一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器及制备方法

摘要

本发明提供了一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器及其制备方法，包括碳糊电极和乙酰胆碱酯酶层，所述的碳糊电极表面的修饰层由内至外依次为Nafion‑NiCo2S4层、乙酰胆碱酯酶层和Nafion层；所述的NiCo2S4的制备方法为：以可溶性镍盐、可溶性钴盐溶解在含有阳离子表面活性剂的乙二醇中，通过溶剂热法制得钴镍双金属硫化物。本发明的生物传感器酶的固载能力好，具有高灵敏度和高稳定性。达到将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，从而构建有机磷农药生物传感器，该生物传感器可用于甲基对硫磷和对氧磷的检测。

权利要求

1.一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，包括碳糊电极和乙酰胆碱酯酶层，其特征在于：所述的碳糊电极表面的修饰层由内至外依次为Nafion-NiCo2S4层、乙酰胆碱酯酶层和Nafion层；

所述的NiCo2S4的制备方法为：以可溶性镍盐、可溶性钴盐溶解在含有阳离子表面活性剂的乙二醇中，通过溶剂热法制得钴镍双金属硫化物；

所述的溶剂热法包括以下步骤：

步骤1，将可溶性镍盐和可溶性钴盐溶解在含有阳离子表面活性剂的乙二醇中，超声震荡完全溶解形成透明溶液，随后加入硫源化合物，继续超声直至硫源化合物完全溶解获得混合溶液；

步骤2，将步骤1中获得的混合溶液转移至高压反应釜中，将高压反应釜密封置于100℃～180℃下反应8～12h，自然冷却至室温，离心分离并用去离子水和无水乙醇交替洗涤，干燥得到黑色粉末，即制得钴镍双金属硫化物；

所述的可溶性镍盐为四水合乙酸镍，所述的可溶性钴盐为四水合乙酸钴；

所述的阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵；

所述的钴镍双金属硫化物为网络中空微球形貌。

2.如权利要求1所述的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，其特征在于：所述的阳离子表面活性剂的加入量为每40mL乙二醇中加入20mg～200mg。

3.如权利要求1所述的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，其特征在于：所述硫源化合物为硫代乙酰胺、L-半胱氨酸或硫脲。

4.如权利要求1所述的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，其特征在于：所述的可溶性镍盐与可溶性钴盐的摩尔比为1：2，硫源化合物中的硫元素与可溶性镍盐中的镍元素的摩尔比为(4～4.5)：1。

5.如权利要求1所述的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，其特征在于：所述的混合溶液与高压反应釜的关系为：40mL乙二醇制得的混合溶液对应加入到50mL内衬为聚四氟乙烯的高压反应釜中。

6.一种如权利要求1至5任一权利要求所述的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一，将NiCo2S4粉末超声分散于质量浓度为0.1％的Nafion溶液中，形成Nafion-NiCo2S4悬浮液；

每3mgNiCo2S4粉末对应超声分散于1mL质量分数为0.1％的Nafion溶液中；

步骤二，移取2μL～10μL步骤一中制得的Nafion-NiCo2S4悬浮液滴涂碳糊电极表面，置于室温晾干，制得Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极；

步骤三，在Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极表面，滴涂2μL～10μL浓度为0.2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，得到固载酶碳糊电极；

步骤四，在固载酶碳糊电极表面滴涂5μL质量分数为0.5％的Nafion溶液，在4℃下保存

12h～24h，晾干，用去离子水冲洗2～3次，制得钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器。

说明书

一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器及制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于有机磷农药领域，涉及生物传感器，具体涉及一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器及制备方法。

背景技术

[0002] 过渡金属硫化物，例如CoS、NiS以及MoS2等，由于其特殊的物理化学性质，广泛应用于光电、磁以及电化学等多个领域。作为一类新兴的过渡金属硫化物材料，三元体系的Co-Ni硫化物，与二元Co/Ni硫化物和三元体系Co-Ni氧化物相比，其具有优异的导电性，这主要是因为这类材料具有较低的能带间隙。目前，关于三元Co-Ni硫化物的研究主要集中在合成方法与电化学应用方面的探讨与研究。

