙烯酸修饰的聚乙烯醇、低分子量(分子量小于1000道尔顿)的PEGDA修饰的壳聚糖等。

[0048] 在本发明另一实施方式中，所述交联剂的分子链的至少一端带有碳碳双键，所述交联剂的分子链中间为聚乙二醇的主链结构。

[0049] 进一步优选地，所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯。

[0050] 所述交联剂除了可促进凝胶形成、提高凝胶力学强度外，还可以通过控制其分子量和固含量，以达到控制细胞在制得的支架上黏附、生长、增殖甚至分化等目的。例如，聚乙二醇分子量为4000，固含量为20％时，细胞能够在支架上黏附及伸展情况良好；但当聚乙二醇的分子量为10000以上时，细胞在支架上成球形，不能很好地展开，细胞增殖行为相对较弱。

[0051] 优选地，所述交联剂中，聚乙二醇的主链结构的分子量为1000-10000。例如可以为2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000或9000。进一步优选为2000-8000。

[0052] 本申请中，所述交联剂的质量百分含量为10-50％。例如可以为15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。进一步优选为20-40％。

[0053] 优选地，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

[0054] 交联剂：20-40％；

[0055] 无机粘土：3-20％；

[0056] 紫外光引发剂：0.05-0.1％；

[0057] 水：40-76％；

[0058] 上述各原料组分的总质量百分含量为100％。

[0059] 进一步优选地，所述粘土基水凝胶基质包括如下质量百分含量的原料组分：

[0060] 交联剂：20-40％；

[0061] 无机粘土：5-15％；

[0062] 紫外光引发剂：0.05-0.1％；

[0063] 水：45-74％；

[0064] 上述各原料组分的总质量百分含量为100％。

[0065] 本申请中所选用的紫外光引发剂为生物相容性良好的引发剂，其用量极少，且几乎不会对后期复合支架的细胞实验产生影响。

[0066] 在本发明一实施方式中，所述紫外光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。紫外光引发剂还可以为1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2’，2’-二甲基乙酮(Irgacure2959)、1-羟基环己基苯基酮、α,α’-二甲氧基-α-苯基苯乙酮和2-甲基-1-(4-甲硫基苯基)-2-吗啉-1-丙酮中的一种或多种。并不限于本申请所列举的这几种。

[0067] 第二方面，本发明提供了一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0068] (1)将支架基体的原料配制成支架基体前驱体浆料；提供粘性细胞悬液，所述粘性细胞悬液包括细胞、可缓慢释放细胞的载体和水，所述载体为生物相容性粘性材料；

[0069] (2)采用多通道三维打印法进行打印，其中，一个通道用于控制所述粘性细胞悬液的打印，其余至少一个通道用于控制所述支架基体前驱体浆料的打印；

[0070] 先打印所述支架基体前驱体浆料形成所述复合支架前驱体的底层，从第二层开始，交叉打印所述支架基体前驱体浆料与粘性细胞悬液，使所述粘性细胞悬液交叉排布在所述支架基体前驱体的空隙之间，形成一混合层，重复所述混合层的打印n次；最后打印所述粘性细胞悬液形成所述复合支架前驱体的顶层，得到细胞-生物材料复合支架前驱体，所述复合支架前驱体自底部自上形成A’C’nB的排布形式，其中，A’为支架基体前驱体层，B为粘性细胞悬液层，C’为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体前驱体的空隙间形成的混合层，n为3-20的正整数；

[0071] (3)将打印完的所述复合支架前驱体进行固化，得到细胞-生物材料复合支架，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体的空隙之间形成的混合层，n为3-20的正整数。

[0072] 优选地，步骤(3)中，所述固化方式为紫外光固化、热固化、离子交联或冷冻干燥。所述固化方式根据所述支架基体的原料来定。可以根据支架基体的原料对光、热、离子等是否敏感来选择固化方式。例如，对于凝胶支架的原料体系来说，可以采用紫外光固化或热固化；对于含海藻酸盐的支架基体的原料体系来说，采用二价离子交联法进行固化；对于生物陶瓷来说，可以采用冷冻干燥法来固化。

