平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖用于诱导受试者中的血管新生的用途

摘要

本发明的实施方案涉及平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖用于诱导受试者中的血管新生和用于增加患有局部缺血的受试者的血流量的用途。

权利要求

1.平均分子量等于或低于10000Da和平均硫含量在15％至20％的范围内的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐在制造用于诱导受试者的缺血组织或器官中的血管新生的药物中的用途，其中所述药物配制成静脉或皮下施用至所述受试者。

2.平均分子量等于或低于10000Da和平均硫含量在15％至20％的范围内的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐在制造用于增加患有局部缺血的受试者中的血流量的药物中的用途，其中所述药物配制成静脉或皮下施用至所述受试者。

3.根据权利要求2所述的用途，所述药物用于增加所述受试者的缺血组织或器官中的血流量。

4.平均分子量等于或低于10000Da和平均硫含量在15％至20％的范围内的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐在制造用于使受试者中的缺血组织血管化的药物中的用途，其中所述药物配制成静脉或皮下施用至所述受试者。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述平均分子量在2000Da至10000Da的范围内。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述平均分子量在3000Da至10000Da的范围内。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述平均分子量在3500Da至9500Da的范围内。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述平均分子量在4500Da至7500Da的范围内。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述平均分子量在4500Da至5500Da的范围内。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述平均硫含量为17％。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐的数均分子量(Mn)如通过核磁共振(NMR)光谱法所测量在1850Da至2000Da的区间内。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐具有平均5.1个葡萄糖单元和2.6至2.7的每葡萄糖单元的平均硫酸根数目。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制成注射用水溶液。

14.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐被配制成以在0.05至50mg/kg所述受试者的体重范围内的剂量施用。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐被配制成在0.05至30mg/kg所述受试者的体重范围内的剂量施用。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐被配制成以在0.1至15mg/kg所述受试者的体重范围内的剂量施用。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述硫酸葡聚糖或所述其药学上可接受的盐被配制成以在0.1至10mg/kg所述受试者的体重范围内的剂量施用。

18.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述受试者是患有造成所述人类受试者体内局部缺血的疾病、病症或医学疾患的人类受试者。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患选自由以下组成的组：创伤愈合；外周局部缺血；外周动脉疾病；肢体局部缺血；不宁腿；雷诺综合征；镰形细胞病或血栓闭塞性脉管炎；冠状动脉局部缺血；儿童缺血性疾病；中枢神经系统局部缺血；肌营养不良疾病；由血栓性、出血性或创伤性损伤引起的缺血。

20.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患为器官、组织和/或细胞的移植后的局部缺血。

21.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患为充血性心力衰竭。

22.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患为心肌梗塞。

23.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患为冠状动脉疾病。

24.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患为围产期或新生儿疾病。

25.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患选自由以下组成的组：新生儿缺氧性或缺血性脑损伤、窒息性脑病和脑性麻痹。

26.根据权利要求18所述的用途，其中所述疾病、病症或医学疾患选自由以下组成的组：创伤性脑损伤；颞动脉炎和由多发性硬化症、中风、肌萎缩性脊髓侧索硬化症引起的缺氧。

27.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述其药学上可接受的盐是硫酸葡聚糖的钠盐。

说明书

平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖用于诱导受试者中的

血管新生的用途

技术领域

[0001] 本发明的实施方案通常涉及血管新生，并且具体涉及硫酸葡聚糖用于诱导受试者中的血管新生的用途。

[0002] 背景

[0003] 血管新生是通过其从预先存在的血管形成新血管的生理过程。这不同于血管发生，血管发生是从中胚层细胞前体从头形成内皮细胞。发育胚胎中的第一血管通过血管发生形成，之后血管新生负责在发育期间和疾病中的大多数(如果不是全部)的血管生长。

[0004] 血管新生是生长和发育中以及伤口愈合和肉芽组织形成中的正常且重要的过程。

[0005] 血管新生传统上被分类为出芽式血管新生(sprouting angiogenesis)或肠套叠(intussusception)，或者分裂式血管新生(splitting angiogenesis)。出芽式血管新生形成全新的血管，而分裂式血管新生将现有血管分裂成两个血管。

[0006] 血管新生可为用于对抗以不良的血管形成或异常的脉管系统为特征的疾病的目标。修复或另外的代谢活跃的组织中缺乏血管可抑制修复或其它必要功能。若干种疾病，诸如缺血性慢性伤口，是血管形成失败或不充分的结果，并且可以通过局部扩张血管来治疗，因此将新营养物质带到该部位，从而促进修复。

[0007] 血管新生原理的现代临床应用可分为两个主要领域：抗血管新生疗法和促血管新生疗法。鉴于抗血管新生疗法正被用于治疗或预防需要大量氧和营养物来增殖的癌症和恶性肿瘤，正在开发促血管新生疗法作为治疗例如心血管疾病、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化疾病、冠心病、外周动脉疾病、伤口愈合病症等的选项。

[0008] 促血管新生治疗中的传统方法尤其包括基因疗法，用于扩增或抑制的目标靶向基因；蛋白质疗法，其主要操纵血管新生生长因子；以及基于细胞的疗法，其涉及特定细胞类型的移植。

[0009] 仍有与基因疗法相关的严重、未解决的问题。困难包括将治疗基因有效整合到靶细胞的基因组中，降低与用于植入基因的病毒载体相关的不期望的免疫响应、潜在毒性、免疫原性、炎性响应和肿瘤生成的风险，以及血管新生的遗传基础的纯粹复杂性。

[0010] 促血管新生蛋白疗法使用各种生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，来促进血管新生。蛋白质疗法的障碍是递送模式。蛋白质施用的经口、静脉内、动脉内或肌内途径并不总是有效的，因为治疗性蛋白质可能在其可进入靶组织之前被代谢或清除掉。基于细胞的促血管新生疗法仍处于研究的早期阶段，其中有许多关于将使用的最佳细胞类型和剂量的待决的问题。

[0011] 局部缺血是对组织的血液供应的限制，从而导致细胞代谢所需的氧和葡萄糖的短缺。局部缺血通常由血管问题引起，导致组织损害或组织功能障碍。这还意味着身体的给定部分中的局部贫血和缺氧，所述局部贫血和缺氧有时由充血如血管收缩、血栓或栓塞造成。

[0012] 在长时间局部缺血后恢复冠状动脉血流量通常涉及所谓的再灌注损伤，再灌注损伤会引起内皮损害和呈现出促凝血表型和促炎性表型的受影响的内皮。再灌注大大加速了局部缺血诱导的补体激活和沉积。

[0013] 硫酸葡聚糖是一种众所周知的补体抑制剂，并因此已被提议用来实现对内皮的抗局部缺血后再灌注损伤的细胞保护。

[0014] Experimental Cell Research 215,294-302(1994)公开了硫酸多糖，诸如肝素和硫酸葡聚糖，可以在体外用于胶原诱导的血管形成。然而，体内实验数据表明低分子量硫酸多糖肝素(2.4kDa)抑制血管新生，Glycobiology 3,567-573(1993)，Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23,141-149(1993)。

[0015] 美国专利No.5,135,920公开了平均分子量为500000Da的硫酸葡聚糖是血管生成抑制性的，即抑制血管新生。

[0016] 在本领域中血管新生领域仍有改进的余地。

[0017] 概述

[0018] 一般目的是诱导受试者中的血管新生。

[0019] 另一个目的是增加患有局部缺血的受试者中的的血流量。

[0020] 这些和其它目的由本文公开的实施方案满足。

[0021] 实施方案的一方面涉及用于诱导受试者中的血管新生的平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0022] 实施方案的另一方面涉及一种用于诱导受试者中的血管新生的方法。所述方法包括施用平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物至受试者。

[0023] 实施方案的另一方面涉及平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物在制造用于诱导受试者中的血管新生的药物方面的用途。

[0024] 实施方案的另一方面涉及用于增加患有局部缺血的受试者中的血流量的平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0025] 实施方案的另一方面涉及一种用于增加患有局部缺血的受试者中的血流量的方法。所述方法包括施用平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物至所述受试者。

[0026] 实施方案的另一方面涉及平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物在制造用于增加患有局部缺血的受试者中的血流量的药物方面的用途。

[0027] 实施方案的另一方面涉及用于血管化受试者中的缺血性组织的平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0028] 实施方案的另一方面涉及一种用于血管化受试者中的缺血性组织的方法。所述方法包括施用平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物至所述受试者。

[0029] 实施方案的另一方面涉及平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物在制造用于血管化受试者中的缺血性组织的药物方面的用途。

[0030] 实施方案的另一方面涉及体外或离体用于诱导器官和/或经血管化的组织中的血管新生，体外或离体用于增加经血管化的组织和/或器官中的血流量和/或用于体外或离体血管化经血管化的组织和/或器官的平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物，及其相关方法。

[0031] 附图简述

[0032] 通过结合附图参考以下描述，可以最好地理解所述实施方案及其其它目的和优点，其中：

[0033] 图1是示出整个小鼠重症肢体缺血模型(mouse critical limb ischemia model)的平均体重的图。双因素ANOVA之后进行邦费罗尼事后比较(Bonferroni post-hoc comparisons)显示各组之间没有统计学显著差异。

[0034] 图2是示出整个小鼠重症肢体缺血模型的研究组的平均血流量的图。进行双因素ANOVA重复测量，然后进行邦费罗尼事后检验。硫酸葡聚糖处理组2M、3M和4M与对照组1M的比较显示从第14天和第21天到第35天的统计学显著差异(p<0.001)。

[0035] 图3是示出在用FITC标记的葡聚糖(DA)进行双重染色之后通过重症肢体局部缺血研究获得的各组的CD34毛细血管密度图。DA条表示功能性毛细血管。使用双因素ANOVA之后进行邦费罗尼多重比较来进行统计学分析。