[0003] 现有技术中公开了一种纳米片状钴镍双金属硫化物，采用两步水热法在FTO导电玻璃上原位生长了纳米片状钴镍双金属硫化物对电极，首次制得纳米片状的钴镍双金属硫化物透明薄膜，并将其用作对电极获得良好的电化学性能，该方法在染料敏化太阳能电池应用方面拥有广阔的前景。但是该钴镍双金属硫化物的形貌为纳米片状，不适合用于有机磷农药生物传感器中。

[0004] 有机磷农药,由于其具有高效、使用方便、量小以及作用方式多、半衰期短等优点，常常作为除草剂、杀虫剂和杀真菌剂，广泛应用农业、工业、医药等领域。我国作为世界上农药生产和消费的大国，由于农药滥用，人类的健康与环境安全受到了严重威胁。因此，如何建立高效、快速、高灵敏度的有机磷农药监测方法，已经成环境、食物等领域的研究热点。

[0005] 目前，对有机磷农药的检测方法主要有，高效液相色谱，气相色谱-质谱联用、荧光以及表面等离子体共振等，这些方法虽然获得了较高的灵敏度，但是它们所用仪器大多价格昂贵、体积庞大、测试周期长以及复杂的样品预处理等，限制了环境与食物污染的现场在线与快速分析监测。电化学生物传感器由于简单、高效、灵敏度高等被广泛应用于环境检测、疾病诊断和食品安全等领域。

[0006] 基于乙酰胆碱酯酶抑制类的有机磷农药电化学生物传感器获得人们广泛关注。它的作用机理是首先将乙酰胆碱酯酶固定在工作电极表面，与底物氯化乙酰硫代胆碱反应生成具有电活性产物的硫代胆碱，从而产生了不可逆的氧化峰。有机磷农药对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，因此可以通过监测乙酰胆碱的氧化峰电流来监测有机磷农药。在生物传感器的制作过程中，固定酶在基体电极表面为生物传感器设计的关键步骤。

发明内容

[0007] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器及制备方法，获得一种具有高灵敏度和高稳定性的生物传感器，用于检测机磷农药。

[0008] 本发明的另一目的在于，获得一种具有网络中空微球形貌的钴镍双金属硫化物，并将其用于生物传感器中，使得该钴镍双金属硫化物能够用于有机磷农药生物传感器中，提高酶的固载能力，并且保证生物传感器的导电性，使得生物传感器具有高灵敏度和高稳定性。

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：

[0010] 一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，包括碳糊电极和乙酰胆碱酯酶层，所述的碳糊电极表面的修饰层由内至外依次为Nafion-NiCo2S4层、乙酰胆碱酯酶层和Nafion层；

[0011] 所述的NiCo2S4的制备方法为：以可溶性镍盐、可溶性钴盐溶解在含有阳离子表面活性剂的乙二醇中，通过溶剂热法制得钴镍双金属硫化物。

[0012] 本发明还提供一种如上所述的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

[0013] 步骤一，将NiCo2S4粉末超声分散于质量浓度为0.1％的Nafion溶液中，形成Nafion-NiCo2S4悬浮液；

[0014] 每3mg NiCo2S4粉末对应超声分散于1mL质量分数为0.1％的Nafion溶液中；

[0015] 步骤二，移取2μL～10μL步骤一中制得的Nafion-NiCo2S4悬浮液滴涂碳糊电极表面，置于室温晾干，制得Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极；

[0016] 步骤三，在Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极表面，滴涂2μL～10μL浓度为0.2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，得到固载酶碳糊电极；

[0017] 步骤四，在固载酶碳糊电极表面滴涂5μL质量分数为0.5％的Nafion溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，用去离子水冲洗2～3次，制得钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器。

[0018] 本发明还具有如下区别技术特征：

[0019] 所述的溶剂热法包括以下步骤：

[0020] 步骤1，将可溶性镍盐和可溶性钴盐溶解在含有阳离子表面活性剂的乙二醇中，超声震荡完全溶解形成透明溶液，随后加入硫源化合物，继续超声直至硫源化合物完全溶解获得混合溶液；