[0073] 进一步优选地，所述固化方式为紫外光固化。该固化方式较温和，对细胞的损伤相对较少。

[0074] 优选地，在所述步骤(3)之后，还包括：

[0075] (4)取所述复合支架，加入细胞培养基，使其浸没于所述细胞培养基中，在25-37℃下进行培养，使负载于所述载体中的细胞缓慢释放出来，并扩增、粘附于所述复合支架上，得到粘附细胞的细胞-生物材料复合支架。浸没于培基中培养时，最终得到的粘附细胞的细胞-生物材料复合支架上是没有粘性细胞悬液的，粘性细胞悬液已经逐渐溶解在培养基中，只剩下支架以及粘附在支架上的细胞。

[0076] 优选地，步骤(4)中，所述细胞培养基为α-MEM培养基。可以根据所述细胞的种类再添加其他营养物质。

[0077] 优选地，所述培养的时间为1-30天。进一步优选为5-10天或18-25天。一般而言，细胞会在七天昨天基本长满支架；对于观察细胞在支架上的分化来说，一般是需要培养21天左右。

[0078] 优选地，所述三维打印机的各通道均设置有材料补给腔体，用于补给各通道中的打印原料。

[0079] 优选地，所述三维打印开始前，校正打印中所用到的各通道的位置，以最先出料的所述支架基体前驱体浆料的枪头为基准，使与所用到的各通道相连的所有枪头的底部均在同一水平线上。这样可以便于后期支架基体前驱体浆料与细胞悬液的交叉打印。

[0080] 优选地，所述与各个通道连接的枪头能够相对上下左右移动，并不会受到相互的限制。

[0081] 优选地，所述三维打印过程中的驱动介质为气压或者电压驱动。这样可以对支架基体浆料以及粘性细胞悬液中的细胞均能产生作用力，同时又不会对它们造成伤害。

[0082] 优选地，所述三维打印过程中，使相邻层的孔交错排列且相互对应连通。

[0083] 优选地，所述三维打印是在生物安全柜中进行。这样可以以确保整体操作环境无菌。

[0084] 优选地，所述三维打印过程中，每完成一层所述复合支架前驱体的打印，使与各个通道连接的所有枪头位置上移，所述枪头的上移距离与各通道连接的枪头直径和材料特性有关。

[0085] 进一步优选地，所述枪头的上移距离为所述枪头直径的(0.6-1)倍。

[0086] 例如，采用枪头直径为150μm的枪头打印时，打印出材料的线条粗细为150μm左右，每打印一层，枪头应上移150μm再打印接下来的一层，防止距离移动过小或者过大造成的支架线条间的挤压等；若打印材料的粘度较低(例如对于凝胶基体的浆料来说，若浆料粘度低于30Pa·s时)，支架线条打印出来后容易发生塌陷，高度会低于枪头直径，此时，一层打印结束后，枪头的上移距离应小于枪头直径，从而使得支架的线条间接触良好，不会发生线条脱离现象。

[0087] 本申请中，所述至少一个通道用于控制所述支架基体前驱体浆料的打印，可以是一个通道用于打印某一固定组成的基体前驱体浆料，也可以是由多个通道(2个以上)来打印相同组成不同配比的基体前驱体浆料，还可以是由多个通道来打印不同材料组成的基体前驱体浆料，从而形成不同基体的细胞-生物材料三维复合支架。

[0088] 本申请中，步骤(2)中，所述复合支架前驱体的最下面一层(底层)为单独的支架基体前驱体，自底部向上的第二层开始，所述支架基体前驱体浆料与粘性细胞悬液交叉分布(并排交错分布)，可以先将支架基体前驱体浆料打印成多孔结构，再打印粘性细胞悬液，使粘性细胞悬液交错分布在所述支架基体中形成混合层，这样才完成第二层的打印，重复n次第二层的打印方式，形成所述复合支架前驱体的中间层；在打印所述复合支架前驱体的最上层(顶层)时，单独打印粘性细胞悬液。这样可以提高所述复合支架对细胞的接种密度。

