提高罗汉果中角鲨烯含量的方法

摘要

本发明公开了一种提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，包括以下步骤：S1、将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养后得到罗汉果苗；S2、栽培罗汉果苗，期间将50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉10～20d后的罗汉果苗的表面至表面滴水。本发明通过在罗汉果组织培养和栽培过程中施加茉莉酸甲酯，以诱导罗汉果角鲨烯代谢关键酶基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果角鲨烯的含量。

权利要求

1.一种提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养后得到罗汉果苗；

其中，固体培养基中包括MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、50～400μmol/L茉莉酸甲酯、1.0g/L活性炭、0.05mg/L多胺和0.005mg/L生物活性肽；

将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养前，将罗汉果外植体在MS培养基中培养，当培养出的小苗长至6cm高时进行切段，每段带一个节间且长0.3～

0.6cm，将中间健壮部位的一段接种到MS培养基中上进行继代培养，如此反复继代5～6次，然后转入含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；

罗汉果外植体为剪取约40～55cm的罗汉果嫩梢，用无菌水冲洗后用体积分数为50％的异丙醇溶液冲淋，然后浸入质量分数为0.01％的过氧化氢溶液中2min，取出后再用无菌水冲洗干净，切取0.5～1mm的茎尖分生组织后得到；

S2、栽培罗汉果苗，期间将50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉10～20d后的罗汉果苗的表面至表面滴水。

2.如权利要求1所述的提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，其特征在于，步骤S1中，在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中的培养条件为相对湿度60～66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d，在温度为21～25℃下培养30d。

3.如权利要求1所述的提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述固体培养基是将0.22μm的微孔滤膜灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，对固体培养基灭菌并冷却至24～26℃；

所述茉莉酸甲酯母液为用质量分数为2％的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成茉莉酸甲酯浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯母液。

4.如权利要求1所述的提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，其特征在于，步骤S2中，将所述茉莉酸甲酯溶液喷洒于罗汉果苗时，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。

5.如权利要求1所述的提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，其特征在于，MS培养基中包括MS、0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、3.5g/L琼脂、8g/L蔗糖、5g/L木糖醇以及

1g/L茶多糖。

6.如权利要求1所述的提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，其特征在于，步骤S2中栽培罗汉果苗的过程具体包括：

1)选择坡度为10～20°的坡地，在坡地中按0.08～0.1kg/m2施生石灰，1个月后在坡地中每亩施农家肥1000～1500公斤和复合肥15～20公斤，放置5～10天后移栽；

2)在4月下旬进行移栽，将长为5～6cm的罗汉果苗连同营养杯一起放在种植坑中，罗汉果苗的株距为1.5～2m，按照每15株雌株配1株雄株均匀分布，用泥土盖至罗汉果苗的基部，压实并浇定根水；

3)罗汉果苗长到40cm前每天浇水1～2次，之后1～2天浇水1次；

4)移栽3～7天后，按照每株0.5～1公斤施混合肥一次，以后每10天施混合肥一次，施足

5次，开花时叶面喷施一次0.01mg/L多胺和0.005mg/L生物活性肽的混合液，授粉10～20d后喷施茉莉酸甲酯溶液，所述混合肥中包括100公斤清水、腐熟农家肥8～15公斤、0.2～0.5公斤硫酸钾以及0.1～0.3公斤磷酸二氢钾，所述腐熟农家肥中人畜粪便与绿肥的质量比为6:

1。

说明书

提高罗汉果中角鲨烯含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果中角鲨烯含量的方法。

背景技术

[0002] 罗汉果(Siraitia grosvenorii)为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效，活性成分甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，是蔗糖甜度的300-400倍，广泛应用于食品、保健品和药品中，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。研究发现，角鲨烯是甜苷V生物合成的中间产物，在罗汉果果实发育后期，角鲨烯被完全消耗殆尽转化成甜苷V，然而，角鲨烯只存在占果重不足15％的果肉内，且含量极低，严重制约了罗汉果产业的健康发展。

[0003] 茉莉酸甲酯作为植物信号诱导子能够安全有效地激发植物次生代谢物的产生和积累。因此，优选合适的茉莉酸甲酯施用时间和浓度，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量，因此期望寻找一种能通过使用茉莉酸甲酯提高罗汉果中角鲨烯含量的方法。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是解决上述问题，并提供后面将说明的优点。

[0005] 本发明还有一个目的是提供一种提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，通过在罗汉果组织培养和栽培过程中施加茉莉酸甲酯，能诱导罗汉果角鲨烯代谢关键酶基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果角鲨烯的含量。