[0021] 步骤2，将步骤1中获得的混合溶液转移至高压反应釜中，将高压反应釜密封100℃～180℃下反应1～12h，自然冷却至室温，离心分离并用去离子水和无水乙醇交替洗涤，干燥得到黑色粉末，即制得钴镍双金属硫化物。

[0022] 所述的可溶性镍盐为四水合乙酸镍，所述的可溶性钴盐为四水合乙酸钴。

[0023] 所述的阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。

[0024] 所述的阳离子表面活性剂的加入量为每40mL乙二醇中加入20mg～200mg。

[0025] 所述硫源化合物为硫代乙酰胺、L-半胱氨酸或硫脲。

[0026] 所述的可溶性镍盐与可溶性钴盐的摩尔比为1：2，硫源化合物中的硫元素与可溶性镍盐中的镍元素的摩尔比为(4～4.5)：1。

[0027] 所述的混合溶液与高压反应釜的关系为：40mL乙二醇值得的混合溶液对应加入到50mL内衬为聚四氟乙烯的高压反应釜中。

[0028] 所述的乙酰胆碱酯酶溶液是将比活力为137units/mg的乙酰胆碱酯酶溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中配制成，充分溶解后置于冰箱中储存备用。

[0029] 所述的Nafion溶液由质量分数为5％的Nafion溶液稀释在磷酸盐缓冲液中所得。

[0030] 所述的碳糊电极的制备方法为：将质量比为3：17的液体石蜡和石墨粉充分混合，得到碳糊，然后填入内径为3mm的PVC管中压实，插入铜线作为导线，制得碳糊电极(CPE)。

[0031] 所述的碳糊电极在使用前需要将碳糊电极在称量纸上打磨成镜面，之后置于于磷酸盐缓冲溶液中，进行循环伏安扫描10个周期，对其进行电化学活化处理。

[0032] 所述的磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.0，浓度为0.10M。

[0033] 本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

[0034] 本发明通过阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵溶解在乙二醇溶液中去调控钴镍双金属硫化物的形貌，钴镍双金属硫化物为网络中空微球形貌，该形貌导电性良好，固载酶的效果好，能够用于有机磷农药生物传感器中。

[0035] 本发明的生物传感器酶的固载能力好，具有高灵敏度和高稳定性。在碳糊电极上依次修饰Nafion-NiCo2S4悬浮液，乙酰胆碱酯酶和Nafion，以达到将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，从而构建有机磷农药生物传感器，该生物传感器可用于甲基对硫磷和对氧磷的检测，其成本低廉、操作简单、灵敏度高，对甲基对硫磷和对氧磷的检测线性范围为1.0×10-12～1.0×10-8g.mL-1和1.0×10-13～1.0×10-10g.mL-1。

附图说明

[0036] 图1为本发明的实施例1的钴镍双金属硫化物的能谱图。

[0037] 图2为本发明的实施例1的钴镍双金属硫化物的X射线衍射图。

[0038] 图3为本发明的实施例1的钴镍双金属硫化物的SEM图。

[0039] 图4为本发明对比例1的钴镍双金属硫化物的SEM图。

[0040] 图5为本发明对比例2的钴镍双金属硫化物的SEM图。

[0041] 图6是CPE，NiCo2S4-CPE，NF-NiCo2S4/CPE，AChE/NF-NiCo2S4/CPE和NF/AChE/NF-NiCo2S4/CPE电极在5.0mM的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.1M的KCl溶液中的的交流阻抗图。

[0042] 图7是不同电极在0.10M pH 7.5的PBS溶液中加入0.4mM ATCl前后的差分脉冲伏安曲线，其中(a)为NF/AChE-CPE电极曲线，(b)为NF/AChE/NF-CPE电极曲线，(c)NF/AChE/NF-NiCo2S4/CPE电极曲线。