[0089] 优选地，所述n为3-8的正整数。

[0090] 优选地，所述粘性细胞悬液的粘度为80-200Pa·s。

[0091] 优选地，所述载体包括透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖的一种或多种。

[0092] 优选地，所述粘性细胞悬液中，载体的质量分数为10-50％。

[0093] 优选地，所述粘性细胞悬液中，细胞的密度为(0.5-10)×106个/mL。

[0094] 优选地，所述支架基体前驱体浆料为粘土基水凝胶基质，包括如下质量百分含量的原料组分：

[0095] 交联剂：10-50％；

[0096] 无机粘土：3-20％；

[0097] 紫外光引发剂：0.05-0.1％；

[0098] 水：30-86％；

[0099] 上述各原料组分的总质量百分含量为100％；其中，所述交联剂为带碳碳双键的生物相容大分子，所述生物相容大分子为聚乙二醇、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、透明质酸中的一种或多种。

[0100] 采用上述特定配比的无机粘土、交联剂、紫外光引发剂、水构成的所述粘土基水凝胶基质，所述粘土基水凝胶基质的粘度合适，具有一定的预形状，适合连续、批量打印，固化后得到三维凝胶支架，大大提高了三维打印效率。所述三维凝胶支架的制备方法，工艺简单，可控性强，能耗较低，无需改变打印过程中的压力，制造成本低廉，实用性较强。

[0101] 优选地，当所述支架基体前驱体浆料为粘土基水凝胶基质时，所述固化方式为紫外光固化。

[0102] 优选地，所述交联固化的时间为20-50min。

[0103] 优选地，所用紫外光的波长为230-400nm。进一步优选为250-350nm。更优选为254nm。

[0104] 本发明第二方面提供的所述细胞-生物材料复合支架的制备方法，步骤简单、制备条件温和，在复合支架的制备中，首次将细胞悬液与支架基体的原料一起打印，可以构建多种不同细胞和不同支架基体的复合支架体系，精确控制细胞在复合支架上的分布状况，增强细胞在复合支架上的粘附率和细胞存活率。

[0105] 现有技术中通常是先将支架基体原料与细胞悬液混合后形成混合浆料再打印，能满足与细胞混合后再打印的支架基体原料较少，而且混合后会影响细胞在打印成的支架上的活性；混合浆料打印成型后的支架力学强度通常会较低。本申请提供的制备方法的应用范围更多，适用于各种基体材料，易于细胞在支架上的活性保持，最终得到的细胞-生物材料复合支架的力学强度也较高，能很好地满足复合组织工程对材料力学强度的要求。

[0106] 第三方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的细胞-生物材料复合支架或如本发明第二方面所述的粘附细胞-生物材料复合支架的制备方法在制备组织修复材料中的应用。优选为在骨组织工程支架材料中的应用。

[0107] 优选地，所述应用包括以下步骤：

[0108] 取所述细胞-生物材料复合支架，加入细胞培养基，使其浸没于所述细胞培养基中，在25-37℃下进行培养，使负载于所述载体中的细胞缓慢释放出来，并扩增、粘附于所述复合支架上，得到粘附细胞的细胞-生物材料复合支架。所述粘附细胞的细胞-生物材料复合支架可以植入哺乳动物的组织缺损或损失部位。

[0109] 进一步优选地，所述细胞培养基为α-MEM培养基。可以根据所述细胞的种类再添加其他营养物质。

[0110] 进一步优选地，所述培养的时间为1-30天。进一步优选为5-10天或18-25天。一般而言，细胞会在七天昨天基本长满支架；对于观察细胞在支架上的分化来说，一般是需要培养21天左右。

