用于制备茚三酮试剂的装置和方法

摘要

提供了用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的方法，所述方法包括用UV光照射含茚三酮的组合物。还提供了用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的设备，所述设备包括导管，其具有用于接收含茚三酮的组合物的入口和用于排出茚三酮试剂的出口；和光源，其用于在所述导管内用UV光照射所述含茚三酮的组合物。用于分析一种或多种含氮化合物的方法包括在活化区域中用UV光照射含茚三酮的组合物，以产生茚三酮试剂；和使所述茚三酮试剂与含氮化合物在反应区域中接触。

权利要求

1.用于分析一种或多种含氮化合物的方法，所述方法包括：在活化区域中用UV光照射含茚三酮的组合物，以产生包含还原茚三酮的茚三酮试剂，其中所述含茚三酮的组合物不包含还原茚三酮或还原剂；

其中UV光的强度被用于控制茚三酮试剂中的还原茚三酮的浓度；和使所述茚三酮试剂与含氮化合物在反应区域中接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述活化区域内的温度低于100℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应区域内的温度在100℃至160℃范围内。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述反应区域内的温度在120℃至135℃范围内。

5.根据权利要求1所述的方法，其中组分在所述反应区域中的停留或驻留时间在10至

180秒范围内。

6.根据权利要求5所述的方法，其中组分在所述反应区域中的停留或驻留时间在30至

60秒范围内。

7.根据权利要求1所述的方法，其中存在于所述含茚三酮的组合物中的茚三酮浓度为

0.1％至5％w/v。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述含茚三酮的组合物包含含水缓冲液。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述含水缓冲液包含弱酸及其共轭碱/盐之一。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述含水缓冲液将pH保持在介于3至7之间的值。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述含茚三酮的组合物还包含一种或多种有机溶剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述有机溶剂选自二甲亚砜，乙二醇，丙二醇，环丁砜，卡必醇，丙二醇单甲醚，甲基溶纤剂，甲醇，乙醇和丙醇。

13.根据权利要求11所述的方法，其中有机溶剂的浓度为5％v/v至75％v/v。

14.根据权利要求1所述的方法，其中形成的还原茚三酮的浓度为0.01至0.3％w/v。

15.根据权利要求14所述的方法，其中形成的还原茚三酮的浓度为0.01至0.15％w/v。

16.根据权利要求1所述的方法，其中将一个或多个UV光源用于用UV光辐射含茚三酮的组合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述UV光源包括发光二极管(LED)。

18.根据权利要求1所述的方法，其中将UV光源构造为发射具有在190nm至430nm范围内的波长的UV光。

19.根据权利要求18所述的方法，其中将UV光源构造为发射具有在350nm至370nm范围内的波长的UV光。

20.根据权利要求19所述的方法，其中将UV光源构造为发射具有365nm波长的UV光。

21.根据权利要求1所述的方法，其中由所述UV光源发射的光的强度在10mW至10,000mW范围内。

22.根据权利要求1所述的方法，其中将所述含茚三酮的组合物用UV光照射2至10分钟。

说明书

用于制备茚三酮试剂的装置和方法

[0001] 本发明涉及用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的新方法。本发明进一步涉及用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的新装置。

[0002] 氨基酸是形成蛋白质的组成部分，蛋白质进而在许多生物学过程中起关键作用。在一些情况下，个体中存在或不存在特定的氨基酸可能严重影响他们的健康。例如，患有遗传代谢障碍苯丙酮尿症的个体不能代谢苯丙胺，苯丙胺的积聚严重影响他们的脑发育。因此，用于检测氨基酸或测定蛋白质的氨基酸组成的方法对正确诊断和治疗疾病而言是至关重要的。类似地，这样的方法对于分析商业药品、食品和食物以及蛋白质和酶研究和开发而言是重要的。更一般地，含氮化合物的检测和识别应用于广泛的学科，包括农业、生物化学、临床、环境、食品、法医、组织化学、微生物、医学、营养学、植物和蛋白质科学。

[0003] 在二十世纪五十年代，由Moore、Stein和Spackman开发了第一种自动化的氨基酸分析方法(Spackman DH,Stein WH,and Moore S.Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids.Anal Chem,1958,30:1190-1206)。该多阶段过程包括通过离子交换液相色谱法分离氨基酸。然后从反应物储存器泵送茚三酮试剂，与来自离子交换柱的洗脱液混合并且经过钢或塑料反应盘管，并且加热至反应所需要的温度。

[0004] 茚三酮试剂与氨基酸和相关的胺化合物反应以形成高度着色的反应产物，可以使用分光光度计进一步分析所述反应产物。基于每种氨基酸的迁移特性和在色谱图上的位置确立其身份。通过在分光光度计中借助在特定波长处的吸收所检测到的经着色的产物的强度测定每种氨基酸的浓度。

[0005] 茚三酮与氨基酸或胺之间的颜色反应在室温下非常缓慢。其在升高的温度下明显更快，但是即使在130℃以上仍然花费许多分钟。为了保持良好的色谱性能，需要所述颜色反应在大约一分钟以内的时间内进行。为了实现这一点，还原茚三酮(茚三酮的还原形式)对于茚三酮试剂有效和提供可接受的反应速率而言是必需的。已存在许多用于解释还原茚三酮在升高的温度加速形成经着色产物的能力而提出的原因或机理。一种建议在于还原茚三酮起反应中间体之一的稳定剂的作用。

[0006] 然而不幸的是，还原茚三酮在空气存在下特别不稳定，空气中的氧气将还原茚三酮快速氧化成茚三酮。仅需要相对少量的空气以严格耗尽反应物中的还原茚三酮的量并因此实质上降低光度分析中的颜色产生的敏感性。可以将惰性气氛(通常为氮气)用于茚三酮试剂的制备中以及使用期间，以试图减少还原茚三酮的氧化。可以理解的是，对惰性气氛的要求导致对复杂设备和处理程序的需求，以确保对快速氨基酸分析而言重要的还原茚三酮在其使用之前和/或期间不以不可接受的速率劣化。此外，还原茚三酮在完全水性介质中是不溶的。因此，对其储存和使用而言要求大量的有机溶剂。

