血链球菌蛋白在制备抑制白色念珠菌的药物上的应用

摘要

血链球菌蛋白在制备抑制白色念珠菌的药物上的应用，它涉及一种血链球菌蛋白在药物上的应用,解决了唑类、多稀类化学合成药物在治疗念珠菌感染中，毒副作用大且易产生耐药株菌的问题。它是把血链球菌混合蛋白用于制备抑制白色念珠菌的药物。血链球菌蛋白使白色念珠菌细胞形态改变，细胞膜通透性增大,抑制白色念珠菌的粘附作用和出芽生殖，阻断菌丝的生成。本发明用血链球菌提取物与真菌拮抗，证实其对真菌具有较强的抑制作用。

权利要求

1.一种基于原子力显微镜对白色念珠菌致病力测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备血链球菌蛋白提取物；

（2）测定正常白色念珠菌菌体和菌丝的粘附力及杨氏模量：采用相对测量法，以赫兹模型为细胞模型，选取出芽生殖期的白色念珠菌的原子力显微镜平面成像图，将细胞中心作为基本观测点，在菌体细胞上以“#”字形随机选取4条观测线并划分菌体，测得每条观测线所有位点的XzDate，计算每条观测线的粘附力及杨氏模量的平均值，然后将4条观测线的平均值求和后再取平均值，最终分别获得较精确的菌体粘附力及杨氏模量；随机选取出芽生殖期菌丝的原子力显微镜平面成像图，由于出芽生殖的菌丝长度不一，随机选取长度为8至

20μm的菌丝，取垂直于菌丝长轴的四条观测线平均五等分划分菌丝，测得每条观测线上所有位点的XzDate数值；菌丝粘附力、杨氏模量的平均值的求算方法与菌体粘附力、杨氏模量的平均值的求算方法相同；其中，所述XzDate为观测线上的x轴的每个点位所对应的z轴观测线上数值，在粘附力测量通道时表示各点粘附力值，在杨氏模量测量通道时表示各点杨氏模量值；

（3）测定经血链素作用后的白色念珠菌的粘附力及杨氏模量：分别取浓度为1g/L的血链素200μL，浓度为5×106cfu/mL的白色念珠菌菌悬液500μL加入到1mL的RPMI-1640细胞培养基；震荡混匀，37℃恒温培养24h后取出涂片待检；借助白色念珠菌的原子力显微镜平面成像图，随机选取经血链球菌细菌素作用后的白色念珠菌进行观测，以垂直于菌体直径的方向将菌体直径划分为五等份，获得四条观测线；在粘附力及杨氏模量测量通道下，分别输出各通道下每条线上的所有位点的 XzDate值，将4条观测线的平均值求和后再次取平均值，观测经血链素作用后的白色念珠菌菌体的粘附力及杨氏模量的变化情况；其中，所述RPMI-1640细胞培养基为在平衡盐溶液BSS的基础上，添加了氨基酸、维生素和其他与血清中浓度相似的营养物质的一种细胞培养基；

（4）统计分析：采用SPSS19.0统计软件，计量资料采用x±s表示，采用配对样本T检验分析，P<0.05，得到有显著性差异，得到如下结果：得到所述正常白色念珠菌菌体的平均粘附力值为7.35±0.77nN；所述正常白色念珠菌菌丝的平均粘附力值为为9.82±0.39nN；所述正常白色念珠菌菌体杨氏模量的平均值为

7.33±1.29Mpa；所述正常白色念珠菌菌丝杨氏模量的平均值为4.04±0.76Mpa；所述经血链球菌细菌素作用后的念珠菌的粘附力的平均值为5.69±0.62nN；所述经血链球菌细菌素作用后的念珠菌杨氏模量的平均值为5.03±0.81Mpa。

说明书

血链球菌蛋白在制备抑制白色念珠菌的药物上的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种血链球菌蛋白，具体涉及一种血链球菌蛋白在药物上的应用。

背景技术

[0002] 真菌广泛地存在于自然界中，是人类健康的头号杀手，可侵袭人体的不同部位使其致病，如口腔、上呼吸道、肠道及阴道、皮肤等，深部真菌感染的致死率高达70％至80％。近年来，随着抗生素、糖皮质激素及免疫制剂等药物在临床上的广泛应用以及各种放射治疗、腹膜透析、外科手术等医疗技术的普遍开展，免疫功能低下的人群在日益扩大，全身性真菌感染者日益增多，致使念珠菌的感染率不断上升，临床危害性比较强。而念珠菌的治疗药物仍然局限于唑类、多稀类等化学合成药物，毒副作用大且易产生耐药株菌。故研究疗效好、少副作用或无副作用的不易产生耐药菌株的抗真菌药物，是人类抗击真菌感染路上亟待解决的问题。