[0006] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，包括以下步骤：

[0007] S1、将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养后得到罗汉果苗；

[0008] S2、栽培罗汉果苗，期间将50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉10～20d后的罗汉果苗的表面至表面滴水。

[0009] 优选的是，步骤S1中，在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中的培养条件为相对湿度60～66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d，在温度为21～25℃下培养30d。

[0010] 优选的是，步骤S1中，所述固体培养基是将0.22μm的微孔滤膜灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，对固体培养基灭菌并冷却至24～26℃；

[0011] 所述茉莉酸甲酯母液为用质量分数为2％的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成茉莉酸甲酯浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯母液。

[0012] 优选的是，步骤S2中，将所述茉莉酸甲酯溶液喷洒于罗汉果苗时，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。

[0013] 优选的是，步骤S1中固体培养基中包括步骤S1中固体培养基中包括MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、50～400μmol/L茉莉酸甲酯以及1.0g/L活性炭。

[0014] 优选的是，步骤S1中固体培养基中还包括0.05mg/L多胺和0.005mg/L生物活性肽。

[0015] 优选的是，步骤S1中罗汉果外植体为剪取约40～55cm的罗汉果嫩梢，用无菌水冲洗后用体积分数为50％的异丙醇溶液冲淋，然后浸入质量分数为0.01％的过氧化氢溶液中2min，取出后再用无菌水冲洗干净，切取0.5～1mm的茎尖分生组织后得到。

[0016] 优选的是，步骤S1中将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养前，将罗汉果外植体在MS培养基中培养，当培养出的小苗长至6cm高时进行切段，每段带一个节间且长0.3～0.6cm，将中间健壮部位的一段接种到MS培养基中上进行继代培养，如此反复继代5～6次，然后转入含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养。

[0017] 优选的是，MS培养基中包括MS、0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、3.5g/L琼脂、8g/L蔗糖、5g/L木糖醇以及1g/L茶多糖。

[0018] 优选的是，步骤S2中栽培罗汉果苗的过程具体包括：

[0019] 1)选择坡度为10～20°的坡地，在坡地中按0.08～0.1kg/m2施生石灰，1个月后在坡地中每亩施农家肥1000～1500公斤和复合肥15～20公斤，放置5～10天后移栽；

[0020] 2)在4月下旬进行移栽，将长为5～6cm的罗汉果苗连同营养杯一起放在种植坑中，罗汉果苗的株距为1.5～2m，按照每15株雌株配1株雄株均匀分布，用泥土盖至罗汉果苗的基部，压实并浇定根水；

[0021] 3)罗汉果苗长到40cm前每天浇水1～2次，之后1～2天浇水1次；

[0022] 4)移栽3～7天后，按照每株0.5～1公斤施混合肥一次，以后每10天施混合肥一次，施足5次，开花时叶面喷施一次0.01mg/L多胺和0.005mg/L生物活性肽的混合液，授粉10～20d后喷施茉莉酸甲酯溶液，所述混合肥中包括100公斤清水、腐熟农家肥8～15公斤、0.2～
0.5公斤硫酸钾以及0.1～0.3公斤磷酸二氢钾，所述腐熟农家肥中人畜粪便与绿肥的质量比为6:1。

[0023] 本发明至少包括以下有益效果：

[0024] 1、本发明的提高罗汉果中角鲨烯含量的方法，通过在罗汉果组织培养和栽培过程中施加茉莉酸甲酯，能诱导罗汉果角鲨烯代谢关键酶基因即角鲨烯合酶等的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果角鲨烯的含量。将组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中，同时将茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉后的罗汉果表面，可以最大限度地诱导植物活性成分的生成，促进罗汉果中角鲨烯的积累，也能提高罗汉果的抗病能力和成活率，起到使罗汉果增产的作用。本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。

[0025] 2、固体培养基中添加的多胺能更好的刺激不定根生长，促进根系对无机离子的吸收，生物活性肽可以被植物直接吸收，生物活性肽的添加促进植物根系发育，使植物根系茂盛，提高对养分和水分的吸收利用效率，促进根系细胞生长，细胞排列规则致密，根组织发育良好，使罗汉果抵御病原菌入侵的能力增强，从而减少病害的发病率。

[0026] 3、采用异丙醇溶液和过氧化氢结合灭菌，取代现有的升汞消毒，不损害茎尖分生组织，且将外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，此种处理方法使后续的组织培养的成活率提高。

[0027] 4、通过多次继代培养，使优良的性状得以保存，使得培育出的罗汉果组培苗具有带病少、繁殖快、适应性广、当年种当年收获且产量高的特点。

[0028] 5、木糖醇和茶多糖的加入代替部分蔗糖，相比传统的30g/L的使用量大大的减少了蔗糖的使用量，且茶多糖能补充多种氨基酸和微量元素，木糖醇的加入有助于营造更好的无菌环境。