[0007] 鉴于上述，由Moore、Stein和Spackman开发的方法利用了包含茚三酮和能够还原茚三酮的还原剂的反应物，以在需要时形成还原茚三酮。在使用之前，将会通过将乙酸钠缓冲液、茚三酮和还原剂氯化亚锡混合在一起制备茚三酮试剂。然后从反应物储存器泵送茚三酮试剂，与来自离子交换柱的洗脱液混合，并经过钢或塑料反应盘管，和加热至反应所需温度。

[0008] 即使在室温下，氯化亚锡的强还原活性导致的不利之处在于，必须首先在惰性容器中制备所述反应物，以使得还原茚三酮的氧化风险最小。进一步地，已知氯化亚锡导致氢氧化锡化合物沉淀，其可能堵塞分析设备。

[0009] 早已研究氯化亚锡的替代性还原剂，如氰化物、亚钛盐、硼氢化物和抗坏血酸。这些强还原剂在室温立即与茚三酮反应以产生还原茚三酮。商业上因为毒性问题和缺乏必要的稳定性而不能使用氰化物。对硼氢化钠和抗坏血酸还原剂进行了更认真的研究。例如，US 3,778,230和US 4,274,833公开了包含抗坏血酸和硼氢化钠或氯化亚锡分别作为还原剂的茚三酮试剂。然而，同样必须首先在惰性容器中在环境温度制备这些试剂，以使还原茚三酮的氧化风险最小。尤其参考US 3,778,230和将抗坏血酸用作还原剂，严重的不利之处在于负面影响结果准确性的有色副产物的产生。

[0010] 替代性方法和当今最普遍使用的一种为将还原茚三酮直接添加至包含茚三酮的试剂中。不使用还原剂。一旦形成包含茚三酮和还原茚三酮的试剂，则可以将其用于氨基酸分析仪。

[0011] 实践中不可能在将茚三酮与既有的还原剂混合时或在使用既有的茚三酮试剂期间，在标准氨基酸分析仪上完全排除空气。因此，在既有的试剂中的还原茚三酮浓度不可避免地稳定地降低，直至不能发生颜色反应。出于该原因，包含还原茚三酮的既有的茚三酮试剂具有不长于一个月并且有时短至两周的有限寿命。

[0012] US 3,632,496中提供了一种方案。该文献公开了包含茚三酮的试剂的方法和设备。所述设备包括具有贯穿其中的通道的伸长的导管，在一端用于接收试剂的入口和在另一端用于排出经活化的试剂的出口。所述通道通过能够以电解方式将茚三酮还原成还原茚三酮的经金属涂覆的树脂珠粒表面限定。在优选的实施方案中，提供电极，用于使电流通过据称促进茚三酮到还原茚三酮的还原的试剂。

[0013] 虽然并不需要还原剂，但是US 3,632,496中所公开的方法需要非常复杂的设备来实施。例如，用于形成经金属涂覆的树脂珠粒的方法特别复杂。此外，通道内的高表面积将容易受污染。来自试剂的杂质的任何吸附会影响所产生的还原茚三酮的浓度，导致获得精确结果的困难。因此很可能的是会需要频繁替换树脂珠粒，特别是在以商业规模或在繁忙的实验室中使用设备时。进一步地，所公开的茚三酮试剂需要溶剂的存在，明显增加了试剂的总体成本。

[0014] 因此，用于制备茚三酮试剂从而使得仅在需要时形成还原茚三酮的替代性方法是必需的。如果这样的方法可以使用相对简单和廉价的设备实施，则会是有利的。

[0015] EP 2 735 876是涉及用于分析氨基酸的方法和与其一起使用的试剂的目前的公开。

[0016] 在第一方面，本发明提供了制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的方法，所述方法包括：

[0017] 用UV光照射含茚三酮的组合物。

[0018] 在本发明的方法中，从作为起始原料的含茚三酮的组合物形成茚三酮试剂。根据本发明的方法形成的茚三酮试剂包含来自含茚三酮的组合物的组分和还原茚三酮。在下文更详细地描述含茚三酮的组合物的组分。一旦根据本发明的方法制备了茚三酮试剂，则可以将所述试剂按照已知和标准的程序和方法用于检测含氮化合物，包括但不限于氨基酸。如下文更详细地讨论，含茚三酮的组合物并不需要包含还原茚三酮或还原剂。事实上，在优选的实施方案中，含茚三酮的组合物基本上不含还原茚三酮和/或任何还原剂。结果是，含茚三酮的组合物的组分在氧气存在下是高度稳定的并且因此并不需要单独储存并且在紧邻使用前预混合。本发明的茚三酮试剂通常可以用作可视化剂，前提是测试样品包含一种或多种有机含氮化合物。

[0019] 如上文所讨论，本发明提供了制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的方法。

[0020] 用于本发明的方法中的含茚三酮的组合物可以以任意合适的量包含茚三酮。优选地，组合物中的茚三酮的浓度为0.1％至5％w/v。更优选地，茚三酮的浓度为0.7至2.5％w/v。还更优选地，组合物中的茚三酮的浓度为1至2％w/v。通常，存在于待处理的组合物中的茚三酮的量将取决于诸如以下因素：产物组合物中所需要的还原茚三酮的浓度和照射所述组合物的条件。