[0111] 第四方面，本发明还提供了一种粘附细胞的细胞-生物材料复合支架。最终得到的粘附细胞的细胞-生物材料复合支架上是没有粘性细胞悬液的，粘性细胞悬液已经逐渐溶解在培养基中，只剩下支架基体以及粘附在支架基体上的细胞，但原本细胞-生物材料复合支架中的支架基体结构被保留下来。

[0112] 优选地，所述粘附细胞的细胞-生物材料复合支架包括支架基体和粘附在支架基体表面的细胞(增殖和/或分化的细胞)。

[0113] 所述粘附细胞的细胞-生物材料复合支架为立方体，其底面边长为10-30mm，高度为3-20mm，行间距为0.2-0.5mm。

[0114] 本发明实施例的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

[0115] 图1是分子量分别为4000和10000的聚乙二醇(B，D)以及双键修饰后的分子量为4000和10000的聚乙二醇(A，C)的核磁图谱；

[0116] 图2为细胞-生物材料复合支架前驱体的结构示意图；

[0117] 图3为成骨细胞在固化后的细胞-生物材料复合支架中的分布图；

[0118] 图4为成骨细胞在培养后的细胞-生物材料复合支架中的分布图。

具体实施方式

[0119] 以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

[0120] 下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。其中，本发明实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权利的范围内，可以适当的进行变更实施。

[0121] 本发明一实施例中，采用双键修饰的聚乙二醇作为交联剂，其制备方法如下：将1.2ml的丙烯酰氯溶于10ml二氯甲烷中，配制成丙烯酰氯溶液。随后将10g的聚乙二醇(Mn＝
4000)置于50ml的三口烧瓶中，加入20ml的二氯甲烷溶解，室温下搅拌均匀。在冰水浴条件下，缓慢加入2.1ml的三乙胺溶液。随后，在冰水浴条件下，逐滴加入提前配置好的丙烯酰氯溶液。控制体系温度为零度，直至丙烯酰氯全部滴加完毕，氮气保护状态下，室温反应24h。
反应结束后，滤去体系中形成的三乙胺盐酸盐，并用无水乙醚沉淀出合成出的双键修饰的聚乙二醇(Mn＝4000)，得到的粗产物经过真空干燥1d、透析7d、过滤、冻干2d后得到纯度较高的双键修饰的聚乙二醇大分子交联剂，即为聚乙二醇二丙烯酸酯，其分子式为CH2＝CHCO-(OCH2CH2)nOCOCH＝CH2(聚乙二醇分子量为4000时，n＝88，分子量为10000时，n＝
224)。

[0122] 图1为分子量分别为4000和10000的聚乙二醇(B，D)以及双键修饰后的分子量为4000和10000的聚乙二醇(A，C)(即聚乙二醇双丙烯酸酯)的核磁图谱。即(A)为PEGDA4000，(B)为PEG 4000，(C)为PEGDA 10000,(D)PEG 10000。其中聚乙二醇双丙烯酸酯的结构式如下式(Ⅰ)所示：

[0123]

[0124] 从图1可以看出，c,d,e为聚乙二醇双丙烯酸酯上修饰的双键上氢元素的特征峰，说明双键被成功地修饰到聚乙二醇上。

[0125] 实施例1：

[0126] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0127] 1、制备支架基体前驱体浆料：

[0128] 以无机纳米粘土基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该支架基体前驱体浆料的制备如下：

[0129] 取上述双键修饰的聚乙二醇大分子交联剂、Laponite XLG锂皂石粘土、紫外光引发剂2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮与水在室温下混合，得到该支架基体前驱体浆料，其粘度为160Pa·s，其中，上述各原料按如下质量百分含量混合：