[0029] 6、栽培罗汉果苗过程中，按照每15株雌株配1株雄株分布方便授粉，开花时叶面喷施含多胺和生物活性肽的混合液，叶面喷施生物活性肽可以直接被叶面细胞吸收，进一步使叶子舒展、厚实、发绿发亮，光合作用增强，结合多胺能延缓叶片衰老和调节开花过程的作用，能更有效的利用光能把二氧化碳转变成葡萄糖等有机物质，加速植物的生长发育，使作物增产增收。

[0030] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

[0031] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0032] 实施例1

[0033] S1、将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养后得到罗汉果苗；

[0034] S2、栽培罗汉果苗，期间将50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉10d后的罗汉果苗的表面至表面滴水。

[0035] 实施例2

[0036] S1、将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养后得到罗汉果苗；

[0037] S2、栽培罗汉果苗，期间将400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉20d后的罗汉果苗的表面至表面滴水。

[0038] 实施例3

[0039] S1、将罗汉果外植体在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中进行组织培养后得到罗汉果苗；

[0040] S2、栽培罗汉果苗，期间将200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉15d后的罗汉果苗的表面至表面滴水。

[0041] 实施例4

[0042] S1、将罗汉果外植体在固体培养基中进行组织培养，培养条件为相对湿度60％、光照强度1400lux、光照时间8h/d，在温度为21℃下培养30d后得到罗汉果苗。

[0043] 固体培养基是添加0.22μm的微孔滤膜灭菌后的茉莉酸甲酯母液，然后对固体培养基灭菌并冷却至24℃得到，固体培养基中包括MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、50μmol/L茉莉酸甲酯以及1.0g/L活性炭。

[0044] 所述茉莉酸甲酯母液为用质量分数为2％的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成茉莉酸甲酯浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯母液。

[0045] S2、栽培罗汉果苗，期间将50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉10d后的罗汉果苗的表面至表面滴水，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。

[0046] 实施例5

[0047] S1、将罗汉果外植体在固体培养基中进行组织培养，培养条件为相对湿度66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d，在温度为25℃下培养30d后得到罗汉果苗。

[0048] 固体培养基是添加0.22μm的微孔滤膜灭菌后的茉莉酸甲酯母液，然后对固体培养基灭菌并冷却至26℃得到，固体培养基中包括MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、400μmol/L茉莉酸甲酯以及1.0g/L活性炭。

[0049] 所述茉莉酸甲酯母液为用质量分数为2％的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成茉莉酸甲酯浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯母液。

[0050] S2、栽培罗汉果苗，期间将400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉20d后的罗汉果苗的表面至表面滴水，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。

[0051] 实施例6

[0052] S1、将罗汉果外植体在固体培养基中进行组织培养，培养条件为相对湿度65％、光照强度1400lux、光照时间8h/d，在温度为22℃下培养30d后得到罗汉果苗。

[0053] 固体培养基是添加0.22μm的微孔滤膜灭菌后的茉莉酸甲酯母液，然后对固体培养基灭菌并冷却至25℃得到，固体培养基中包括MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、200μmol/L茉莉酸甲酯以及1.0g/L活性炭。

[0054] 所述茉莉酸甲酯母液为用质量分数为2％的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成茉莉酸甲酯浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯母液。

[0055] S2、栽培罗汉果苗，期间将200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉15d后的罗汉果苗的表面至表面滴水，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。

[0056] 实施例7

[0057] S1、剪取约50cm的罗汉果嫩梢，用无菌水冲洗后用体积分数为50％的异丙醇溶液冲淋，然后浸入质量分数为0.01％的过氧化氢溶液中2min，取出后再用无菌水冲洗干净，切取0.5mm的茎尖分生组织后，得到第一代罗汉果外植体。

[0058] 将第一代罗汉果外植体在MS培养基中培养，当培养出的小苗长至6cm高时进行切段，每段带一个节间且长0.5cm，将中间健壮部位的一段接种到MS培养基中上进行继代培养，如此反复继代6次，得到的罗汉果外植体在固体培养基中进行组织培养，培养条件为相对湿度65％、光照强度1400lux、光照时间8h/d，在温度为22℃下培养30d后得到罗汉果苗。

[0059] MS培养基中包括MS、0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、3.5g/L琼脂、8g/L蔗糖、5g/L木糖醇以及1g/L茶多糖。