[0021] 在优选的实施方案中，含茚三酮的组合物包含茚三酮和含水缓冲液。茚三酮和合适的含水缓冲液都是商业上可得的并且以既有的茚三酮试剂形式使用。

[0022] 可以将任意合适的含水缓冲液用于茚三酮试剂。合适的缓冲液是本领域已知的。优选的是酸性缓冲液。更优选地，优选弱酸性缓冲液，从而将pH保持在介于3至7之间，更优选4至6，还更优选4.5至5.5的值。特别合适的pH为约5.2。

[0023] 可以从任意弱酸及其共轭碱/盐之一制备缓冲液。酸可以为有机酸或无机酸。优选的是有机酸，其实例包括低级羧酸，特别是具有1至6个，更优选1至4个碳原子的羧酸，特别优选的是乙酸、醋酸和丙酸。一个优选的组合是乙酸及其盐之一。

[0024] 酸盐可以为任意合适的盐。盐可以由任意金属阳离子形成。合适的盐包括具有来自周期表第I族或第II族的金属阳离子的那些。然而优选的是，由任一种碱金属，特别是锂、钠或钾形成盐。

[0025] 还原茚三酮不溶于完全水性介质。鉴于此，不能在没有大量有机溶剂的存在下制造或使用既有的茚三酮试剂(包括还原茚三酮)。然而本发明的有利之处在于，本发明中用于形成茚三酮试剂的含茚三酮的组合物不必包含有机溶剂或有机溶剂的混合物。结果是制造成本得以降低，试剂对环境伤害较小并且废弃物处置程序得以简化。因此，在一个实施方案中，含茚三酮的组合物基本上不含有机溶剂。

[0026] 不存在有机溶剂可能增加所产生的还原茚三酮沉淀的风险，由此影响试剂用于氨基酸分析时的效力。尽管如此，通过本发明的方法产生的茚三酮试剂在用于氨基酸分析时提供了可接受的结果。在下文更详细地讨论对此的原因。

[0027] 然而，在替代性和优选的实施方案中，含茚三酮的组合物和所产生的茚三酮试剂二者包含茚三酮、合适的缓冲液和有机溶剂或有机溶剂的混合物。典型地以商业上可得的试剂形式使用和适合用于本发明中所使用的含茚三酮的组合物的有机溶剂包括二甲亚砜，乙二醇，丙二醇，环丁砜，羟基醚如卡必醇、丙二醇单甲醚和甲基溶纤剂和简单的醇，如具有1至4个碳原子的低级醇，特别是甲醇、乙醇和丙醇。可以单独或以两种或更多种溶剂的混合物形式使用溶剂。

[0028] 在该替代性实施方案中，存在于含茚三酮的组合物中的有机溶剂的总浓度将根据有机溶剂的特性而变化。特别是，所使用的有机溶剂的总浓度将从5％v/v至75％v/v变化。更优选地，所使用的有机溶剂的总浓度将从25％v/v至65％v/v变化。还更优选地，所使用的有机溶剂的总浓度将从40％v/v至60％v/v变化。

[0029] 如上文所讨论，本发明的方法包括用UV光照射含茚三酮的组合物。茚三酮吸收在150至430nm区域内的波长的电磁辐射。

[0030] 如上文所讨论，本发明的方法包括用UV光照射含茚三酮的组合物的步骤。可以使用能够辐射UV光的任意光源。此外，可以使用一种或多种UV光源。可以使用在一个波长或多个不同波长处的UV辐射。可以使用单UV源或多个不同的源产生UV辐射的不同波长。

[0031] 在优选的技术方案中，UV光源包括一个或多个发光二极管(LED)，将其用于用UV光照射含茚三酮的组合物。已发现使用LED作为UV光源提供了对还原茚三酮形成速率的提高的控制。特别是，使用LED光源可以更容易地控制UV光强度。控制UV光强度提供了对由茚三酮形成还原茚三酮的速率的增强的控制；特别是可以使用较短的反应时间。当将根据本发明的方法形成的茚三酮试剂用于氨基酸分析时，这是特别有利的。事实上已发现，即使从LED光源发射的低强度UV光也足够快速地诱导目的在于氨基酸分析的还原茚三酮的形成。此外，LED与传统UV灯(如基于汞、氘、氙和卤素气体和蒸气的那些)相比通常需要较小功率并且产生少得多的热量。

[0032] 将用于本发明的方法中的UV光源用于诱导存在于含茚三酮的组合物内的茚三酮的至少一部分转化，以形成还原茚三酮。如上文所讨论，含氮化合物与茚三酮之间的快速成色反应需要还原茚三酮。然而，还原茚三酮在空气存在下是特别不稳定的，空气中的氧气快速地将还原茚三酮氧化成茚三酮。此外，过多的还原茚三酮可能从溶液中沉淀出来。然而，本发明的方法的有利之处在于，可以严密控制还原茚三酮形成的速率，从而防止过高浓度的还原茚三酮形成并且避免对进一步加工产生负面影响。

[0033] 优选控制使用本发明的方法产生的还原茚三酮的浓度，使得形成最小浓度的还原茚三酮，但是其提供在氨基酸分析期间的最大灵敏度。为了获得所需要的最小浓度的还原茚三酮，将含茚三酮的组合物用UV光照射不长于60分钟，更优选至多40分钟，还更优选至多20分钟，甚至还优选至多10分钟，甚至还更优选2至10分钟。当使用较高强度的UV辐射，例如通过使用更大数量的UV光源时，可以实现短于2分钟的反应时间。

[0034] 所需要的还原茚三酮的最小浓度将根据用于含氮化合物的分析的方法和设备而变化。对于氨基酸分析方法而言，使用标准氨基酸分析仪，要求0.01至0.3％w/v，更优选0.05至0.2％w/v，还更优选0.10至0.14％w/v，甚至还更优选在或约0.12％w/v的最小浓度。