[0043] 图8是本发明制备生物传感器浸入不同浓度甲基对硫磷后的差分脉冲伏安曲线；插图为图8条件下酶抑制率与甲基对硫磷浓度对数关系曲线。

[0044] 图9是本发明制备生物传感器浸入不同浓度对氧磷溶液后的差分脉冲伏安曲线；插图为图9条件下酶抑制率与对氧磷浓度对数关系曲线。

[0045] 图10是本发明制备生物传感器稳定性。

[0046] 以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

具体实施方式

[0047] 溶剂热法具有诸多优点，比如溶剂热反应的原料相对廉价易得，工艺非常简单，适合于大规模生产；产物物相均匀、纯度高、结晶性好，形貌和粒径可控；反应在密闭高压釜容器中进行，可控的反应气氛可形成合适的氧化还原反应条件，从而获得其它手段难以实现的物相，并且也有利于有毒体系的合成反应的进行。同时在溶剂热体系中，反应物的活性高，可以用来制备固相反应无法制备的物相或物种，对微纳米材料的合成而言，具有极高的应用价值。

[0048] 由于突出的物理化学性能，过渡金属硫化物引起研究者的广泛关注，NiCo2S4作为一类新兴的三元体系的过渡金属硫化物材料，与Co3S4和三元体系氧化物相比，其具有优异的导电性，这主要是因为这类材料具有较低的能带间隙。

[0049] Nafion(全氟磺酸，简称NF)层由于其无毒、良好的生物的兼容性、分散性以及成膜性等性能使其广泛应用于各类酶修饰电极的制备。

[0050] 本实施例中所使用的仪器和原料：

[0051] CHI660d电化学工作站(上海辰华仪器公司)，电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)，pH计(北京大学化学系)，超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，四水合乙酸钴(天津化学试剂有限公司)，四水合乙酸镍(国药集团化学试剂有限公司)，硫代乙酰胺(阿拉丁)，L-半胱氨酸(天津市福晨化学试剂)，硫脲(广东化学试剂工程研究所)，十六烷基三甲基溴化铵(西安化学试剂厂)，十二烷基磺酸钠(上海英鹏添加剂化工有限公司)，乙二醇(广东化学试剂工程研究所)，液体石蜡(天津化学试剂有限公司)，高纯石墨粉(国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(西安化学试剂厂)，磷酸氢二钾(西安化学试剂厂)，质量浓度为5％的Nafion(Sigma-Aldrich，co.)，乙酰胆碱酯酶(AChE，Sigma-Aldrich，co.)，氯化硫代乙酰胆碱(ATCl，Sigma-Aldrich，co.)，甲基对硫磷标准溶液(北京世纪奥科生物技术有限公司)，对氧磷标准溶液(北京世纪奥科生物技术有限公司)。

[0052] 测定时所用底液浓度为0.10M pH＝7.5的PBS缓冲溶液，由0.10M的K2HPO4和KH2PO4储备液配制而成。所用水为二次蒸馏水。

[0053] 以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

[0054] 实施例1：

[0055] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0056] 步骤1，四水合乙酸镍、四水合乙酸钴按照一定摩尔比1：2溶解在40mL含60mg阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵的乙二醇中，超声震荡完全溶解形成透明溶液，随后加入硫源化合物硫代乙酰胺，硫代乙酰胺中的硫元素与四水合乙酸镍中的镍元素的摩尔比能够保证硫源化合物足量或者略微过量即可，并且保证硫源化合物在乙二醇中能够完全溶解，一般取(4～4.5)：1，继续超声直至其完全溶解获得混合溶液；超声震荡的超声波强度为100W。

[0057] 步骤2，将步骤1中获得的混合溶液转移至50mL内衬为聚四氟乙烯的高压反应釜中，将高压反应釜密封置于180℃下反应8h，自然冷却至室温，离心分离并用去离子水和无水乙醇交替洗涤多次，于60℃下干燥12h得到黑色粉末，即制得钴镍双金属硫化物。

[0058] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，得到如图1所示的能谱图和如图2所示的X射线衍射图，从图1和图2中可以看出，本实施例制得的黑色粉末为钴镍双金属硫化物NiCo2S4。

[0059] 图3为SEM图，从图3可以看出，本实施例制得的钴镍双金属硫化物为网络中空微球形貌。

[0060] 对比例1：

[0061] 本对比例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0062] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同，区别仅仅在于，乙二醇中不含有阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵。