[0036] 图4是在用FITC标记的葡聚糖(DA)进行双重染色之后，通过重症肢体局部缺血研究比较各组中缺血性肢体和非缺血性肢体的CD34毛细血管密度的图。DA条表示功能性毛细血管。使用双因素ANOVA之后进行邦费罗尼多重比较来进行统计学分析。

[0037] 图5A至5C示出了重症肢体局部缺血研究中的各组的CD34毛细血管密度(图5A-来自媒介物对照组1M的小鼠；图5B-来自重复使用30mg/kg硫酸葡聚糖的组3M的小鼠；图5C-来自单次使用30mg/kg的硫酸葡聚糖的组4M的小鼠)。左图示出了CD34染色，而右图示出了FITC标记的葡聚糖染色。

[0038] 图6是示出用硫酸葡聚糖处理过的HLI损伤动物的肢体功能评分的图。在第0天，通过结扎和切除股动脉来诱导HLI。处理在第8天开始，每周一次(1x/w)或每周3次(3x/w)媒介物或10mg/kg或30mg/kg硫酸葡聚糖。肢体评分被分级为0至3，其中3是最差的(脚拖曳)。硫酸葡聚糖从第21天开始诱导显著改善并且显著改善继续(对第7天、第14天、第21天、第28天和第35天的分析)，如通过双因素ANOVA所计算。

[0039] 图7是示出在对内皮标记物平滑肌肌动蛋白(SMA)进行的重症肢体局部缺血研究中各组的毛细血管密度的图。根据双因素ANOVA，随后进行邦费罗尼多重比较，来得到统计学显著性。

[0040] 图8比较了在左后肢股动脉结扎后35天用非接触式激光多普勒血流成像仪测量的两只小鼠的血流量。下方小图已用媒介物处理过(组1M)，上方小图已接受硫酸葡聚糖处理(组3M)。

[0041] 图9示出了用于tMCAO中风率研究的各组中的体重分布。

[0042] 图10示出了在整个tMCAO中风率研究中处理组的神经功能评分(Neuroscore)。

[0043] 图11示出了在整个tMCAO中风率研究中对处理组进行的踏步试验(stepping test)。

[0044] 图12示出了在整个tMCAO中风率研究中对处理组进行的前肢放置试验(forelimb placement test)。

[0045] 图13示出了在整个tMCAO中风率研究中处理组的身体摆动试验Δ(左转右转)。

[0046] 图14示出了在第29天与媒介物对照相比，两个硫酸葡聚糖组中的脑血流量比率和血管平均直径的百分比变化。

[0047] 图15示出了在第30天与媒介物对照相比，每天用15mg/kg硫酸葡聚糖处理的大鼠的SMA毛细血管密度。

[0048] 图16示出了在第30天硫酸葡聚糖处理组对比对照媒介物组的GFAP面积(阳性细胞面积/10倍视野)。

[0049] 图17A和图17B示出了处理对来自媒介物对照组(图17A)和来自硫酸葡聚糖(每天15mg/kg)组(图17B)的大鼠的毛细血管密度的影响。

[0050] 图18示出了MI诱导后35天时的梗塞尺寸。

[0051] 图19比较了硫酸葡聚糖处理组(15mg/kg，3次/周，共3周)和媒介物对照组在MI诱导后35天时的SMA染色。

[0052] 图20A至图20C示出了关于两只经硫酸葡聚糖处理(15mg/kg，3次/周，共3周)的大鼠(图20A，图20B)和一只媒介物对照大鼠(图20C)的血管密度的SMA染色。

[0053] 图21示出了大鼠HLI模型中的平均血流量。

[0054] 图22示出了大鼠HLI模型中的肢体评分。

[0055] 图23示出了HLI损伤腿中的SMA和因子8毛细血管密度。

[0056] 图24示出了HLI损伤腿中的血管造影术毛细血管评分。

[0057] 图25A至图25D示出了媒介物对照动物(图25A)和处理组2M、3M和4M中的动物(图25B至图25D)的血管造影术毛细血管图像。

[0058] 所有数字显示平均值+平均值的标准误差

[0059] 详述

[0060] 本发明的实施方案通常涉及血管新生，并且具体地涉及硫酸葡聚糖用于诱导受试者中的血管新生的用途。

[0061] 本发明实施方案基于以下发现：特定平均分子量范围内的硫酸葡聚糖，当施用至受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人类受试者时，具有血管新生诱导功效和血流量增加功效。

[0062] 鉴于现有技术公开硫酸多糖在体内抑制血管新生并且平均分子量为500000Da的硫酸葡聚糖是血管新生抑制性的，即抑制血管新生，所以所述实施方案的硫酸葡聚糖的这种效果是非常令人惊讶的。

[0063] 如在本文中以清楚对比呈现的实验数据所显示，所述实施方案的硫酸葡聚糖具有诱导血管新生的体内功效，如通过显著增加平均血流量，降低缺血严重度，增加缺血模型和中风模型中的毛细血管密度以及减少心肌梗塞(MI)模型中的梗塞尺寸所观察到的。所述实施方案的硫酸葡聚糖还能够在缺血组织中选择性形成血管，同时不会引起非缺血组织中的任何显著血管形成。

[0064] 因此，实施方案的一个方面涉及用于诱导受试者血管新生的平均分子量低于10000的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0065] 在下文中，提到的硫酸葡聚糖的(平均)分子量和硫含量也适用于硫酸葡聚糖的任何药学上可接受的衍生物。因此，硫酸葡聚糖的药学上可接受的衍生物优选具有如在以下实施方案中所讨论的平均分子量和硫含量。

[0066] 实施方案范围之外的硫酸葡聚糖据信具有较差的血管新生功效或甚至根本没有血管新生功效。例如，平均分子量为2.4kDa的另一种硫酸多糖肝素实际上抑制血管新生，如较大的硫酸葡聚糖分子一样(Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 23,141-149(1993)；美国专利No.5,135,920)。

[0067] 此外，与具有较低平均分子量的硫酸葡聚糖相比，分子量超过10000Da的硫酸葡聚糖通常具有更低的功效对比副作用特性。这意味着与平均分子量在本发明范围内的的硫酸葡聚糖分子相比，较大硫酸葡聚糖分子(>10000Da)可安全施用至受试者的最大值硫酸葡聚糖剂量更低。因此，当在体内向受试者施用硫酸葡聚糖时，这种较大的硫酸葡聚糖分子不太适合临床使用。此外，大硫酸葡聚糖分子事实上与所述实施方案的硫酸葡聚糖相比具有相反的功效，如美国专利No.5,135,920所证实。

[0068] 因此，看起来似乎在非常窄的硫酸葡聚糖平均分子量范围内硫酸葡聚糖当施用于受试者时具有血管新生功效，而所述实施方案范围之外的硫酸葡聚糖分子没有血管新生功效或事实上具有血管新生抑制作用。

[0069] 硫酸葡聚糖是硫酸化多糖，特别是硫酸化葡聚糖，即用许多葡萄糖分子制成的多糖。如本文所定义的平均分子量指示个别硫酸化多糖的分子量可不同于此平均分子量，但所述平均分子量代表硫酸化多糖的平均分子量。这进一步意味着硫酸葡聚糖样品在该平均分子量附近存在分子量的自然分布。

[0070] 硫酸葡聚糖的平均分子量(Mw)通常使用间接方法如凝胶排阻/渗透色谱、光散射或粘度测定。使用此类间接方法测定平均分子量将取决于多种因素，包括柱和洗脱液的选择，流速，校准方法等。

[0071] 平均分子量(Mw)： 典型用于对分子大小而不是数值敏感的方法，例如光散射和尺寸排阻色谱(SEC)方法。如果假定正态分布，则在Mw的两侧上的重量相同，即分子量低于Mw的样品中的硫酸葡聚糖分子的总重量等于分子量大于Mw的样品中硫酸葡聚糖分子的总重量。

[0072] 在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的平均分子量在2000Da与10000Da的范围内。在另一个实施方案中，平均分子量在2500Da与10000Da的范围内。在一个特别优选的实施方案中，平均分子量在3000Da至10000Da的范围内。

[0073] 在任选但是优选的实施方案中，少于40％的硫酸葡聚糖分子的分子量低于3000Da，优选少于35％，诸如少于30％或少于25％的硫酸葡聚糖分子的分子量低于3000Da。
另外或替代地，少于20％的硫酸葡聚糖分子的分子量大于10000Da，优选少于15％，诸如少于10％或少于5％的硫酸葡聚糖分子的分子量大于10000Da。因此，在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖在平均分子量附近具有实质上窄分子量分布。

[0074] 在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的平均分子量在3500Da与9500Da的范围内，诸如在3500Da与8000Da的范围内。

[0075] 在另一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的平均分子量在4500Da与7500Da的范围内。

[0076] 在另一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的平均分子量在4500Da与5500Da的范围内。

[0077] 因此，在当前优选的实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的平均分子量优选为约5000Da或至少基本上接近5000Da，诸如5000±500Da，例如5000±400Da，优选5000±300Da或5000±200Da，诸如5000±100Da。因此，在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的平均分子量为4.5kDa、4.6kDa、4.7kDa、4.8kDa、4.9kDa、5.0kDa、5.1kDa、5.2kDa、5.3kDa、5.4kDa或5.5kDa。

[0078] 在一个具体实施方案中，如上所述的硫酸葡聚糖或其药学衍生物的平均分子量是平均Mw，并且优选通过凝胶排阻/渗透色谱、尺寸排阻色谱、光散射或基于粘度的方法测定。