[0130] 聚乙二醇二丙烯酸酯(聚乙烯的分子量Mn＝4000)20％

[0131] Laponite XLG粘土：5％

[0132] 紫外光引发剂：0.05％

[0133] 水：74.95％。

[0134] 2、配制粘性细胞悬液：

[0135] 将透明质酸溶于水中，得到透明质酸溶液，以透明质酸溶液重悬人成骨细胞，得到粘度为150Pa·s的粘性细胞悬液，在粘性细胞悬液中，透明质酸的质量分数为20％，细胞的密度为4×106个/mL。

[0136] 3、打印复合支架前驱体：

[0137] 采用双通道三维打印法进行打印，其中，一个通道用于控制上述粘性细胞悬液的打印，控制细胞在三维支架中的分布；另一个通道用于控制所述支架基体前驱体浆料的打印；

[0138] 先打印所述支架基体前驱体浆料形成所述复合支架前驱体的最底层，从此层往上，即从第二层开始，交叉打印所述支架基体前驱体浆料与粘性细胞悬液，使所述粘性细胞悬液交叉排布在所述支架基体前驱体的空隙之间，形成一混合层，重复所述混合层的打印n次，形成所述复合支架前驱体的中间层；最后打印所述粘性细胞悬液形成所述复合支架前驱体的顶层，得到细胞-生物材料复合支架前驱体，所述复合支架前驱体自底部自上形成A’C’nB的排布形式，其中，A’为支架基体前驱体层，B为粘性细胞悬液层，C’为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体前驱体间的混合层，n为3，细胞密度控制在6×105/支架，支架大小为长宽为15mm×15mm的立方体，层数为5层。

[0139] 4、复合支架前驱体的固化：

[0140] 将打印完的所述复合支架前驱体放置于紫外交联仪中进行光固化2000s，使凝胶塑性，得到细胞-生物材料复合支架，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙间形成的混合层，n为3；支架基体为聚乙二醇二丙烯酸酯、无机粘土、紫外光引发剂经固化后形成的凝胶支架基体。

[0141] 5、将上述三维复合支架取出，并浸没于α-MEM培基，放置于37℃培养箱中培养，使负载于透明质酸中的成骨细胞缓慢释放出来，并黏附于凝胶支架基体上，得到粘附细胞的细胞-生物材料三维复合支架。

[0142] 图2为本发明中合成的细胞-生物材料复合支架前驱体的结构示意图，图2中，灰度较浅为支架基体前驱体，灰度较深处为粘性细胞悬液。其中，最底层为支架基体前驱体，中间的每一层为粘性细胞悬液交错分布在支架基体前驱体间的混合层，最上层为粘性细胞悬液层。

[0143] 图3为成骨细胞在固化后的细胞-生物材料复合支架中的分布图(图3中标尺为200μm)。图3中色度较浅的柱状部分为粘性细胞悬液；色度较深的柱状部分为支架基体，从图3中可以看出，粘性细胞悬液与支架基体交错排布，成骨细胞仍然包裹在细胞悬液层的内部(图3中色度度较浅的柱状部分中的白色点状物为细胞)，还未被释放出来。

[0144] 图4为成骨细胞在培养基中培养7天后的细胞-生物材料复合支架(即粘附细胞的细胞-生物材料三维复合支架)中的生长情况图；图4中标尺为200μm。从图4中可以看出，支架基体的空隙处不再存在交错排布的细胞悬液，成骨细胞被释放出来，粘附在支架基体表面。

[0145] 实施例2

[0146] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0147] 1、制备支架基体前驱体浆料：

[0148] 以无机纳米粘土基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该前驱体浆料的粘度为150Pa·s，包括如下质量百分含量的原料组分：

[0149] 交联剂(甲基丙烯酸修饰的明胶)：20％；

[0150] Laponite XLG粘土：7％；

[0151] 紫外光引发剂：0.05％；

[0152] 水：72.95％；

[0153] 其中，所述紫外光引发剂为1-[4-(2-羟乙氧基)-亚苯基]-2-羟基-2’，2’-二甲基乙酮(Irgacure2959)。

[0154] 2、配制粘性细胞悬液：

[0155] 将透明质酸溶于水中，得到透明质酸溶液，以透明质酸溶液重悬人成骨细胞，得到粘度为80Pa·s的粘性细胞悬液，在粘性细胞悬液中，透明质酸的质量分数为10％，细胞的密度为8×106个/mL。