[0060] 固体培养基是添加0.22μm的微孔滤膜灭菌后的茉莉酸甲酯母液，然后对固体培养基灭菌并冷却至25℃得到，固体培养基中包括MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、茉莉酸甲酯的浓度为200μmol/L以及1.0g/L活性炭。

[0061] 所述茉莉酸甲酯母液为用质量分数为2％的乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成茉莉酸甲酯浓度为50mmol/L的茉莉酸甲酯母液。

[0062] S2、栽培罗汉果苗的过程包括：

[0063] 1)选择坡度为15°的坡地，在坡地中按0.1kg/m2施生石灰，1个月后在坡地中每亩施农家肥1200公斤和复合肥15公斤，放置7天后移栽；

[0064] 2)在4月下旬进行移栽，将长为5cm的罗汉果苗连同营养杯一起放在种植坑中，罗汉果苗的株距为2m，按照每15株雌株配1株雄株均匀分布，用泥土盖至罗汉果苗的基部，压实并浇定根水；

[0065] 3)罗汉果苗长到40cm前每天浇水1～2次，之后每2天浇水1次；

[0066] 4)移栽5天后，按照每株0.5公斤施混合肥一次，以后每10天施混合肥一次，施足5次，开花时叶面喷施一次0.01mg/L多胺和0.005mg/L生物活性肽的混合液，授粉15d后将200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷洒于罗汉果苗的表面至表面滴水，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。

[0067] 其中，所述混合肥中包括100公斤清水、腐熟农家肥10公斤、0.4公斤硫酸钾以及0.2公斤磷酸二氢钾，所述腐熟农家肥中人畜粪便与绿肥的质量比为6:1。

[0068] 为了说明本发明的效果，发明人将按照实施例3、实施例4、实施例5和实施例6栽培的罗汉果分别作为实验一组、实验二组、实验三组和实验四组，将除未在固体培养基中添加茉莉酸甲酯且授粉10～20d后未使用茉莉酸甲酯溶液喷洒，其余均与实验一组的培养方法相同栽培后的罗汉果作为对照组，对实验二组、实验三组和实验四组中在茉莉酸甲酯溶液连续喷施后的次日采样，并对实验一组和对照组于授粉15d后采样，采用GC-MS法进行罗汉果角鲨烯含量检测，并分别统计各组中罗汉果苗成活率以及罗汉果亩产个数。

[0069] GC-MS法中检测溶液的制备：取0.5g罗汉果果肉粉末，置于50mL磨口锥形瓶中，精密加入20mL甲醇(6％氢氧化钾w/v)溶液，在室温下放置10min，超声提取1h后过滤，向溶液中加入20mL去离子水,将混合物倒入分液漏斗中，加入等体积的正己烷萃取3次，合并正己烷层,加入适量无水Na2SO4脱水，过滤，40℃减压回收正己烷，残留物溶解在1mL甲醇中，用容量瓶定容，过0.45μm滤膜。

[0070] 对照品的配置：精密称取100mg角鲨烯标准品于100mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，得到1.0mg/mL角鲨烯母液。取1mL角鲨烯母液至100mL容量瓶中，加入正己烷定容至刻度，摇匀，制成1mL混标溶液中含有角鲨烯2μg的对照品溶液。

[0071] 气相色谱条件：TR-5MS柱(30m×0.32mm×0.25μm)；程序升温：初温160℃，保持1min后，以20℃/min升温至300℃，保持10min；载气为氦气，流速为0.7mL/min，分流比为50:
1；进样口温度为250℃。

[0072] 质谱条件：离子化模式为EI，传输线温度为250℃，离子源温度为250℃，电离电压为70eV，选用选择离子扫描(SIM)：426、410、408、393、341、367、274、95、69；溶剂延迟时间为7min。

[0073] 各色谱峰对应的质谱图通过与标准谱图对照进行定性，通过外标一点法对角鲨烯的含量进行定量计算，数据如表1所示。

[0074] 表1不同组罗汉果栽培数据统计

[0075]

[0076] 由表1中可以看出，实验一组、实验二组、实验三组和实验四组中的角鲨烯含量显著高于对照组，其成活率和亩产个数也明显高于对照组，证明通过在罗汉果组织培养和栽培过程中施加茉莉酸甲酯，能提高罗汉果角鲨烯的含量，也能起到提高罗汉果的成活率和增产的作用。实验一组与实验二组到实验四组对比看出，通过优选固体培养基配方和控制组织培养的培养条件等能进一步提高罗汉果角鲨烯的含量，实验二组到实验四组三组对比可知，在罗汉果组织培养和栽培过程中施加茉莉酸甲酯的浓度为200μmol/L时，最利于罗汉果中角鲨烯的积累。

[0077] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。