[0079] 在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物平均由大约或略多于5个葡萄糖单元组成，并且每个葡萄糖单元的平均硫酸根数目为至少2.0，诸如至少2.5。

[0080] 硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物并且含有硫。所述实施方案的硫酸葡聚糖的平均硫含量优选为15％至20％，更优选为约17％，通常对应于每个葡糖基残基约2个硫酸根基团。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖的硫含量优选等于或至少接近葡聚糖分子的硫含量的最大值可能程度。

[0081] 在一个具体实施方案中，所述实施方案的硫酸葡聚糖的数均分子量(Mn)如通过核磁共振(NMR)光谱法所测量在1850Da与2000Da的区间内。

[0082] 在另一个具体实施方案中，所述实施方案的硫酸葡聚糖具有平均5.1个葡萄糖单元和每个葡萄糖单元2.6至2.7的平均硫酸根数目，这通常导致如通过核磁共振(NMR)光谱法所测量的数均分子量(Mn)在1850Da与2000Da的区间内。

[0083] 数均分子量(Mn)： 通常通过端基测定法如NMR光谱或色谱法获得。如果假定正态分布，则可在Mn的两侧上发现相同的硫酸葡聚糖分子数目，即分子量低于Mn的样品中的硫酸葡聚糖分子的数目等于分子量大于Mn的样品中硫酸葡聚糖分子的数目。

[0084] 根据所述实施方案的硫酸葡聚糖可以作为硫酸葡聚糖的药学上可接受的衍生物提供。此类药学上可接受的衍生物包括硫酸葡聚糖的盐和溶剂化物，例如钠盐或钾盐。

[0085] 所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物优选通过注射施用于受试者，具体地通过静脉(i.v.)注射，皮下(s.c.)注射或(i.p.)腹膜内注射，优选i.v.或s.c.注射。可使用的其它非肠道施用途径包括肌内和关节内注射。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的注射可替代地或另外直接在例如缺血组织或器官或受试者身体中发生血管新生和血流量增加的其它部位进行。

[0086] 所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物优选配制为含有所选溶剂或赋形剂的注射用水溶液。所述溶剂有利地是水性溶剂，具体地是缓冲溶液。此类缓冲溶液的非限制性实例是柠檬酸缓冲液，诸如柠檬酸一水合物(CAM)缓冲液或磷酸盐缓冲液。例如，所述实施方案的硫酸葡聚糖可溶于盐水如0.9％的NaCl盐水中，然后任选地用75mM CAM缓冲并使用氢氧化钠调节pH至约5.9。非缓冲溶液也是可能的，包括注射用水溶液，诸如盐水，即NaCl(水溶液)。此外，如果需要缓冲溶液，则可以使用除CAM之外的其它缓冲体系。

[0087] 所述实施方案不限于注射，并且可以替代地使用其它施用途径，包括经口、经鼻、经颊、直肠、皮肤、经气管、经支气管或局部。然后将活性化合物硫酸葡聚糖与基于具体施用途径选择的合适赋形剂或载剂一起配制。

[0088] 所述实施方案的硫酸葡聚糖的合适剂量范围可根据受试者的尺寸和重量，受试者所治疗的疾患和其它考虑因素而变化。具体地，对于人类受试者，可能的剂量范围可以是1μg/kg体重至150mg/kg体重，优选10μg/kg体重至100mg/kg体重。

[0089] 在优选的实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物配制成以在以下范围内的剂量施用：0.05mg/kg至50mg/kg受试者体重，优选0.05或0.1至40mg/kg受试者体重，更优选0.05或0.1至30mg/kg，或0.1至25mg/kg或0.1至15mg/kg或0.1至10mg/kg受试者体重。

[0090] 所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的施用优选在引起受试者中局部缺血、中风或心血管疾病或者引起用如通过施用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物所触发的血管新生诱导可治疗或至少缓解的医学疾患的损伤或其它疾患后尽快开始。

[0091] 硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的施用不一定必须限于治疗本发明的医学疾患，而是可替代地或另外用于预防。换句话说，所述实施方案的硫酸葡聚糖可以施用于将经历医疗过程如手术的受试者，所述医疗过程可引起局部缺血或其它医疗效应，所述局部缺血或其它医疗效应可以通过诱导血管新生和/或增加血流量来治疗、抑制或缓解。

[0092] 所述实施方案的硫酸葡聚糖可以在单次施用时机施用，例如以单次团注注射形式施用。此团注剂量可以相当快地注射到患者体内，但是有利地随时间推移输注，使得硫酸葡聚糖溶液在几分钟的时间内输注到患者体内，诸如在5至10分钟内。

[0093] 可替代地，所述实施方案的硫酸葡聚糖可以在治疗期间以多次，即至少两次施用。这种治疗期的持续时间通常与不同类型的伤口愈合的内源性时间段和侵害的类型相关。关于合适治疗期的更多信息，可以参考Indwelling Neural Implants:Strategies for Contending with the In Vivo Environment，William M.Reichert编，2008，Taylor&Francis Group,LLC(ISBN:978-0-8493-9362-4)的第3-40页的Chapter 1 Overview of Wound Healing in Different Tissue Types。

[0094] 因此，作为说明性实例，所述实施方案的硫酸葡聚糖可以每天施用一次或多次，每周施用一次或多次，每月施用一次或多次。

[0095] 通常，对于急性疾病，诸如在例如中风、心肌梗塞(MI)、细胞和器官移植中引起急性局部缺血，治疗期的持续时间可以是单次施用，但优选为在例如一周、数周或一个月的治疗期内的若干次施用形式。长达三个月或甚至一年的更长治疗期可进一步改善愈合和恢复。

[0096] 对于间歇型缺血性病症，可以选择使用治疗作为防治(预防)或在疾病恶化后直接治疗。此种类型的施用方案可适于诸如多发性硬化症(MS)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)以及镰形细胞病的疾病。对于恶化后的治疗，治疗期可长达1-3个月。为了预防疾病，可以使用任选更长的治疗期。

[0097] 通过施用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物来诱导受试者血管新生优选在患有导致人类受试者身体局部缺血的疾病、病症或医学疾患的人类受试者中发生。

[0098] 局部缺血是对组织的血液供应的限制，导致细胞代谢所需的氧和葡萄糖短缺。局部缺血通常由血管问题引起，导致组织或器官损害或功能障碍。这还意味着身体的给定部分中的局部贫血和缺氧，所述局部贫血和缺氧有时由充血如血管收缩、血栓或栓塞造成。

[0099] 局部缺血的有效治疗或预防或至少降低患局部缺血的风险的有效方法是诱导血管新生。血管新生使得相关组织中的血流量增加，并且可由此抵消由疾病、病症或医学疾患引起的对组织血液供应的任何限制。

[0100] 所述可引起局部缺血的疾病、病症或医学疾患的非限制性但说明性实例包括：伤口愈合；外周局部缺血，诸如在器官、组织或细胞移植后的局部缺血，外周动脉疾病，肢体局部缺血，不宁腿，雷诺综合征，镰形细胞病，或血栓闭塞性脉管炎；冠状动脉局部缺血，诸如由充血性心力衰竭、心肌梗塞或冠状动脉疾病引起；儿童缺血性疾病，诸如围产期或新生儿疾病、儿童期疾病，例如新生儿缺氧或缺血性脑损伤，窒息性脑病，脑性麻痹；中枢神经系统局部缺血，诸如由创伤性脑损伤、颞动脉炎引起，由多发性硬化症、中风、肌萎缩性脊髓侧索硬化症引起的缺氧；或肌营养不良疾病；由血栓性、出血性或创伤性损伤引起的局部缺血。

[0101] 伤口愈合总体上涉及四个阶段，通常表示为早期、炎症期、增生期以及成熟和重塑期。血管新生是在增生期发生的过程之一。施用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物可以促进作为伤口愈合的子过程之一发生的血管新生效应。当内皮细胞迁移到创伤区域时，在伤口愈合期间血管新生过程与成纤维细胞增殖同时发生。因为成纤维细胞和上皮细胞的活动需要氧和营养物质，所以血管新生对于伤口愈合中的其它阶段(如表皮和成纤维细胞迁移)是必要的。

[0102] 外周局部缺血通常表示在不同于心脏(冠状动脉局部缺血)和中枢神经系统(CNS局部缺血)的组织和器官中发生的缺血状态。外周局部缺血可能有各种原因。典型的实例是将器官或组织移植至受试者。经移植的器官或组织随后通常在从移植时刻发生的初始植入过程期间暴露于局部缺血，直到在经移植的器官或组织周围形成新的血管。如果在移植后不久没有建立足够的血液供应，则由于局部缺血和缺氧，存在器官或组织损害或功能障碍的高风险。因此，根据结合移植的实施方案，用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物诱导血管新生可以显著降低由于局部缺血和/或缺氧引起移植器官或组织损害或功能障碍的风险。根据所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的施用可以在移植之前进行，以便在实际移植事件之前诱导血管新生并在移植部位提供增加的血流量。在这种情况下，用所述实施方案的硫酸葡聚糖诱导血流量增加可足以预防或至少减少对移植器官或组织的缺血性损害。

[0103] 外周血管疾病(PVD)，通常称为外周动脉疾病(PAD)或外周动脉闭塞性疾病(PAOD)或外周闭塞性动脉病，是指不在冠状动脉、主动脉弓脉管系统或脑内的大动脉栓塞。PVD可由动脉粥样硬化，导致狭窄、栓塞或血栓形成的炎症过程引起。其引起急性或慢性局部缺血。PVD的有效治疗是通过施用根据所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物来恢复血流。