[0035] 只要含茚三酮的组合物包含大量有机溶剂，特别是至少50％的有机溶剂，则上述浓度是必要的。在其中含茚三酮的组合物不包含有机溶剂的情况下，需要0.01至0.15％w/v，更优选0.03至0.10，还更优选0.06至0.10％w/v，甚至还更优选在或约0.08％w/v的还原茚三酮的最小浓度。

[0036] 如上文所讨论，可以将本发明的方法用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂。特别是，用UV光照射含茚三酮的组合物，从而形成最小浓度的还原茚三酮。一旦已根据本发明的方法制备茚三酮试剂和已形成最小浓度的还原茚三酮，就可以储存茚三酮试剂或将其直接用于含氮化合物的分析。有利地，一旦已根据本发明的方法制备茚三酮试剂，则不继续形成还原茚三酮。这样的有利之处在于，存在于茚三酮试剂内的还原茚三酮的浓度在储存期间或在用于氨基酸分析方法期间并不增加，提供对还原茚三酮的形成的增强的控制。

[0037] 可以通过控制由UV光源发射的波长或波长范围而更容易地控制使用本发明的方法产生的还原茚三酮的浓度。当被构造来发射UV光时，LED典型地发射具有在300至400nm区域内的波长的电磁辐射。然而，已发现采用在190nm至430nm区域内，优选220nm至390nm，更优选在260nm至380nm区域内，还更优选300nm至380nm，甚至还更优选340nm至370nm，甚至还更优选350nm至370nm，甚至还更优选360nm至365nm波长照射茚三酮导致快速形成还原茚三酮。特别优选的波长为365nm。因此，优选的是使用构造来发射前述波长内的UV光的UV光源。

[0038] 此外，可以通过控制由UV光源发射的光的强度而更容易地控制使用本发明的方法产生的还原茚三酮的浓度。可以通过改变供应至UV光源的电压和/或电流控制由UV光源发射的光的强度。特别是已发现，使用有限电流脉冲宽度调制在控制供应至LED光源的电压和/或电流方面是特别有效的。脉冲宽度调制技术是已知的和通常使用的。

[0039] 由UV光源发射的光的强度可以取决于用UV光照射含茚三酮的组合物的速率以及所使用的光源数目而变化。例如，由UV光源发射的光的强度可以在10mW至10,000mW的范围内。

[0040] 在优选的实施方案中，将UV光源用于照射含茚三酮的组合物，其中组合物处于室温，即介于0℃和50℃之间，更优选介于20℃和30℃之间，甚至还更优选介于20℃和25℃之间。在替代性实施方案中，将UV光源用于在高于室温，例如高达且包括250℃的温度照射含茚三酮的组合物，尽管这是不那么优选的。

[0041] 在一个特别优选的实施方案中，将含茚三酮的组合物以在低于100℃的温度的组合物的形式照射。

[0042] 根据本发明的另一方面，提供了通过如前文所描述的方法可获得的茚三酮试剂用于含氮化合物的分析，特别是氨基酸分析的用途。

[0043] 如上文所讨论，用于制备或使用茚三酮试剂从而用于含氮化合物的分析如用于氨基酸分析中的既有装置是复杂的。这是由于准备用于包含不稳定的还原茚三酮的储存的组合物的稳定环境中涉及的复杂性。相反地，本发明的方法允许使用较简单的设备，特别是简单的设备来照射含茚三酮的组合物而在期望的分析程序之前的短时间内或在用于期望的分析程序中时形成还原茚三酮。

[0044] 因此，在本发明的另一方面中提供了用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的设备，所述设备包括：

[0045] 导管，其具有用于接收含茚三酮的组合物的入口和用于排出茚三酮试剂的出口；和

[0046] 光源，其用于在所述导管内用UV光照射含茚三酮的组合物。

[0047] 本发明提供了用于制备用于含氮化合物的分析的茚三酮试剂的设备。一旦使用本发明的设备制备，则可以根据已知和标准的程序和方法将茚三酮试剂用于检测含氮化合物，包括但不限于氨基酸。

[0048] 如上文所述，使用本发明的设备形成的茚三酮试剂包含来自含茚三酮的组合物的组分和还原茚三酮。提供至导管的含茚三酮的组合物包含茚三酮，但不需要包含还原茚三酮或上述能够还原茚三酮以形成还原茚三酮的还原剂。事实上，在优选的实施方案中，含茚三酮的组合物基本上不含还原茚三酮和/或任何还原剂。已在上述关于本发明的第一方面描述了含茚三酮的组合物的其它组分。

[0049] 在使用中，将含茚三酮的组合物经由入口进料至导管。当存在于导管中时，使含茚三酮的组合物用UV光照射，从而使得一部分茚三酮转化成还原茚三酮。一旦形成需要的量的还原茚三酮，则是使包含茚三酮和还原茚三酮的混合物的茚三酮试剂经由出口离开导管。如上文所讨论，可以将使用本发明的设备和方法制备的茚三酮试剂用于含氮化合物的分析，例如氨基酸分析的目的。

[0050] 设备的导管可以具有适合于在用UV光照射时保持含茚三酮的组合物的任意形状或构造。优选地，导管在形式方面通常是长形的。更优选地，使导管成形，使得导管的横截面沿其长度是均匀的，从而可以更容易地控制还原茚三酮的形成速率。在优选的实施方案中，以圆柱形管的形式，优选以圆柱形盘管或反应盘管的形式提供导管。也可以使用圆柱形管的“编结”布置，以更好地将茚三酮试剂暴露至UV辐射。

[0051] 导管可以由耐穿过或其中的物质的组分的任意材料形成。合适的材料是本领域已知的。在优选的实施方案中，导管的至少一部分的材料是对在UV光谱中的电磁辐射透光的。优选地，导管的至少一部分由对在150nm至450nm区域内的波长，更优选200nm至420nm区域内的波长，更优选在或约365nm的电磁辐射透光的材料形成。这样的材料包括但不限于，玻璃、石英和塑料。