[0063] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0064] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0065] 图4为SEM图，从图4可以看出，本对比例制得的钴镍双金属硫化物不是网络中空微球形貌，而是颗粒堆积状。

[0066] 对比例2：

[0067] 本对比例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0068] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同，区别仅仅在于，将阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵替换为阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠。

[0069] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0070] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0071] 图5为SEM图，从图5可以看出，本对比例制得的钴镍双金属硫化物不是网络中空微球形貌，而是无规则的棒状与颗粒堆积状形貌。

[0072] 实施例2：

[0073] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0074] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同，区别仅仅在于，硫源化合物从硫代乙酰胺更换为L-半胱氨酸。

[0075] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0076] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0077] 本实施例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，为网络中空微球形貌。

[0078] 对比例3：

[0079] 本对比例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0080] 步骤1，本步骤其它条件与实施例2相同，区别仅仅在于，乙二醇中不含有阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵。

[0081] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0082] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0083] 本对比例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与对比例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，是颗粒堆积状形貌。

[0084] 实施例3：

[0085] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0086] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同，区别仅仅在于，硫源化合物从硫代乙酰胺更换为硫脲。

[0087] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0088] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0089] 本实施例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，为网络中空微球形貌。

[0090] 对比例4：

[0091] 本对比例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0092] 步骤1，本步骤其它条件与实施例3相同，区别仅仅在于，乙二醇中不含有阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵。

[0093] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0094] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0095] 本对比例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与对比例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，是颗粒堆积状形貌。

[0096] 对比例5：

[0097] 本对比例为现有公开技术给出的一种钴镍双金属硫化物的制备方法，同实施例1相比，包括以下区别：

[0098] 区别1，本对比例中采用两步水热法在FTO导电玻璃上原位生长钴镍双金属硫化物，而实施例1采用一步溶剂热法直接制备钴镍双金属硫化物，操作简单，易于实现。

[0099] 区别2，本对比例中以硝酸钴和硝酸镍为金属源，而实施例1中以乙酸钴和乙酸镍为金属源。

[0100] 区别3，本对比例中以去离子水为溶剂，而实施例1中以乙二醇为溶剂。

[0101] 区别4，本对比例中以硫化钠为硫源，而实施例1中以硫代乙酰胺硫源。

[0102] 区别5，本对比例中所得钴镍双金属硫化物为纳米片状形貌，而实施例1中所得钴镍双金属硫化物为网络中空微球形貌。

[0103] 实施例4：

[0104] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0105] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同，区别仅仅在于，40mL乙二醇中含200mg阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵。

[0106] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0107] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0108] 本实施例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，为网络中空微球形貌。

[0109] 实施例5：

[0110] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0111] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同，区别仅仅在于，40mL乙二醇中含20mg阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵。

[0112] 步骤2，本步骤与实施例1的步骤相同，制得钴镍双金属硫化物。

[0113] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0114] 本实施例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，为网络中空微球形貌。

[0115] 实施例6至7：

[0116] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0117] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同。

[0118] 步骤2，本步骤其它条件与实施例1的相同，区别仅仅在于，将高压反应釜密封分别置于100℃和140℃下反应8h，制得钴镍双金属硫化物。

[0119] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0120] 本实施例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，为网络中空微球形貌。

[0121] 实施例8：

[0122] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0123] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同。

[0124] 步骤2，本步骤其它条件与实施例1的相同，区别仅仅在于，将高压反应釜密封置于180℃下反应12h，制得钴镍双金属硫化物。

[0125] 产物表征：对本实施例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1相同。

[0126] 本实施例制得的钴镍双金属硫化物的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图基本相同，为网络中空微球形貌。

[0127] 对比例6：

[0128] 本对比例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0129] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同。

[0130] 步骤2，本步骤其它条件与实施例1的相同，区别仅仅在于，将高压反应釜密封分别置于60℃下反应8h，制得钴镍双金属硫化物。

[0131] 产物表征：对本对比例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1不相同，说明所得产物不是钴镍双金属硫化物。