[0104] 肢体局部缺血，通常称为急性肢体局部缺血，发生在肢体突然缺乏血流时。急性肢体局部缺血通常是由于栓塞或血栓形成。血栓形成通常由外周血管疾病(导致血管阻塞的动脉粥样硬化疾病)引起，而栓塞可为由于空气、创伤、脂肪，羊水或肿瘤。患有肢体局部缺血的受试者将受益于施用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0105] 在医学上，雷诺现象是响应于冷或情绪应激而过度减少血流量，导致手指、脚趾和偶尔其它区域的变色。雷诺现象本身只是一种伴有症状的病征(灌注不足)。当与发病机理相关时，其可以是雷诺病(也称为原发性雷诺现象)的组成部分，其中病因是未知的，或者是雷诺综合征(继发性雷诺现象)的组成部分，所述雷诺综合征由已知的原发性疾病，最常见的为结缔组织疾病如系统性红斑狼疮引起。雷诺现象是交感神经系统过度活化引起外周血管的极端血管收缩，从而导致组织缺氧。雷诺现象的慢性、复发性病例可导致皮肤、皮下组织和肌肉萎缩，可能引起溃疡和缺血性坏疽。所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的施用可为降低患雷诺综合征或雷诺病的风险，治疗或至少缓解雷诺综合征或雷诺病的症状的有效手段。

[0106] 镰形细胞病(SCD)或镰形细胞性贫血(SCA)或新月形红细胞症是遗传性血液病症，其特征在于红细胞呈现异常、僵硬的镰形形状。镰形化减少了红细胞的柔韧性并且导致血液不能充分流到身体一部分的风险。使用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物诱导血管新生可用于降低患有SCD的受试者发生外周局部缺血的风险。

[0107] 血栓闭塞性脉管炎，也被称为伯格病或早老性坏疽，是手和脚中的小动脉和中动脉以及静脉的复发进展性炎症和血栓形成(血小板凝聚)。血栓闭塞性脉管炎可因此由于这些四肢的血流受限而引起手和脚局部缺血。所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的施用可为增加到手和脚的血流量的有效手段。

[0108] 冠状动脉局部缺血是没有足够血液经过冠状动脉的医学术语。冠状动脉局部缺血与心脏病以及心脏病突发有关。其也被称为心肌局部缺血。冠状动脉疾病(CAD)发生在脂肪物质粘附到冠状动脉壁上时，这会缩窄动脉并使血流收缩。这导致心脏缺氧和局部缺血，此可导致心肌梗塞(心脏病突发)。CAD引起动脉收缩，这导致缺乏血液和氧气流经动脉，即称为动脉粥样硬化的过程。动脉粥样硬化是冠状动脉局部缺血的最常见原因。通过施用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物触发的血管新生诱导来增加心肌中的血流量对于降低因冠状动脉局部缺血引起损害的风险或减少所述损害可为重要的。血栓形成也可为冠状动脉局部缺血的原因。

[0109] 心肌梗塞(MI)或急性心肌梗塞(AMI)，通常被称为心脏病突发，当血流停止到达心脏的一部分从而导致心肌损害时发生。大多数MI是由于冠状动脉疾病发生的。MI的机理通常涉及动脉粥样硬化斑块破裂而导致冠状动脉的完全阻塞。施用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物减小了梗塞尺寸的尺寸。因此，根据实施方案可显著减少由MI引起的对心肌的永久性损害。

[0110] CNS局部缺血可由于各种原因。例如，创伤性脑损伤可能导致对至脑的某部分的血流的阻塞或限制。如果在大脑中发生缺氧，则此类血流量限制可具有严重后果。如通过施用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物引起的血流量增加，可由此用于降低因创伤性脑损伤后局部缺血而引起永久性脑损害的风险。

[0111] 颞动脉炎(也称为巨细胞动脉炎(GCA)，颅动脉炎或霍顿病(Horton disease))是血管的炎性疾病，最常见地涉及头部中的大动脉和中动脉，主要是外颈动脉的分支。颞动脉炎是血管炎的一种形式。如通过施用所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物引起的血管新生诱导和血流量增加可为对患有颞动脉炎的受试者有益的。

[0112] 中风，有时被称为脑血管意外(CVA)、脑血管病变(CVI)或通俗地说脑病突发，是由于对脑血液供应的干扰造成的脑功能损失。这种干扰是由于局部缺血或出血。局部缺血是因通过血栓形成或动脉栓塞引起的血管阻塞，或因全身性灌注不足造成的。出血性中风因脑血管出血直接进入脑实质或进入脑组织周围的蛛网膜下腔引起。患有中风的受试者将受益于增加流向大脑的血流量的治疗，从而降低由供血不足造成损害的风险。因此，有利地将所述实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的施用给予患有中风的受试者。

[0113] 各种神经病症可导致对CNS(诸如脑的一部分)的血液供应的限制。例如，Multiple Sclerosis International 2013,1-6(2013)公开了早期多发性硬化(MS)损伤与缺氧相关。因此，患有MS的受试者可受益于增加的血流量，以便治疗或至少减少或抑制与MS相关的缺氧。

[0114] 肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，也被称为运动神经元病(MND)和路格里克氏病(Lou Gehrig's disease)，是具有各种病因的神经退行性疾病。其特征在于由于肌肉萎缩和肌肉痉挛、说话困难(构音障碍)、吞咽困难(咽下困难)和呼吸困难(喘病)的快速进展性虚弱。实验已经显示ALS与例如前运动额叶区域中的血流量减少相关，Acta Neurologica Scandinavia 116,340-344(2007)。据推测，通过诱导血管新生来增加血流量可为对患有ALS的受试者有益的。

[0115] 根据实施方案诱导血管新生还可用于各种医疗装置、传感器等的植入，其中诱导朝向植入物或与植入物相关的微循环可为有利的。

[0116] 所述实施方案的硫酸葡聚糖可由此用于治疗、抑制或预防各种缺血性疾病、病症和疾患，以及各种疾病、病症和疾患中的缺血性组成部分。

[0117] 本发明实施方案的显著优点是所述实施方案的硫酸葡聚糖能够选择性诱导受试者血管新生，即在需要血管新生的部位(诸如组织或器官)处诱导血管新生。例如，血管新生经诱导而发生在缺血组织中，但不发生在非缺血组织中，如图4所例示，图4示出在缺血右肢中存在小毛细血管形成(如CD-34所示)并确认功能性和活性毛细血管(如由DA所示)，而在非缺血的左肢中则不存在。

[0118] 实施方案的另一方面涉及一种用于诱导受试者中的血管新生的方法。所述方法包括施用平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物至受试者。

[0119] 实施方案的另一方面涉及平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物在制造用于诱导受试者中的血管新生的药物方面的用途。

[0120] 实施方案的另一方面涉及用于增加患有局部缺血的受试者中的的血流量的平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0121] 实施方案的一个相关方面定义了一种用于增加患有局部缺血的受试者中的血流量的方法。所述方法包括施用平均分子量低于10000 Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物至受试者。实施方案的另一相关方面定义了平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物在制造用于增加患有局部缺血的受试者中的血流量的药物方面的用途。

[0122] 在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物能够增加受试者的缺血组织或器官中的血流量。

[0123] 所述组织或器官可以是外周器官、心脏或CNS组织(诸如脑)，如前所述。

[0124] 实施方案的另一方面涉及用于血管化受试者的缺血性组织的平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物。

[0125] 实施方案的一个相关方面定义了一种用于血管化受试者的缺血性组织的方法。所述方法包括施用平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物至受试者。实施方案的另一相关方面定义了平均分子量低于10000Da的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物在制造用于血管化受试者的局部缺血性组织的药物方面的用途。

[0126] 所述缺血性组织可以是外周器官、心脏或CNS组织(诸如脑)，如前所述。

[0127] 由所述实施方案的硫酸葡聚糖诱导或触发的血管形成，即小毛细血管的形成，选择性地发生于受试者的缺血组织中，而不发生于受试者的非缺血组织，即健康组织中。根据所述实施方案诱导的血管形成因此发生在需要其的位置处，而保持健康组织不受影响(没有显著的血管形成)。

[0128] 受试者优选是哺乳动物受试者，更优选灵长类动物，特别是人类受试者。然而，本发明的实施方案也可用于兽医应用。动物受试者的非限制性实例包括灵长类动物、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠。

[0129] 所述实施方案还可以应用于经血管化的组织和/或器官的体外和/或离体治疗，以便在经血管化的组织和/或器官中诱导血管新生，增加经血管化的组织和/或器官中的血流量和/或血管化经血管化的组织和/或器官。

[0130] 在这种情况下，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物可以在各种体外或离体应用中加入到经血管化的组织和/或器官中。例如，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物可以加入到其中经血管化的组织和/或器官在体外浸入或接触的培养基中。可替代地或另外，可用包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的溶液喷射经血管化的组织和/或器官。此外，如果经血管化的组织和/或器官连接到体外循环泵或体外膜肺氧合(ECMO)装置，则可以将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物加入到泵送通过经血管化的组织和/或器官的血液中。

[0131] 实验

[0132] 实施例1

[0133] 重症后肢局部缺血小鼠模型中的血管新生的评价

[0134] 外周动脉疾病(PAD)是外周血管疾病(PVD)的一种形式，其中存在对至肢体(通常为腿)的血液供应的部分或完全阻断，从而导致组织中受损的血流量和缺氧。当PAD进展时，其达到重症肢体局部缺血(CLI)的阶段，所述阶段伴有皮肤溃烂、坏疽和不可避免的截肢。治疗性血管新生作为促进缺血组织中新血管形成的非侵入性手段出现。如本研究中所公开，全身性皮下施用硫酸葡聚糖促进了血管新生，引起小血管形成和内皮细胞增殖。在本研究中稳定的严重局部缺血模型(Journal of Experimental and Clinical Medicine 31,
128-132(2006))应用于评估硫酸葡聚糖在血管新生和功能性结果方面的安全性和功效。