[0156] 3、打印复合支架前驱体：

[0157] 采用双通道三维打印法进行打印，其中，一个通道用于控制上述粘性细胞悬液的打印，控制细胞在三维支架中的分布；另一个通道用于控制所述支架基体前驱体浆料的打印；

[0158] 先打印所述支架基体前驱体浆料形成所述复合支架前驱体的最底层，从此层往上，即从第二层开始，交叉打印所述支架基体前驱体浆料与粘性细胞悬液，使所述粘性细胞悬液交叉排布在所述支架基体前驱体的空隙之间，形成一混合层，重复所述混合层的打印n次，形成所述复合支架前驱体的中间层；最后打印所述粘性细胞悬液形成所述复合支架前驱体的顶层，得到细胞-生物材料复合支架前驱体，所述复合支架前驱体自底部自上形成A’C’nB的排布形式，其中，A’为支架基体前驱体层，B为粘性细胞悬液层，C’为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体前驱体间的混合层，n为5，细胞密度控制在4×105/支架，支架大小为长宽为20mm×25mm的立方体，层数为7层。

[0159] 4、复合支架前驱体的固化：

[0160] 将打印完的所述复合支架前驱体放置于紫外交联仪中进行光固化45min，使凝胶塑性，得到细胞-生物材料复合支架，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙之间形成的混合层，n为5；支架基体为聚乙二醇二丙烯酸酯、无机粘土、紫外光引发剂经固化后形成的凝胶支架基体。

[0161] 5、将上述三维复合支架取出，并浸没于α-MEM培基，放置于37℃培养箱中培养，使负载于透明质酸中的成骨细胞缓慢释放出来，并黏附于凝胶支架基体上，得到粘附细胞的细胞-生物材料三维复合支架。

[0162] 实施例3：

[0163] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0164] 1、制备支架基体前驱体浆料：

[0165] 以海藻酸钠基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该前驱体浆料的粘度为130Pa·s，包括如下质量百分含量的原料组分：

[0166] 交联剂(甲基丙烯酸修饰修饰的聚乙烯醇)：20％；

[0167] 海藻酸钠：10％；

[0168] 水：70％。

[0169] 2、配制粘性细胞悬液：

[0170] 将透明质酸溶于水中，得到透明质酸溶液，以透明质酸溶液重悬人骨髓干细胞，得到粘度为200Pa·s的粘性细胞悬液，在粘性细胞悬液中，透明质酸的质量分数为30％，细胞6
的密度为2×10个/mL。

[0171] 3、打印复合支架前驱体：

[0172] 采用双通道三维打印法进行打印，其中，一个通道用于控制上述粘性细胞悬液的打印，控制细胞在三维支架中的分布；另一个通道用于控制所述支架基体前驱体浆料的打印；

[0173] 先打印所述支架基体前驱体浆料形成所述复合支架前驱体的最底层，从此层往上，即从第二层开始，交叉打印所述支架基体前驱体浆料与粘性细胞悬液，使所述粘性细胞悬液交叉排布在所述支架基体前驱体的空隙之间，形成一混合层，重复所述混合层的打印n次，形成所述复合支架前驱体的中间层；最后打印所述粘性细胞悬液形成所述复合支架前驱体的顶层，得到细胞-生物材料复合支架前驱体，所述复合支架前驱体自底部自上形成A’C’nB的排布形式，其中，A’为支架基体前驱体层，B为粘性细胞悬液层，C’为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体前驱体的空隙之间形成的混合层，n为8，细胞密度控制在4×105/支架，支架大小为长宽为15mm×20mm的立方体，层数为10层。