[0132] 本对比例制得的黑色粉末的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图不相同，为大块堆积状形貌。

[0133] 对比例7：

[0134] 本对比例给出一种钴镍双金属硫化物的制备方法，包括以下步骤：

[0135] 步骤1，本步骤其它条件与实施例1相同。

[0136] 步骤2，本步骤其它条件与实施例1的相同，区别仅仅在于，将高压反应釜密封置于180℃下反应1h，制得钴镍双金属硫化物。

[0137] 产物表征：对本对比例制得的黑色粉末进行检测，能谱图和X射线衍射图与实施例1不相同，说明所得产物不是钴镍双金属硫化物。

[0138] 本对比例制得的黑色粉末的SEM图与实施例1制得的钴镍双金属硫化物的SEM图不相同，为大块堆积状形貌。

[0139] 实施例9：

[0140] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，包括碳糊电极和乙酰胆碱酯酶层，所述的碳糊电极表面的修饰层由内至外依次为Nafion-NiCo2S4层、乙酰胆碱酯酶层和Nafion层；

[0141] 所述的NiCo2S4采用实施例1制得的钴镍双金属硫化物。

[0142] 本实施例中的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的制备方法如下所述：

[0143] 步骤一，将3mg NiCo2S4粉末超声分散于1mL质量分数为0.1％Nafion溶液中，形成Nafion-NiCo2S4悬浮液；

[0144] 步骤二，移取6μL步骤一中制得的Nafion-NiCo2S4悬浮液滴涂碳糊电极表面，置于室温晾干，制得Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极；

[0145] 步骤三，在Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极表面，滴涂6μL浓度为0.2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，得到固载酶碳糊电极；

[0146] 步骤四，在固载酶碳糊电极表面滴涂5μL质量分数为0.5％的Nafion溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，用去离子水冲洗2～3次，制得钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器。

[0147] 乙酰胆碱酯酶溶液是将比活力为137units/mg的乙酰胆碱酯酶溶于磷酸盐缓冲液中配制成，充分溶解后置于冰箱中储存备用。

[0148] Nafion溶液由质量分数为5％的Nafion溶液稀释在磷酸盐缓冲液中所得。

[0149] 碳糊电极的制备方法为：将质量比为3：17的液体石蜡和石墨粉充分混合，得到碳糊，然后填入内径为3mm的PVC管中压实，插入铜线作为导线，制得碳糊电极(CPE)。

[0150] 碳糊电极在使用前需要将碳糊电极在称量纸上打磨成镜面，之后置于磷酸盐缓冲溶液中，进行循环伏安扫描10个周期，对其进行电化学活化处理。

[0151] 磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.0，浓度为0.10M。

[0152] 图6利用电化学阻抗法在K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液中研究了各种修饰电极的电子转移能力，同时得出了各种修饰电极界面的性质。图中CPE半径较大，说明其电子转移能力较差。当修饰上NiCo2S4或Nafion-NiCo2S4时，图中曲线的圆弧半径相对减小，这说明NiCo2S4具有较好的电子传导能力；然而对于AChE/Nafion-NiCo2S4/CPE修饰电极，阻抗相对Nafion-NiCo2S4/CPE有所增大，这是由于AChE是绝缘体，同时也说明AChE成功固定于Nafion与NiCo2S4复合膜中。

[0153] 图7为不同修饰电极在0.1M pH 7.5PBS中加入0.4mM ATCl后的差分脉冲伏安(DPV)响应曲线。对于NF/AChE-CPE(curve a)修饰电极，无明显现象，这表明AChE从CPE表面脱落；然而在NF/AChE/NF-CPE(curve b)，出现了一个较弱的氧化峰，这由于固定在电极表面的AChE催化底物产生具有电活性的硫代胆碱，只是量较小；进一步可以观察可以看到在NF/AChE/NF-NiCo2S4/CPE(curve c)修饰电极上，在0.76V左右出现了明显的氧化峰，并且NF/AChE/NF-NiCo2S4/CPE的峰电流远远高于NF/AChE/NF-CPE，这说明NF与NiCo2S4在电极表面形成了一层均匀的膜，促进了电子传递。这可能是由于这是由于具有良好成膜性的NF与NiCo2S4纳米粒子在电极表面形成了均匀的复合膜；而NiCo2S4大的比表面积以及其特殊的结构，增加了AChE分子的吸附量，加速了酶对底物的催化效应。