[0135] 材料

[0136] 平均分子量在5-7kDa范围内的硫酸葡聚糖获自pK Chemicals A/S,Denmark。在图1-4、6、7中，硫酸葡聚糖表示为TM-700。

[0137] 在研究开始前一天制备硫酸葡聚糖注射溶液。使用0.9％的NaCl(盐水)(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)作为媒介物。通过向称重的化合物中加入相关体积的NaCl以获得目标施用浓度(10或30mg/kg体重)，从而制备注射溶液。通过涡旋或简单地将试管转动数次来溶解硫酸葡聚糖。将溶液在2-8℃下贮藏过夜以使聚集体稳定化。第二天，涡旋所述试管，并将溶液滤过0.2μm过滤器，以获得无菌溶液。在第7天制备溶液以供在第8-21天使用，并在第21天进行第二次制备以供在第22-35天使用。在施加日期之间将溶液贮藏在2-8℃。

[0138] 从Harlan Laboratories,Israel获得总共60只9周龄的雄性Balb/c小鼠，所述小鼠在研究开始(第0天)时的平均体重为24.7g。每组中所记录的最小和最大值重量在组平均值的±20％范围内。根据美国国立卫生研究院(NIH)和实验动物管理评估及认证协会(AAALAC)处理动物。将动物饲养在测量为42.5×265.6×18.5cm的聚砜(PSU)笼(5只/笼)中，所述笼具有不锈钢顶部网盖以提供条件来在玻璃透明的聚碳酸酯瓶中装入颗粒化食物和饮用水；草垫；使用经蒸汽灭菌的清洁稻谷壳(Harlan，Sani-chip，目录号：106S8216)并将草垫材料与笼一起每周至少更换两次。动物随意饲喂商业啮齿动物饮食(Teklad Certified Global 18％蛋白饮食，目录号：106S8216)。动物可自由获得从市政供应获得的经高压灭菌和酸化的饮用水(pH在2.5和3.5之间)。将动物在标准实验室条件下饲养，用充足的新鲜空气供应(最少15次空气更换/小时)进行空气调节并过滤(HEPA F6/6)。将动物保持在气候受控的环境中。温度范围为20-24℃，且RH范围为30-70％，其中12小时光照和12小时黑暗循环。

[0139] 手术程序

[0140] 在手术当天，用1.5至3.0％的异氟烷、1.5％的N2O和0.5％的O2诱导麻醉。在麻醉下，将小鼠放置成腹部侧朝上。在腹股沟区域的皮肤中切开0.5-1.0cm的切口。将股动脉用6-0丝线在紧接髂动脉的远端部分之后的近侧处结扎并在其与股深动脉分叉之后的远侧处结扎，在两个结扎处之间切断并切除。用4-0丝线闭合伤口，并使小鼠恢复。

[0141] 硫酸葡聚糖处理

[0142] 在手术后第2周第8天，将组2M和组3M中的每只动物s.c.注射硫酸葡聚糖溶液一周三次。将组4M中的动物s.c.注射每周一次，而组1M接受媒介物处理(NaCl)，参见表1。

[0143] 表1–组分配

[0144]

[0145] 体重测量

[0146] 在手术前研究的第-1天和此后每周一次测量体重。在第0天和第7天之间，在所有动物组1M、2M、3M和4M中观察到在1.1g至1.6g的范围内的小量平均体重减少，参见图1。从第14天起，观察到重量逐渐增加。因此，在第0天和第35天之间，体重的平均增加在0.4g至1.7g的范围内，参见表2。

[0147] 表2-按照研究组的相对于基线的平均体重变化

[0148]

[0149] 血流量测量

[0150] 在手术前第-1天和手术后第1天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，用非接触式激光多普勒测量两侧腿中的血流量。血流量测量值表示为局部缺血肢体血流量与正常肢体血流量的比值。

[0151] 所有动物组1M、2M、3M和4M在第1天至第35天表现出经手术肢体中的平均血流量增加，参见图2。手术后，用硫酸葡聚糖处理的组2M(10mg/kg，3次/周)中的平均血流量相对于基线增加了46.7个单位；用硫酸葡聚糖处理的组3M(30mg/kg，3次/周)中的平均血流量相对于基线增加了59.3个单位，并且用硫酸葡聚糖处理的组4M(30mg/kg，1次/周)中的平均血流量相对于基线增加了51.1个单位，相比之下媒介物对照组1M中的平均血流量相对于基线增加了19.5个单位。这表示由于硫酸葡聚糖处理分别导致了2.2倍、3.0倍和2.8倍的平均血流量增加，参见表3和图2。

[0152] 表3-按照研究组的平均血流量变化

[0153]

[0154] 图8比较了在对照小鼠(组1M)和根据组3M用硫酸葡聚糖处理的小鼠中测得的血流量。该图示出了在左后肢的股动脉结扎后35天时的非接触式激光多普勒图像。

[0155] 缺血严重程度的宏观评价

[0156] 通过使用坏死区的形态分级，在第7天对缺血肢进行宏观评价，然后每周评价一次，参见表4。

[0157] 表4-坏死区的形态学分级

[0158]

[0159] 从第7天直至第35天，通过使用分级的坏死区形态学量表来每周宏观地评价缺血肢，参见表4。在用媒介物和硫酸葡聚糖处理的所有动物组中，发现了足趾坏死或足部截肢(分级为1至2，参见表6)。每个处理组中足部截肢的百分比率显示在表5和表6中。在媒介物处理的对照组1M(15.4％)中和在硫酸葡聚糖处理的组4M(30mg/kg，1次/周)(7.1％)中发现了足部截肢。发现媒介物处理对照组1M中的足趾坏死率为23.1％的动物。在用硫酸葡聚糖处理的动物组2M和3M中，在HLI诱导后35天足趾坏死率分别为21.4％和14.3％。在用硫酸葡聚糖处理的动物组4M中，不存在足趾坏死发生率(表6)。

[0160] 表5-在第7天具有足趾和肢体坏死的小鼠的发生率

[0161]

[0162] 表6-在第35天具有足趾坏死和肢体坏死的小鼠的发生率

[0163]

[0164] 肢体功能和缺血性损害的体内评估

[0165] 使用以下量表在手术后每周进行一次对缺血肢体的受损使用的半定量评估，参见表7。

[0166] 表7-肢体功能评估

[0167]

[0168]

[0169] 在部分或完全截肢的情况下，肢体功能被分级为“不适用”。在此类情况下，血液流量测量不包括在统计学分析中。

[0170] 与血液流量测量并行并且与媒介物对照组1M相比，所有硫酸葡聚糖处理组2M、3M和4M在肢体功能改善方面表现出更好的结果，参见下表8和下表9以及图6。

[0171] 表8-在第7天肢体功能评分为0、1、2和3的小鼠的发生率

[0172]

[0173] 表9-在第35天肢体功能评分为0、1、2和3的小鼠的发生率

[0174]

[0175] 免疫组织化学和毛细血管密度分析

[0176] 研究终止时在第36天处死小鼠。对于所有动物在处死前5分钟时，将异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖500000Da缀合物10mg/ml以每只小鼠200μl的剂量i.v.注射。将四头肌解剖成冠状部分。将肌肉在2.5％的新鲜多聚甲醛(pH 7.4)中固定24小时，然后将其包埋在石蜡中以供用小鼠单克隆抗体(抗SMA Ab-1，克隆1A4，1:800，Thermo scientific)对平滑肌肌动蛋白(SMA)进行免疫染色并用抗CD34(1:200，Cedralene)对CD34进行免疫染色。根据标准包埋程序进行石蜡包埋。

[0177] 通过配备有连接到CCD照相机(DMX1200F；Nikon)的平面氟物镜的荧光显微镜(E600；Nikon，Tokyo，Japan)对染色的切片进行评价和照相。在这些条件下，Cy3出显示亮红色荧光：Ex(最大值)：543nm；Em(最大值)570nm，而荧光素葡聚糖显示强烈的绿色荧光(Ex(最大值)：488nm；Em(最大值)：530nm)。收集数字图像并使用Image Pro+软件进行分析。肌肉样品的四个切片取自来自组1M、3M和4M的8只动物的相同区域。测量血管的面积。密度表示为每个视场中的平均毛细血管数。总血管代表所测量区域中的所有血管。

[0178] 在研究的第35天，与对照组1M相比，硫酸葡聚糖处理组3M和4M中的CD34阳性毛细血管的数目更大，参见图3、4以及5A-5C。CD34阳性染色被认为是小毛细血管形成的指征，因此获得的结果支持在用硫酸葡聚糖处理的动物组中观察到的血流改善。葡聚糖染色证实这些毛细血管是起作用和有活性的。SMA染色显示与CD34染色相同的毛细血管形成增加，参见图7。

[0179] 图4清楚地示出所述实施方案的硫酸葡聚糖仅在缺血组织中(即在右肢中)而不在非缺血组织(即左肢中)诱导血管新生。因此，所述实施方案的硫酸葡聚糖仅在需要处导致对血管新生的选择性诱导。

[0180] 受损的血管新生是缺血性疾病的特征之一。治疗性血管新生的大部分已确立靶标已经为VEGF及其受体。然而，关于缓解局部缺血的临床试验令人失望，表明需要新的治疗靶标来治疗缺血性疾病。

[0181] 在本研究中，检查小鼠后肢局部缺血模型中的血流量改善，以评价硫酸葡聚糖的功效。以30mg/kg的剂量重复(每周三次)或(每周一次)硫酸葡聚糖s.c.施用与用媒介物处理的对照相比显著恢复了血液灌注。在第35天，与对照组相比，在硫酸葡聚糖处理组中观察到了高两倍半至三倍的血流量灌注值，其中在治疗后十四天开始具有统计学显著的效果。