[0052] 如上文所讨论，当存在于导管中时，将含茚三酮的组合物用UV光照射，使得一部分茚三酮转化成还原茚三酮。当由诸如玻璃和/或石英的材料形成时，导管能够将其自身支撑在正确位置，其为其中能够用UV光照射导管的一部分，更优选整个导管的位置。然而，当由诸如塑料的材料形成时，导管可能并不能将其自身支撑在正确位置。因此，当导管由诸如塑料的材料形成时，优选使用固定装置以将导管固定在正确位置。

[0053] 可以使用能够将导管固定在正确位置的任何装置。例如，可以以能够将导管固定在正确位置的紧固件的形式提供固定装置。替代性地，固定装置可以形成用于将导管支撑在正确位置的支撑件。导管可以围绕支撑件的外围缠绕并且将支撑件置于正确位置。支撑件可以具有任意合适的形状和尺寸并且由任意合适的材料制成。优选地，支撑件由对在150nm至450nm区域内的波长，更优选在200nm至430nm区域内，更优选在或约365nm的波长的电磁辐射透光的材料制成。这样的材料包括但不限于，玻璃、石英和塑料。

[0054] 在一个实施方案中，支撑件是UV光的源和导管围绕支撑件的缠绕，从而支撑支撑件并通过支撑件照射。在该实施方案中，UV光源优选通常是长形的和圆柱形的，尽管要意识到的是可以使用其它形状。

[0055] 导管的入口和出口可以由导管的壁中的相同的开口形成。以该方式，含茚三酮的组合物和茚三酮试剂分别经由相同的开口进入和离开导管。

[0056] 更优选地，入口和出口由不同的开口形成。以该方式，可以更简单地实现进入和离开导管的含茚三酮的原料的恒定流。在优选的实施方案中，导管在形状方面是长形的和圆柱形的，并且在导管的各端部提供入口和出口。

[0057] 导管的设计，特别是导管的长度和内径将根据随后用于氨基酸分析方法所需的还原茚三酮的浓度而变化。与导管的设计相关的其它因素包括含茚三酮的组合物通过导管的流速和待用UV光照射含茚三酮的组合物的强度。这些因素都是相关的并且可以按需要而变化。

[0058] 本发明的设备包括一个或多个UV光源，用于用UV光照射含茚三酮的组合物。所使用的一个或多个UV光源可以位于导管以内。替代性地并且更优选地，UV光源位于导管以外，其中UV光穿过导管的壁来照射其中的内容物。

[0059] 如上文所讨论，本发明的设备包括一个或多个光源，用于用UV光照射含茚三酮的组合物。可以使用能够辐射UV光的任意光源。例如，可以使用UV灯，尤其如基于LED、汞、氘、氙、卤素以及激光二极管的那些。也可以使用光纤从分光仪器如分光光度计输送UV光。在优选的实施方案中，使用构造为发射UV光的LED。如上文关于本发明的第一方面所讨论，LED光源提供对还原茚三酮的形成速率的增强的控制。此外，LED光源需要比UV光的其它源更低的功率。

[0060] 可以以任意方式相对于导管定位UV光源。更优选地，相对于导管定位光源，使得全部或多数导管用UV光照射。例如，如果在长形的导管，如圆柱形导管的情况下，可以将光源围绕所述导管的外围定位。替代性地，可以将导管围绕所述光源的外围定位。

[0061] 如上文所讨论，可以使用一个或多个UV光源。然而优选地，使用多个UV光源。更优选地，还使用一个或多个冷却的源，如风扇、水夹套和/或散热件，其能够将一个或多个UV光源的温度维持在例如室温。散热件特别适合于在运行期间实际上产生非常少的热的LED。散热件是公知的并且是市售可得的。在优选的实施方案中，将光源的温度维持在介于0℃和50℃，更优选介于20℃和30℃之间，甚至还更优选介于20℃和25℃之间。

[0062] 在优选的实施方案中，将导管容纳在外壳之内。以该方式，可以将外壳成形以汇聚由光源发射的UV光。外壳可以具有能够包围导管的任意形状。例如在一个实施方案中，外壳为正方形或矩形形状。

[0063] 在该优选的实施方案中，UV光的源可以位于外壳外部，例如在外壳的外表面上或邻近外壳的外表面。外壳的外表面的至少一部分，优选邻近UV光源的外表面的部分由对电磁辐射透光的材料形成。以该方式，可以将由UV光源辐射的UV光导向存在于外壳内的导管。这样的材料已在上文讨论过并且包括但不限于，玻璃、石英和塑料。在其中导管由诸如塑料的材料形成的情况下，该布置的有利之处在于，密封外壳并且在纺织导管降解的惰性气体中用UV光照射导管。

[0064] 更优选地，UV光的源位于导管与外壳之间。例如，UV光的源可以位于外壳的内表面上或邻近外壳的内表面。更优选地，将光源定位在外壳的内表面上或邻近外壳的内表面，使得导管的至少主要部分或全部被UV光照射。替代性地，在上文所讨论的其中光源形成导管的支撑件的实施方案中，可以在外壳内的任何地方提供光源，例如在外壳的内表面上或邻近外壳的内表面。

[0065] 在优选的实施方案中，内表面，更优选外壳的内表面包括反射性材料，以保证导管的至少主要部分或全部被UV光照射。特别优选的反射性材料包括但不限于，铝和钢和具有镜面的其它材料。

[0066] 在特别优选的实施方案中，将通常圆柱形的导管容纳在外壳内，所述外壳包括用于接收导管的入口的第一开口和用于接收导管的出口的第二开口。第一和第二开口可以位于外壳上的任何地方。更优选地，第一和第二开口位于所述外壳的相对侧，并且导管在第一和第二开口之间延伸。以该方式，可以从外壳外侧进入导管。在使用中，可以将含茚三酮的组合物的连续料流递送至导管的入口并且通过外壳中的各开口通过导管的出口排出。