[0174] 4、复合支架前驱体的固化：

[0175] 将打印完的所述复合支架前驱体放置于浓度为0.3mol/ml的氯化钙溶液中15min，固化成型，得到细胞-生物材料复合支架，所述复合支架自底部自上形成ACnB的排布形式，其中，A为支架基体层，B为粘性细胞悬液层，C为粘性细胞悬液交叉分布在支架基体空隙间形成的混合层，n为8；支架基体为聚乙二醇二丙烯酸酯、无机粘土、紫外光引发剂经固化后形成的凝胶支架基体。

[0176] 5、将上述三维复合支架取出，并浸没于α-MEM培基，放置于37℃培养箱中培养，使负载于透明质酸中的骨髓干细胞缓慢释放出来，并黏附于凝胶支架基体上，得到粘附细胞的细胞-生物材料三维复合支架。

[0177] 实施例4：

[0178] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0179] 1、制备支架基体前驱体浆料：

[0180] 以无机纳米粘土基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该支架基体前驱体浆料的制备如下：

[0181] 取上述双键修饰的聚乙二醇大分子交联剂、Laponite XLG锂皂石粘土、紫外光引发剂2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮与水在室温下混合，得到该支架基体前驱体浆料，其粘度为170Pa·s，其中，上述各原料按如下质量百分含量混合：

[0182] 聚乙二醇二丙烯酸酯(聚乙烯的分子量Mn＝4000)30％

[0183] Laponite XLG粘土：8％

[0184] 紫外光引发剂：0.05％

[0185] 水：61.95％。

[0186] 步骤2-5与实施例1相同。

[0187] 实施例5：

[0188] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0189] 步骤1、制备支架基体前驱体浆料：

[0190] 以无机纳米粘土基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该支架基体前驱体浆料的制备如下：

[0191] 取上述双键修饰的聚乙二醇大分子交联剂、Laponite XLG锂皂石粘土、紫外光引发剂2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮与水在室温下混合，得到该支架基体前驱体浆料，其粘度为160Pa·s，其中，上述各原料按如下质量百分含量混合：

[0192] 聚乙二醇二丙烯酸酯(聚乙烯的分子量Mn＝10000)20％；

[0193] Laponite XLG粘土：7％；

[0194] 紫外光引发剂：0.05％；

[0195] 水：72.95％。

[0196] 剩余步骤2-5与实施例1相同。

[0197] 实施例6：

[0198] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0199] 步骤1、制备支架基体前驱体浆料：

[0200] 以无机纳米粘土基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该支架基体前驱体浆料的制备如下：

[0201] 取上述双键修饰的聚乙二醇大分子作交联剂、膨润土作为无机粘土、Irgacure2959作紫外光引发剂与水在室温下混合，得到该支架基体前驱体浆料，其粘度为
200Pa·s，其中，上述各原料按如下质量百分含量混合：

[0202] 聚乙二醇二丙烯酸酯(聚乙烯的分子量Mn＝4000)25％；

[0203] 无机粘土：10％；

[0204] 紫外光引发剂：0.1％；

[0205] 水：64.9％；

[0206] 剩余步骤2-5与实施例1相同。

[0207] 实施例7

[0208] 一种细胞-生物材料复合支架的制备方法，包括以下步骤：

[0209] 步骤1、制备支架基体前驱体浆料：

[0210] 以无机纳米粘土基水凝胶作为细胞-生物材料复合三维支架的支架基体的前驱体浆料，该支架基体前驱体浆料包括如下质量百分含量的原料组分：

[0211] 交联剂：40％；

[0212] 无机粘土：15％；

[0213] 紫外光引发剂：0.05％；

[0214] 水：44.95％；

[0215] 其中，所述交联剂为丙烯酸修饰的透明质酸；所述无机粘土为高岭土，所述紫外光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。

[0216] 剩余步骤2-5与实施例1相同。

[0217] 以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。