[0182] 该研究的集合数据证实了s.c.给予的硫酸葡聚糖用于治疗Balb/c小鼠动物模型中的闭塞性外周动脉疾病的功效。与对照组相比，用硫酸葡聚糖处理的动物的自发性截肢或足趾坏死率也降低。与用媒介物处理的对照相比，硫酸葡聚糖处理改善了所有药物治疗的动物组中的肢体功能恢复。硫酸葡聚糖处理没有引起对所处理动物的任何不利影响。

[0183] 免疫组织化学发现证实了体内结果。总体地，此研究的数据证实了硫酸葡聚糖用于治疗小鼠模型中的闭塞性外周动脉疾病的功效。

[0184] 硫酸葡聚糖治疗后肢局部缺血的小鼠导致血流量显著和快速恢复，如通过激光多普勒所测量并且还通过肢体缺血严重性降低和更快的肢体功能改善所证明。

[0185] 在任何组中都没有记录到对一般健康的不良影响。这些数据通过免疫组织化学评价来确认。这些发现反映了血管形态的变化，即毛细血管密度增加和血管新生。

[0186] 实施例2

[0187] 大鼠中风模型中血管新生效率的评价

[0188] 使用中风tMCAO大鼠模型来评价硫酸葡聚糖处理的功效。在手术程序后两小时时开始，用硫酸葡聚糖经由皮下注射以30mg/kg每周三次或以15mg/kg的日剂量处理大鼠28天。在研究期间，在一系列行为试验中监测神经功能、运动功能和体感功能。

[0189] 用硫酸葡聚糖处理的组和用媒介物处理的对照组之间表现出了明显的差异。两个药物处理组中均表现出了运动功能改善，如通过神经功能评分、踏步试验和身体摆动试验所评价的。感官运动功能也在硫酸葡聚糖处理后恢复。硫酸葡聚糖治疗的效果有可能应归因于它们的血管新生活性。此结论由受影响的脑半球中脑血液灌注和平滑肌肌动蛋白(SMA)阳性毛细血管密度的增加支持。与用媒介物处理的对照相比，硫酸葡聚糖处理还减少了炎性响应。

[0190] 鉴于这些发现，可以得出结论，在大鼠中风模型中硫酸葡聚糖处理明显改善了运动和体感缺陷，以及脑血液灌注和血管新生活性。

[0191] 中风是严重的长期残疾的主要原因，并且是美国的第三大死亡原因。由于中风而致残的总健康成本估计为每年536亿。缺血性中风占所有中风的88％以上，使其成为最常见的脑血管损伤类型。大脑中的缺血性疾患引起神经元死亡，导致永久的感觉运动缺陷。现在清楚的是，在临床环境中对中风患者进行立即治疗通常是不可能的。医师急需用于中风治疗的新治疗策略。

[0192] 已经使用若干种动物模型来研究脑局部缺血，以努力理解其病理生理学并辨识用于最小化缺血性损害的严重性的治疗策略。局灶性局部缺血在大鼠中导致局部脑梗塞并且是由大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的。其已获得越来越多的认可而作为人类脑半球梗塞的模型。在MCAO后，具有时间演变和空间演变的皮质梗塞和纹状体梗塞发生在由大脑中动脉提供的血管区域内。

[0193] 在过去十年中，在中风动物研究中已收集了越来越多用于行为评估的证据。发现功能改善高度可靠地作为治疗功效的量度。

[0194] 中风的血管并发症的最有发展潜力的创新治疗之一是治疗性血管新生，其作为一种非侵入性手段来促进缺血组织中的新血管形成。

[0195] 在本研究中，在瞬态MCAO大鼠中风模型中研究了硫酸葡聚糖的神经保护潜能和康复潜能。

[0196] 材料

[0197] 平均分子量在5-7kDa范围内的硫酸葡聚糖获自pK Chemicals A/S,Denmark。在图9-16中，硫酸葡聚糖表示为TM-700。

[0198] 将硫酸葡聚糖溶于0.9％NaCl(盐水)(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)中，以便以60mg/ml的浓度每周注射三次并以30mg/ml的浓度每日注射。所述配方稳定一周。动物接受0.5ml/kg，等于30和15mg/kg体重。

[0199] 从Harlan Laboratories,Israel获得总共46只雄性SD大鼠，所述大鼠在研究开始(第0天)时的平均体重为342g。每组中所记录的最小重量和最大重量在组平均重量的±20％范围内。根据美国国立卫生研究院(NIH)和实验动物管理评估及认证协会(AAALAC)的指南处理动物。将动物饲养在测得为35×30×15cm的聚乙烯笼(5只/笼)中，所述笼具有不锈钢顶部网盖以助于在塑料瓶中装入颗粒化食物和饮用水；草垫；使用经蒸汽灭菌的清洁稻谷壳(Harlan，Sani-chip，目录号：2018SC+F)，并将草垫材料与笼一起至少每周更换两次。动物随意饲喂商业啮齿动物饮食(Teklad Certified Global 18％蛋白饮食，目录号：
106S8216)。动物可自由获得从市政供应获得的经高压灭菌和酸化的饮用水(pH在2.5和3.5之间)。将动物在标准实验室条件下饲养，用充足的新鲜空气(最少15次空气更换/小时)供应进行空气调节并过滤(HEPA F6/6)。将动物保持在气候受控的环境中。温度范围为20-24℃，且RH范围为30-70％，其中12小时光照和12小时黑暗循环。

[0200] 手术程序

[0201] 在手术当天，用70％N2O和30％O2的混合物中4％的异氟烷诱导麻醉，并用1.5-2％异氟烷保持。

[0202] 根据在Stroke 29,2162-2170(1998)中先前描述的方法进行瞬时大脑中动脉闭塞。通过中线颈切口暴露右颈总动脉(CCA)，并小心地从周围的神经和筋膜切出——从其分叉点到颅骨基部切出。然后分离外颈动脉(ECA)的枕动脉分支，并将这些分支切出并凝聚。将ECA进一步在远侧切出并与末梢舌和上颌动脉分支凝聚，然后分开。分离内颈动脉(ICA)并小心地从相邻的迷走神经分离，并且用5-0尼龙缝合线(SMI，Belgium)将翼腭动脉在靠近其起点处结扎。接下来，将4-0缝合丝线松散地绑在移动的ECA残肢周围，并将4cm长的4-0单丝尼龙缝合线(在插入之前，缝合线的尖端通过使用火焰钝化并且缝合线涂覆有聚赖氨酸)穿过近端ECA插入ICA中，并且从此进入韦利斯氏环(circle of Willis)，从而有效地闭塞MCA。闭合手术伤口并将动物放回其笼中以从麻醉中恢复。闭塞后2小时，将大鼠重新麻醉，取出单丝以使其再灌注，闭合手术伤口并将大鼠放回其笼中。

[0203] 在闭塞后一小时，使用“用于排除标准的神经功能评分”对动物进行神经学评价。只有总评分≥10的动物被包括在研究中。

[0204] 硫酸葡聚糖处理

[0205] 闭塞后2小时开始(紧接于再灌注后)，对组2M和3M(硫酸葡聚糖剂量为每周三次30mg/kg或每日15mg/kg)中的动物和组1M(媒介物对照)中的动物皮下注射，参见表10。

[0206] 表10–组分配

[0207]

[0208] 数据分析

[0209] 除非另有说明，否则所有统计学分析通过使用双因素ANOVA进行重复测量、之后的邦费罗尼事后比较检验来进行。

[0210] 体重

[0211] 在整个研究中，在各处理组之间没有观察到统计学显著的体重差异，参见图9。

[0212] 神经试验评分(神经功能评分)

[0213] 评价：术前，闭塞后1小时以及在第7天、第14天、第21天和第28天[0214] 进行改良的神经评定量表(mNRS)。做出行为评估的个体不知道给予的药物/剂量(盲试)。根据Stroke 32,1005-1011(2001)进行总评分18的神经功能评分。

[0215] 神经功能评分包括用于评估经测试的处理的作用的一组临床神经学试验(运动、感觉、反射和平衡试验的复合)。神经功能评分以0至18的标度分级(其中正常评分为0，并且最大缺陷评分用18表示)。如所预期的，在所有组的大鼠中，在tMCAO诱导后两小时观察到了神经功能的急剧下降，随后神经功能随时间推移而自发改善。在整个研究中从第7天的第一次试验直至第28天，相较于用媒介物处理的对照，在每周三次用30mg/kg硫酸葡聚糖处理的组2M和每天用15mg/kg硫酸葡聚糖处理的组3M中显示出了统计学显著差异，参见图10。在两个给药程序2M和3M之间没有发现统计学差异。

[0216] 踏步试验

[0217] 评价：术前以及在第7天、第14天、第21天和第28天

[0218] 使用踏步试验来测试动物的前肢运动不能。用一只手将动物的后肢和一只前肢固定而握住动物，并使无束缚的前爪沿着桌子拖曳。当动物沿着桌面侧向移动(在约5秒钟内移动85cm)时，对两个前肢在正手和反手的方向上的调整步数计数。

[0219] 在踏步试验中测试动物的前肢运动不能，其通常被用来测量作为动物运动功能的指标的神经肌肉功能。在经受tMCAO的所有动物中观察到了运动功能随时间推移的一些改善，大部分是由于自发功能恢复的结果。然而，与用媒介物处理的对照相比，用硫酸葡聚糖处理的大鼠的功能改善更显著。在第7天的第一次试验开始，与对照相比，动物的两个处理组组2M和3M中的改善达到了统计学显著性，并且继续改善直至第28天研究终止，参见图11。在两个给药程序2M和3M之间没有发现统计学差异。