[0067] 在该特别优选的实施方案中，将一个或多个光源邻近外壳的内表面或在外壳的内表面处定位，从而将UV光导向圆柱形导管的外围。替代性地，如上文所讨论，可以由一个或多个光源支撑导管并且用一个或多个光源的UV光照射。优选在外壳外部的表面上提供一个或多个散热件，以引导由UV光源产生的热远离外壳。

[0068] 如前文所讨论，本发明的设备和方法可以并且优选使用不包含还原茚三酮并且基本上或完全不含有机溶剂和/或还原剂的含茚三酮的组合物。由于其增加的稳定性，一旦使用本发明的设备和方法制备茚三酮试剂，则可以将其用作可视化剂，以鉴定和/或定量各种含氮化合物。

[0069] 然而在优选的实施方案中，将使用本发明的设备和方法制备的茚三酮试剂用于氨基酸分析，特别是使用已知和标准的氨基酸分析。

[0070] 因此，在再一方面，本发明提供了用于分析一种或多种含氮化合物，特别是氨基酸等的方法，所述方法包括：

[0071] 在活化区域中用UV光照射含茚三酮的组合物，以产生茚三酮试剂；和[0072] 使所述茚三酮试剂与含氮化合物在反应区域中接触。

[0073] 在活化区域中用UV光照射含茚三酮的组合物以产生茚三酮试剂和使该试剂与含氮化合物接触的步骤可以在单个阶段中或在多个单独的阶段中进行。

[0074] 本发明的方法特别适合于分析含氮化合物，特别是氨基酸和由氨基酸形成的化合物，如蛋白质、肽等。

[0075] 含氮化合物可以存在于任意液体介质或料流中。优选地，使用常规氨基酸分析仪进行本发明的方法。如上文所讨论，市售可得的氨基酸分析仪典型地通过离子交换液相色谱法将测试样品分离成其氨基酸成分。然后将洗脱的氨基酸与包含还原茚三酮或一种或多种还原剂的茚三酮试剂混合并在一个或多个反应盘管内加热，以形成经着色的反应产物，以已知方式使其经受光度测定。因此，在优选的实施方案中，含氮化合物存在于常规自动氨基酸分析仪内并且在与用于本发明的方法中的茚三酮试剂接触之前已根据特性如它们的尺寸、溶解性、电荷和/或结合亲和力分离。标准的氨基酸分析仪典型地使用基于离子交换色谱分离技术，尽管可以使用其它形式的色谱法。也可以使用非色谱法技术。

[0076] 用于本发明的分析方法中的含茚三酮的组合物包含茚三酮，优选的合适的缓冲液和任选的一种或多种有机溶剂。在上文关于本发明的第一方面已讨论了含茚三酮的组合物的组分。茚三酮试剂包含来自含茚三酮的组合物的组分和还原茚三酮。

[0077] 在使用中，将含茚三酮的组合物在活化区域中用UV光照射以产生包含还原茚三酮的茚三酮试剂，然后使其与所分析的含氮化合物接触：例如存在于氨基酸分析仪中的含氮化合物。一旦接触，就将含氮化合物与茚三酮试剂在反应区域中加热，以产生成色产物，可以对其进一步分析，以定量和定性所分析的含氮化合物。已发现特别是根据本发明，例如在与含氮化合物接触之前用UV光照射含茚三酮的组合物提供了优异的结果，虽然含茚三酮的组合物并不包含还原茚三酮和/或还原剂。

[0078] 如上文所讨论，将包含还原茚三酮的茚三酮试剂与待分析的含氮化合物接触。

[0079] 在一个实施方案中，使用与呈本发明的另一方面的设备形式的活化区域结合的氨基酸分析仪进行本发明的方法；其特征已在上文描述。以该方式，不必改装氨基酸分析仪。

[0080] 在使用中，将含茚三酮的组合物进料至活化区域中，用UV光照射以形成包含还原茚三酮的茚三酮试剂。一旦已产生所需浓度的还原茚三酮，就从活化区域的出口收集茚三酮试剂。在一个实施方案中，将茚三酮试剂储存在容器等中并且随后在线注入氨基酸分析仪。然后可以将茚三酮试剂在线注入在色谱分离柱下游的标准氨基酸分析仪，以与洗脱的氨基酸混合，然后在经加热的反应区域中加热。替代性地，可以将茚三酮试剂在线注入氨基酸分析仪的经加热的反应区域，以与其中的洗脱的氨基酸混合。

[0081] 在替代性实施方案中，使用已改装以包括呈本发明的另一方面的设备的形式的活化区域的氨基酸分析仪进行本发明的方法，以提供用于在分析仪中的反应区域上游产生茚三酮试剂的手段。在该替代性实施方案中，可以将通过本发明的方法在活化区域中形成的茚三酮试剂直接用于分析仪。在该替代性实施方案中，可以在活化区域中形成含还原茚三酮的茚三酮试剂的恒定的硫并将其递送至分析仪。

[0082] 在该替代性实施方案中，可以将活化区域和反应区域安置在单个室或容器内或可以安置在单独的容器内。如上所述，本发明的设备提供了用于改装既有分析仪的手段，例如通过将活化区域增加至分析仪内的预先存在的反应区域。

[0083] 可以将活化区域和反应区域容纳在单个室内，活化区域位于反应区域的上游。在该布置中，活化区域和反应区域的占优势的条件如温度和停留时间可以相同或可以不同，以使在每个区域中进行的反应最优化。在该布置中，所述室位于色谱分离柱的下游。