[0154] 图8为生物传感器在电解质为0.1M pH 7.5PBS中，检测它对0.4mM ATCl的响应电流。然后将其在一定浓度的甲基对硫磷溶液中浸泡10min后，在相同条件下，检测其对ATCl的响应电流。根据抑制率的计算公式，得到不同浓度下甲基对硫磷对生物传感器的抑制率，在最优条件下，在浓度1.0×10-12～1.0×10-8g.mL-1范围内，甲基对硫磷对生物传感器的抑制率与甲基对硫磷浓度的对数成线性关系,线性回归方程方程为I(％)＝12.99Ig C(g.mL-1)+162.37,相关系数R＝0.9951，生物传感器对甲基对硫磷的检测限为4.2×10-13g.mL-1。

[0155] 图9为生物传感器在电解质为0.1M pH 7.5PBS中，检测它对0.4mM ATCl的响应电流。然后将其在一定浓度的对氧磷溶液中浸泡10min后，在相同条件下，检测其对ATCl的响应电流。根据抑制率的计算公式，得到不同浓度下对氧磷对生物传感器的抑制率，在最优条件下，在浓度为1.0×10-13～1.0×10-10g.mL-1范围内，对氧磷对生物传感器的抑制率与其浓度的对数呈线性关系，线性回归方程为I(％)＝16.74Ig C(g.mL-1)+229.43,相关系数为R＝0.9916，生物传感器对对氧磷的检测限为3.5×10-14g.mL-1。

[0156] 图10为生物传感器在电解质为0.1M pH 7.5PBS中，检测它在不同储存时间后对0.4mM ATCl的响应电流，结果如图10所示，说明该生物传感器具有较好的稳定性。此外，分别使用6支同批次的生物传感器测定其在含有0.01ng/mL甲基对硫磷的0.1M pH 7.5PBS中对0.4mM ATCl的响应的相对标准偏差为5.3％，说明其重现性较好。表明NF-NiCo2S4复合膜修饰的电极为酶提供了一个适合的生物微环境，可以最大限度的保持酶的活性。

[0157] 实施例10至实施例16：

[0158] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，结构与实施例11相同，区别仅仅在于，所述的NiCo2S4采用实施例2至8制得的钴镍双金属硫化物。

[0159] 本实施例的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的制备方法与实施例9相同。

[0160] 本实施例的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的性能测试结果与实施例9相近，鉴于篇幅，在此不再一一给出。

[0161] 实施例17：

[0162] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，结构与实施例9相同。

[0163] 本实施例的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的制备方法与实施例9基本相同，区别仅仅在于：

[0164] 步骤二，移取10μL步骤一中制得的Nafion-NiCo2S4悬浮液滴涂碳糊电极表面，置于室温晾干，制得Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极。

[0165] 步骤三，在Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极表面，滴涂10μL浓度为0.2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，得到固载酶碳糊电极。

[0166] 本实施例的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的性能测试结果与实施例9相近，鉴于篇幅，在此不再一一给出。

[0167] 实施例18：

[0168] 本实施例给出一种钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器，结构与实施例9相同.

[0169] 本实施例的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的制备方法与实施例9基本相同，区别仅仅在于：

[0170] 步骤二，移取2μL步骤一中制得的Nafion-NiCo2S4悬浮液滴涂碳糊电极表面，置于室温晾干，制得Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极。

[0171] 步骤三，在Nafion-NiCo2S4复合膜修饰的碳糊电极表面，滴涂2μL浓度为0.2mg/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，在4℃下保存12h～24h，晾干，得到固载酶碳糊电极。

[0172] 本实施例的钴镍双金属硫化物有机磷农药生物传感器的性能测试结果与实施例9相近，鉴于篇幅，在此不再一一给出。