[0220] 前肢放置

[0221] 评价：术前以及在第7天、第14天、第21天和第28天

[0222] 对于前肢放置试验，检查者将大鼠保持靠近桌面，并且对大鼠响应于触须刺激、视觉刺激、触觉刺激或本体感受性刺激而将前肢放置在桌面上的能力进行评分。获得针对每种感觉输入模式的单独子评分，并将其加总以得到总评分(0＝正常，12＝最大受损)。

[0223] 前肢放置试验(0-12)：

[0224] 触须放置(0-2)；

[0225] 视觉放置(正向(0-2)，侧向(0-2))

[0226] 触觉放置(背侧(0-2)，侧向(0-2))

[0227] 本体感受性放置(0-2)。

[0228] 对于每个子试验，如下对动物评分：

[0229] 0.0＝立即响应

[0230] 0.5＝在2秒内响应

[0231] 1.0＝2-3秒的响应

[0232] 1.5＝>3秒的响应

[0233] 2.0＝无响应

[0234] 前肢放置试验用于评估体感运动缺陷和感觉运动缺陷。与其它试验类似，在经受tMCAO的所有动物中观察到了感觉运动缺陷随时间推移的一些自发改善。然而，与媒介物对照处理相比，用硫酸葡聚糖处理的所有大鼠在第14天开始表现出统计学显著的改善，并持续直至第28天的研究终止，参见图12。在组3M中，感觉运动缺陷的改善在第7天的第一次测试时已达到统计学显著性。

[0235] 身体摆动试验

[0236] 评价：术前以及在第7天、第14天、第21天和第28天

[0237] 使大鼠距其尾巴的基部保持约1英寸。然后将其升高到桌子表面上方一英寸处。将大鼠保持在定义为向左侧或右侧不超过10°的垂直轴上。每当大鼠将其头部从垂直轴移动到任一侧时，记录摆动。在尝试另一次摆动之前，使大鼠返回到垂直位置以对下一次摆动计数。对总共二十次摆动计数。正常大鼠通常具有相等数目的至任一侧的摆动。在局灶性局部缺血后，大鼠趋向于向对侧(在这种情况下为左侧)摆动。身体摆动评分表示为全部摆动中向右摆动的百分比。在中风后第一个月期间，身体摆动评分存在自发性部分恢复(接近50％)。

[0238] 在身体摆动试验中测试动物的前肢运动不能，其通常被用来测量神经肌肉功能。在经受tMCAO的所有动物中观察到了运动功能随时间推移的一些自发改善。然而，与媒介物对照处理相比，用硫酸葡聚糖处理的所有大鼠在第7天开始的第一次试验时表现出统计学显著的改善，并且改善持续直至第28天的研究终止，参见图13。在两个给药组2M和3M之间没有发现统计学差异。

[0239] 脑血流量评估

[0240] 评价：第29天

[0241] 使用Flow-R激光多普勒系统对脑皮质和血管收缩进行血流量评价，其中监测颅内血流量和血管直径(收缩/扩张)。这在中风开始后第29天进行。在动物处于异氟烷麻醉下时进行多普勒程序。

[0242] 还在第29天检查动物的受损脑半球的脑血流量恢复。对比对照的媒介物处理组1M，在所有经受tMCAO并用硫酸葡聚糖处理的动物(组2M和组3M)中观察到了脑血液灌注速率的统计学显著的改善。对比对照，硫酸葡聚糖处理的动物中血管直径比也增大，参见图14和15。

[0243] 样品收集和处死

[0244] 在MCAO后第30天，用氯胺酮/赛拉嗪麻醉大鼠，用4％的缓冲多聚甲醛(PFA)进行经心脏灌注。将收集的大脑在4％缓冲的PFA中固定以用于免疫染色和组织学评价。

[0245] 从来自组1M和3M的六只动物的相同区域取脑样品的两份切片。在显微镜下在总共三个随机视野中对来自每个切片的毛细血管计数。密度表示为每个视场中的平均毛细血管数。在中风后30天时，与用媒介物处理的对照组相比，每天用15mg/kg硫酸葡聚糖处理增加了毛细血管数。

[0246] 相较于用媒介物处理的对照组，作为血管新生功效的结果，在经受tMCAO并每天用15mg/kg硫酸葡聚糖处理的动物中观察到了直径小于30μm的SMA毛细血管数的改善，参见图
16。

[0247] 图17A和17B示出了处理对来自媒介物对照组(图17A)和来自硫酸葡聚糖(15mg/kg，每天)组(图17B)的大鼠的毛细血管密度的影响。

[0248] 死亡率和临床征象

[0249] 研究期间18只大鼠死亡。一只大鼠在刚刚给药前的再灌注后死亡，并且17只大鼠在给药后10小时内死亡(组1M中6只，组2M中6只，且组3M中5只)。在所有动物组中没有观察到与模型无关的不利临床征象。

[0250] 中风tMCAO大鼠模型传统上是用于评价药物治疗的神经保护功效和康复功效的受认可的模型。该模型在本研究中用以评价两种给药程序的硫酸葡聚糖处理的功效。在手术程序后两小时时开始，用硫酸葡聚糖经由皮下注射以30mg/kg每周三次或以15mg/kg的日剂量处理大鼠28天。在研究期间，在一系列行为试验中监测神经功能、运动功能和体感功能。

[0251] 如所预期，在中风诱导后的28天随访期间观察到了神经功能的一些自发性恢复。然而，用硫酸葡聚糖处理的组和用媒介物处理的对照组之间表现出了明显的差异。然而，在两个给药程序之间没有注意到统计学显著差异。两个药物处理组中均表现出了运动功能改善，如通过神经功能评分、踏步试验和身体摆动试验所评价的(图10、11和13)。感官运动功能也在硫酸葡聚糖处理后恢复(图12)。从治疗第7天的第一次测试开始观察到了有益作用，并且有益作用继续改善直至第28天研究终止。所观察到的作用不能归因于一般大鼠的健康差异，因为所有组以相同的速率增加体重，而它们之间没有显著差异(图9)。此外，没有注意到一般临床征象方面的差异。硫酸葡聚糖处理的效果有可能应归因于它们的血管新生活性。这个结论由受影响的脑半球中脑血液灌注和SMA阳性毛细血管密度的增加支持。与用媒介物处理的对照相比，硫酸葡聚糖处理还减少了炎性响应。

[0252] 鉴于这些发现，可以得出结论，在大鼠中风模型中硫酸葡聚糖处理明显改善了运动缺陷和体感缺陷，以及脑血液灌注和血管新生活性。

[0253] 所述实施方案的硫酸葡聚糖由此已经显示为在CLI(实施例1)模型和中风(实施例2)模型中选择性诱导血管新生。实验结果表明即使延迟治疗(在结扎后第15天开始)也是有效的。在3至30mg/kg(s.c.)的区间内的剂量是有效的，并且单剂量、每周一次和每周3次的施用方案都是有效的。组织学记录新形成的功能性血管形成。所述实施方案的硫酸葡聚糖由此在缺血区域中提供选择性作用。

[0254] 实施例3

[0255] 心肌梗塞模型中硫酸葡聚糖的评价

[0256] 本研究评估了硫酸葡聚糖处理在大鼠心肌梗塞模型中的血管新生功效。

[0257] 心脏具有有限的再生能力，因此急性心肌梗塞(MI)所损失的肌肉通常由具有有限血管形成的非收缩性瘢痕组织替代。促进血管新生和组织灌注增加是MI后心脏修复的有前途的策略。

[0258] 材料和方法

[0259] 大鼠心肌梗塞模型涉及用壁内缝合永久性结扎左冠状动脉。手术导致血流闭塞，随后导致严重缺血性损害和心脏壁梗塞。

[0260] 从Harlan Laboratories,Israel获得总共150只雌性SD大鼠，所述大鼠在研究开始(第0天)时的平均体重为178g。向动物随意饲喂商业啮齿动物饮食(Teklad Certified Global 18％蛋白饮食)。动物可自由获得从市政供应获得的经酸化的饮用水(pH在2.5和3.5之间)。将动物在标准实验室条件下饲养。温度范围为20-24℃，且RH范围为30-70％，其中12小时光照和12小时黑暗循环。

[0261] 平均分子量在5-7kDa范围内的硫酸葡聚糖购自pK Chemicals A/S,Denmark。将硫酸葡聚糖溶于0.9％的NaCl(盐水)(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)中，以便以15mg/kg或3mg/kg的剂量皮下注射。

[0262] 在手术当天，用90mg/kg氯胺酮和10mg/kg赛拉嗪的组合麻醉动物。为了诱导MI，在麻醉和镇痛下，通过左胸廓切开术打开大鼠胸腔，去除心包膜，并且将近端左冠状动脉用壁内缝合永久性地闭塞(Circulation 117,1388-1396(2008))。手术后两小时，所有处理组中的每只动物根据表11用硫酸葡聚糖或盐水媒介物s.c.注射。

[0263] 表11–组分配

[0264]

[0265] 在MI诱导后第36天，通过CO2吸入处死大鼠，并且收获心脏并将其在4％缓冲的福尔马林溶液中固定。使用标准组织学程序进行常规石蜡包埋。

[0266] 为了MI尺寸鉴定的目的，使用麦森三色染色(Masson's Trichrome Staining)。将处理组(2M)的九个心脏和未处理组(1M)的八个心脏横向切成五个包埋在石蜡中的切片。在Lika切片机上进行5个5μm的石蜡切片。所有切片根据标准麦森三色方案染色。在计算机成像系统中使切片可视化，并使用ImageJ程序标记和计算梗塞尺寸。梗塞尺寸表示为梗塞面积(未染色)相对于总左心室面积的百分比。对于每只动物，分析5个连续切片，包括含有结扎处的一个切片，并计算每个心脏的所有切片的平均值。使用免疫组织化学标记物(平滑肌肌动蛋白-SMA)来评价血管密度计数。