[0084] 在使用中，可以在所述室上游在线注射含茚三酮的组合物。然后将含茚三酮的组合物进料至所述室的活化区域并用UV光照射。一旦已形成所需量的还原茚三酮，则将茚三酮试剂进料至邻近的经加热的反应区域，以与所分析的含氮化合物接触。替代性地，可以将含茚三酮的组合物直接进料至活化区域中。可以再活化区域的上游进料洗脱的氨基酸以与含茚三酮的组合物混合。替代性地，可以将洗脱的氨基酸直接进料至活化区域中，以与含茚三酮的组合物混合。更优选地，将洗脱的氨基酸直接进料至经加热的反应区域中，以与茚三酮试剂混合并反应。

[0085] 如上文所讨论，可以将活化区域容纳在与反应区域分开的室中，在这种情况下，活化区域位于反应区域的上游。在该布置中，活化区域和色谱分离柱二者均位于反应区域的上游。在该布置中，活化区域内占优势的条件如温度和停留时间和反应区域可以更容易地改变并且独立地进行控制，在控制活化区域中的还原茚三酮的形成和在反应区域中与含氮化合物随后反应方面提供改进的多功能性。

[0086] 在该布置中，活化区域与反应区域分开并且为本发明的另一方面的设备的形式；其特征已在上文描述。在使用中，可以在活化区域的上游在线注射含茚三酮的组合物。然后将含茚三酮的组合物进料至活化区域中并用UV光照射。一旦已形成所需量的还原茚三酮，则将茚三酮试剂进料至经加热的反应区域中，以与所分析的含氮化合物反应。替代性地，可以将含茚三酮的组合物直接进料至活化区域中。洗脱的氨基酸可以在活化区域上游进料。
替代性地，可以将洗脱的氨基酸直接进料至活化区域以与含茚三酮的组合物混合。更优选地，将洗脱的氨基酸在活化区域下游在线进料以与茚三酮试剂反应。

[0087] 可以将用于本发明的方法中的含茚三酮的组合物的组分单独递送至反应区域。例如，可以将茚三酮、缓冲液和任选的一种或多种有机溶剂从单独的容器或储液器中通过各自的泵取出并且递送至共有的管线或混合区域，在其中将它们合并以形成混合物，然后进入反应区域。然后将该混合物递送至活化区域。替代性地，将茚三酮、缓冲液和任选的一种或多种有机溶剂从单独的容器或储液器中通过各自的泵取出并且直接递送至反应区域，在其中将它们合并以形成混合物。

[0088] 然而更优选地，将茚三酮、缓冲液和任选的一种或多种有机溶剂作为混合物一起在活化区域上游递送或直接递送至活化区域中。该技术更易于使用并且仅需要非常简单的设备。此外，可以用于本发明的方法中的含茚三酮的组合物的组分使得组合物非常稳定。因此，可以在使用前提前制备组合物并非常简单地储存在单个瓶中。有利地，甚至在空气存在下和在室温下可以无限期地储存含茚三酮的组合物。

[0089] 如上文所讨论，在活化区域中照射茚三酮试剂，从而形成随后用于反应区域中的所需量的还原茚三酮。如上文所讨论，形成的所需量的还原茚三酮使得其提供良好的灵敏度，但并不从溶液沉淀出来。形成还原茚三酮的速率将主要根据活化区域内的照射的时长和强度而变化。上文关于本发明的第一方面描述了在活化区域中由含茚三酮的组合物形成还原茚三酮的条件。

[0090] 在本发明的另一方面的方法中，特别优选的是将活化区域内的温度维持在或约室温，这是介于0℃和50℃之间，更优选介于20℃和30℃之间，甚至还更优选介于20℃和25℃之间。可以使用高于室温的温度，例如最高且包括250℃。在优选的实施方案中，使用低于100℃的温度。

[0091] 当将活化区域内的温度维持在高于室温时，为了保持活化区域内的温度恒定，优选利用恒温控制的加热器。此外，关于本发明的另一方面的设备所讨论的一个或多个UV光源和散热件优选位于活化区域外侧或在离其短距离处。

[0092] 使用反应区域，从而包含还原茚三酮的茚三酮试剂可以与含氮化合物如一种或多种氨基酸在升高的温度反应，以形成Ruheman紫。通过控制活化区域中的还原茚三酮的形成速率，可以严密调节存在于反应区域中的还原茚三酮的最终浓度。有利地，一旦在活化区域中已形成所需浓度的还原茚三酮并且将茚三酮试剂进料至反应区域，则不再继续形成还原茚三酮。更明显地，反应区域内的温度不受以所需浓度形成还原茚三酮的需要的约束，这已经在反应区域中实现。以该方式，反应区域中的条件可以对于分析含氮化合物，特别是与氨基酸的成色反应而最优化。

[0093] 反应区域可以具有任意构造以允许包含还原茚三酮的经活化的茚三酮试剂与所分析的含氮化合物反应。反应区域的合适构造包括既有的氨基酸分析仪的成色反应室，即呈盘管或柱的形式。

[0094] 所有既有的氨基酸分析仪都具有方法来改变反应区域内的温度以使茚三酮试剂与含氮化合物之间的成色反应最优化。优选地，反应区域内的温度在100℃至160℃，还更优选115℃至145℃，还更优选120℃至135℃范围内。

[0095] 也可以改变组分在反应区域中的停留或驻留时间，以使茚三酮试剂与含氮化合物之间的成色反应最优化。例如，可以根据在活化区域中形成的还原茚三酮的量改变驻留时间。优选地，在反应区域中的驻留时间在10至180秒，更优选20至80秒，还更优选30至60秒范围内。

[0096] 现在将仅借助实施例，参考附图描述本发明的实施方案，其中，

[0097] 图1是根据本发明的第一方面的优选实施方案的设备的纵向截面图；

[0098] 图2是阐释用于实施本发明的另一方面的方法的氨基酸分析仪的流程图。

[0099] 参见图1，其示出了大体上标示为2的用于用UV光照射含氮化合物的设备。设备2包括外壳4，外壳4包括导管6。导管6包括用于接收含茚三酮的组合物的入口8和用于排出含还原茚三酮的组合物的出口10。如所示，导管6大体上为圆柱形形状。

[0100] 外壳4还包括用于接收导管6的入口8的第一开口12和用于接收导管6的出口10的第二开口14。如所示，导管6在外壳4的第一和第二开口12、14之间延伸。以该方式，可以从外壳4外侧进入导管6。在使用中，可以将含茚三酮的组合物的连续料流递送至导管6的入口8并且通过外壳4的各个开口(12和14)通过导管6的出口10排出。

[0101] 当存在于导管6中时，将含茚三酮的组合物用UV光照射，使得一部分茚三酮转变成还原茚三酮。在该方面，外壳4包括一个或多个UV光源16，用于用UV光照射导管6内的含茚三酮的组合物。如所示，一个或多个UV光源16位于导管6外部，在外壳4的内表面18之上或邻近外壳4的内表面18，从而将UV光导向导管6的外围。外壳4的内表面18包括反射性材料，以保证通过UV光照射导管的至少主要部分，更优选全部。设备2还包括用于将一个或多个UV光源的温度保持在室温的一个或多个散热件20。在外壳4的外表面22上提供一个或多个散热件，以引导由一个或多个UV光源16产生的热远离外壳4。

[0102] 在图1中，导管6由诸如塑料的材料制成并且因此不能将其自身支撑在正确的位置，即其中能够用UV光照射导管6的至少一部分，更优选整个导管6的位置。因此，如所示，导管6围绕用于将导管6支撑在正确位置的支撑元件24缠绕。支撑元件24通常为圆柱形形状并且直接定位在一个或多个UV光源16下方。

[0103] 参见图2，其示出了大体上将其标记为26的用于实施本发明的方法的氨基酸分析仪。氨基酸分析仪26并没有显示将氨基酸样品分离成其组成组分的装置。然而，如上文所讨论，可以使用用于分离氨基酸的各种已知技术。氨基酸分析仪26包括用于用UV光照射含茚三酮的组合物的活化区域28和用于使如此产生的含还原茚三酮的组合物与含氮化合物在升高的温度反应的反应区域30。

[0104] 根据本发明的优选实施方案布置活化区域28和反应区域30，其中将活化区域28容纳在与反应区域30的室或容器分开的室或容器内并且位于反应区域30的上游。在替代性布置中，活化区域28和反应区域30在单个室或容器内，其中活化区域28包括所述室或容器的上游区和反应区域30包括所述室或容器的下游区。

[0105] 氨基酸分析仪26还包括第一进料管线32。第一进料管线32位于活化区域28上游并且用于将含茚三酮的组合物递送至氨基酸分析仪26。在该实施方案中，将含茚三酮的组合物的组分一起以混合物形式递送至活化区域28。活化区域28用UV光在室温照射含茚三酮的组合物预定时间段。然后将如此产生的含还原茚三酮的组合物递送至反应区域30。

[0106] 氨基酸分析仪26还包括第二进料管线34。第二进料管线34将氨基酸递送至氨基酸分析仪26中。第二进料管线34将氨基酸递送至在活化区域28下游但是在反应区域30上游的位点(标记为36)。在标记为38的替代性实施方案中，第二进料管线34将氨基酸直接递送至反应区域30。

[0107] 反应区域30将经活化的茚三酮试剂和氨基酸加热至升高的温度达预定时间段。将反应产物递送至光度计40，在此检测和测量氨基酸的浓度和特性。实施例

[0108] 将根据图1的设备用于形成用于氨基酸分析仪上的包含还原茚三酮的茚三酮试剂。设备包括4个高效UV LED；每个LED在25℃的光学特性为如下：

[0109] ●峰值波长：365nm

[0110] ●700mA的辐射通量(强度)：320mW

[0111] ●视角(2θ1/2)：85°

[0112] ●总夹角(θ0.9V)：100°

[0113] 使用脉冲宽度调制在360mA的固定电流下控制每个LED的强度。在使用中，脉冲宽度可以在介于0％和100％之间变化，提供658mW辐射通量的最大总强度范围。

[0114] 导管(反应盘管)的特性为如下：

[0115] ●内径：0.15cm

[0116] ●长度：1.7米

[0117] 进行两次实验，一个为其中使用根据图1的设备用UV光照射包含有机溶剂的含茚三酮的组合物且另一个为其中使用根据图1的设备用UV光照射不包含有机溶剂的含茚三酮的组合物。这两个实验的结果为如下：

[0118] 实施例1–包含有机溶剂的含茚三酮的组合物：

[0119] 将包含2％w/v茚三酮、50％w/v乙二醇和调节至pH 5.2的1M乙酸钠缓冲液的含茚三酮的组合物使用根据图1的设备用UV光照射。将通过导管(反应盘管)的流速设定在0.30ml/min，产生10分钟的在设备中的停留时间。将脉冲宽度调制设定在35％，产生230mW的总辐射通量强度。在产生的产物中获得0.12％w/v的还原茚三酮浓度。

[0120] 实施例2–不含有机溶剂的含茚三酮的组合物：

[0121] 将包含2％w/v茚三酮和调节至pH 5.2的1M乙酸钠缓冲液的含茚三酮的组合物使用根据图1的设备用UV光辐射。将通过导管(反应盘管)的流速设定在0.30ml/min，产生10分钟的在设备中的停留时间。将PWM设定在25％，产生165mW的总辐射通量强度。在产生的产物中获得0.08％w/v的还原茚三酮浓度。

[0122] 要意识到的是，所产生的还原茚三酮的浓度可以例如通过增加或降低茚三酮的浓度、流速、导管的长度、LED光源的数量和它们辐射UV光的强度而改变。