[0267] 对受影响的心肌区域的梗塞病变边缘进行每1平方毫米的血管密度计数。使用利用X40物镜放大倍数的Olympus BX43显微镜来拍摄照片。使用Media Cybernetics的图象分析软件——Image Pro Plus5.1进行SMA阳性血管的血管密度计数。

[0268] 结果

[0269] 图18示出了MI诱导后35天时的梗塞尺寸。与未处理的对照组相比，所有处理组具有更小的平均梗塞尺寸。处理组2M和对照组1M之间存在显著差异。

[0270] 图19比较了治疗组2M和对照组1M在MI诱导后35天时的SMA染色。硫酸葡聚糖处理导致与媒介物对照相比更高的SMA毛细血管密度。

[0271] 图20A-20C示出了2M处理组中的两只大鼠(图20A和20B)和1M对照组中的一只大鼠(图20C)的血管密度的SMA染色图片。硫酸葡聚糖处理导致与媒介物对照相比更高的SMA血管密度。

[0272] 与对照媒介物处理组相比，硫酸葡聚糖显著减小了处理组2M中大鼠心肌梗塞后的梗塞体积。与对照媒介物处理组相比，相同的硫酸葡聚糖处理组揭示出心脏梗塞区中毛细血管密度增加的趋势。硫酸葡聚糖从而在心肌梗塞后在梗塞区中促进心肌和血管的修复并增强血管新生。这可以改善长期左心室重塑，并增强左心室功能的恢复。

[0273] 实施例4

[0274] 大鼠后肢局部缺血模型中血管新生功效的评价

[0275] 在上述实施例1的研究中，在稳定的小鼠严重局部缺血模型中证明了硫酸葡聚糖的血管生成功效。在本研究中，应用稳定的大鼠严重局部缺血模型(Toakai J Exp Clin Med 31(3),128-13(2006))，来通过使用不同动物物种评估硫酸葡聚糖对血管新生和功能结果的功效。

[0276] 材料

[0277] 在研究开始前一天制备硫酸葡聚糖溶液。使用0.9％NaCl(盐水)作为媒介物。将相关体积的NaCl加入到称重的化合物中以获得6和60mg/ml的浓度，这对应于施用0.5ml/kg以分别获得3和30mg/kg的剂量。通过涡旋或简单地将试管转动数次来溶解硫酸葡聚糖(平均分子量在5-7kDa的范围内，获自pK Chemicals A/S,Denmark)。将溶液在4℃下贮藏过夜以使聚集体稳定化。第二天，涡旋所述试管并滤过0.2μm过滤器，以获得无菌溶液。当在4℃下贮藏时，该制备物被认为在长达15天期间是可靠的。在第7天制备溶液并在第8-21天使用；在第21天进行第二次制备并在第22-28天使用。

[0278] 从Harlan Laboratories,Israel获得90只雄性SD大鼠，所述大鼠在研究开始(第0天)时的平均体重为277g。动物随意饲喂商业啮齿动物饮食(Teklad Certified Global 18％蛋白饮食)。动物可自由获得经酸化的饮用水(pH在2.5和3.5之间)。

[0279] 根据美国国立卫生研究院(NIH)和实验动物管理评估及认证协会(AAALAC)的指南处理动物。将动物饲养在测得为35×30×15cm的聚乙烯笼(3只/笼)中，所述笼具有不锈钢顶部网盖以助于在塑料瓶中装入颗粒化食物和饮用水；草垫：使用经蒸汽灭菌的清洁稻谷壳(Harlan，Sani-chip，目录号：7090A)并将草垫材料与笼一起至少每周更换两次。动物随意饲喂商业啮齿动物饮食(Teklad Certified Global 18％蛋白饮食，目录号：106S8216)。动物可自由获得从市政供应获得的经高压灭菌和酸化的饮用水(pH在2.5和3.5之间)。将动物在标准实验室条件下饲养，用充足的新鲜空气供应(最少15次空气更换/小时)进行空气调节并过滤(HEPA F6/6)。将动物保持在气候受控的环境中。温度范围为20-24℃，且RH范围为30-70％，其中12小时光照和12小时黑暗循环。

[0280] 所有手术程序在麻醉和镇痛(1.5-3.0％异氟烷，1.5％N2O和0.5％O2)下进行。在腹股沟区域的皮肤中切0.5-1.0cm的切口。股动脉和静脉用4-0丝线结扎两次，并在结扎处之间切断。用3-0丝线闭合伤口，并使大鼠恢复。

[0281] 在手术后第2周第8天，组1M、2M和3M中的每只动物s.c.注射一周三次。组4M和5M中的动物在第8天s.c.注射一次，参见表12。

[0282] 表12–组分配

[0283]

[0284] 血流量测量

[0285] 在手术前第-1天和手术后第1天、第7天、第14天、第21天和第28天，用非接触式激光多普勒测量两侧腿中的血流量。血流量测量值表示为缺血肢体中的血流量与正常肢体中的血流量的比值。

[0286] 在第1天和第28天之间，与用媒介物处理的对照相比，所有经处理的动物组表现出手术肢中血流量的显著增加，参见表13和图21。与用媒介物处理的对照相比，用硫酸葡聚糖处理的所有组之间存在统计学显著差异。

[0287] 表13-平均血流量变化

[0288]组 第0天至第28天的平均血流量变化(％)
1M 14.8
2M 47.7
3M 39.1
4M 44.0
5M 41.0

[0289] 图21示出了通过非接触式激光多普勒测量的HLI损伤腿对比未损伤腿之间的血流量的比率。使用双因素ANOVA重复测量之后进行邦费罗尼事后检验，来比较比较不同组。从第14天到第28天，硫酸葡聚糖处理组2M、3M、4M和5M与对照组1M的比较显示出统计学显著差异(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

[0290] 缺血严重性

[0291] 从第7天直至第28天，通过使用分级的坏死区形态学量表来每周宏观地评价缺血肢(参见表4)。在用硫酸葡聚糖和媒介物处理的所有动物组中，没有发现足趾坏死或足部截肢。

[0292] 肢体功能和缺血性损害的体内评估

[0293] 使用在表7中呈现的量表在手术后每周进行一次对缺血肢体的受损使用的半定量评估。由对处理不知情的人员进行评分。

[0294] 在第1天和第28天之间，用硫酸葡聚糖处理的所有动物组与用媒介物处理的对照相比具有肢体功能改善，参见表14和图22。

[0295] 表14–在第28天肢体功能评分0-3的大鼠的发生率

[0296]

[0297] 使用双因素ANOVA重复测量之后进行邦费罗尼事后检验，来比较比较不同组。从第14天到第28天，硫酸葡聚糖处理组2M、3M、4M和5M与对照组1M的比较显示出统计学显著差异(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

[0298] 免疫组织化学和毛细血管密度分析

[0299] 从来自组1M、2M、3M、4M、5M的6只动物的相同区域取得四份肌肉样品切片，并使用抗SMA和因子8的抗体对血管进行染色。通过使用图像分析来评价血管面积。密度表示为每个视场中的平均毛细血管数。总血管代表所测量区域中的所有血管。在研究的第28天，与对照组1M相比，所有硫酸葡聚糖处理组2M-5M中右缺血肢中的SMA和因子8阳性毛细血管的数目更大，参见图23。SMA和因子8阳性染色被认为是大鼠中小毛细血管形成的指征，因此获得的结果支持在用硫酸葡聚糖处理的动物组中观察到的血流改善。使用双因素ANOVA之后进行邦费罗尼多重比较来进行统计学分析，*/**表示p<0.05/0.01。

[0300] 血管造影术分析

[0301] 在诱导后肢局部缺血后28天时，通过图像分析测定充满造影剂的血管之间的交叉数目。血管造影术揭示，与媒介物处理的对照组相比，用硫酸葡聚糖处理的大鼠中的受影响肢体中有显著大量的侧支(根据单因素ANOVA之后进行邦费罗尼事后检验，p<0.01和p<0.001)，参见图24和图25A-25D。

[0302] 受损的血管新生是缺血性疾病的特征之一。治疗性血管新生的大部分已确立靶标为VEGF及其受体。然而，关于缓解局部缺血的临床测试令人失望，表明需要新的治疗靶标来治疗缺血性疾病。

[0303] 在本研究中，检查大鼠后肢局部缺血模型中的血流量改善，以评价硫酸葡聚糖在两种不同剂量和处理方案中的功效。以30和3mg/kg的剂量每周s.c.施用三次或在第8天以单剂量施用硫酸葡聚糖相较于用媒介物处理的对照在手术后第14天显著恢复的血液灌注和改善肢体功能评分。两种剂量和施用方案都是有效的。在处理动物组或对照动物组的任一者中没有发生自发性截肢或足趾坏死。硫酸葡聚糖处理没有引起对所处理动物的任何不利影响。与媒介物处理组相比，用硫酸葡聚糖处理的所有动物组中的血管造影术评分(侧支动脉扩张的量度)显著更大，在各处理组之间没有统计学差异。在硫酸葡聚糖处理后SMA和因子8毛细血管密度也增加。总体地，该研究的数据证实了硫酸葡聚糖用于治疗大鼠后肢局部缺血模型中的闭塞性外周动脉疾病的治疗性功效。

[0304] 上述实施方案应理解为本发明的几个说明性实例。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对实施方案进行各种修改、组合和改变。具体地，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可以在其它配置中组合。然而，本发明的范围由所附权利要求书限定。