发明内容

[0003] 本发明提供一种血链球菌蛋白在制备抑制白色念珠菌的药物上的应用，以解决现有的唑类、多稀类等化学合成药物在治疗念珠菌感染的病例中，毒副作用大且易产生耐药株菌的问题。

[0004] 本发明的实施方案是：把血链球菌混合蛋白用于制备抑制白色念珠菌的药物。

[0005] 血链球菌混合蛋白是由血链球菌依次经过低温高速离心、细胞破碎、溶解沉淀和过柱收集后得到。

[0006] 利用血链球菌蛋白使白色念珠菌细胞形态改变，细胞膜通透性增大。

[0007] 利用血链球菌蛋白降低白色念珠菌细胞表面的疏水作用而抑制白色念珠菌的粘附作用，从而切断白色念珠菌与宿主的紧密接触。

[0008] 利用血链球菌蛋白减小白色念珠菌细胞壁的硬度，使白色念珠菌的细胞壁结构松散或解体，降低其对宿主环境的适应能力。

[0009] 利用血链球菌蛋白抑制白色念珠菌的出芽生殖，阻断菌丝的生成。

[0010] 本发明首次采用健康人口腔血链球菌的提取物(本文将之称为血链球菌混合蛋白或血链素)与人类最常见感染的真菌(即念珠菌)进行拮抗作用实验，首次发现并证实了提取出的血链球菌混合蛋白对真菌具有较强的抑制作用，为抗真菌药物开辟了一个全新的领域。

[0011] 说明书附图

[0012] 图1a是白色念珠菌的平面显示图，图1b是白色念珠菌的相位显示图，图1c是白色念珠菌的三维显示图，以上的图1a、图1b和图1c是为了显示念珠菌的孢子相。

[0013] 图2a是菌丝相白色念珠菌的平面显示图，图2b是菌丝相白色念珠菌的相位显示图，图2c是菌丝相白色念珠菌的三维显示图，以上的图2a、图2b和图2c是为了显示念珠菌经过诱导出芽生殖后的菌丝相。

[0014] 图3是白色念珠菌的粘附力成像图。

[0015] 图4是白色念珠菌的粘附力曲线图。

[0016] 图5是白色念珠菌的杨氏模量成像图。

[0017] 图6是白色念珠菌杨氏模量曲线图。

[0018] 图7a是血链素作用后的白色念珠菌细胞群的平面显示成像图，图7b是血链素作用后的白色念珠菌细胞群的相位显示成像图，图7c是血链素作用后的白色念珠菌细胞群的三维显示成像图。

[0019] 图8是血链素作用白色念珠菌后形变量成像图。

[0020] 图9是血链素作用白色念珠菌后形变量曲线图。

[0021] 图10是血链素作用白色念珠菌后菌体形变量的影响示意图。

[0022] 图11是血链素作用白色念珠菌后粘附力成像图。

[0023] 图12是血链素作用白色念珠菌后粘附力曲线图。

[0024] 图13是血链素作用白色念珠菌后菌体粘附力的影响示意图。

[0025] 图14是血链素作用白色念珠菌后杨氏模量成像图。

[0026] 图15是血链素作用白色念珠菌后的杨氏模量曲线图。

[0027] 图16是血链素作用白色念珠菌后对菌体杨氏模量的影响示意图。

具体实施方式

[0028] 下面结合说明书附图具体说明本实施方式：

[0029] 1.提取及效果测定方法

[0030] 1.1血链球菌蛋白提取物的制备过程

[0031] 将已传纯并鉴定后的血链球菌(血链球菌标准株ATCC10556购自四川华西口腔医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室，此标准菌株属于公众可以通过正常商业渠道购买)加入8.5L的BHI(牛心脑浸汁)液体培养基(OXOID,England)培养液中，在37℃厌氧条件下，恒温静止培养48h后，立即将血链球菌菌悬液置于4℃、12000r/min低温高速离心机中离心30min，收集菌体沉淀后，将其用1×PBS(磷酸盐缓冲液)溶解，再次离心。重复上述溶解离心过程三次。再将菌体沉淀溶于100mL 1×PBS液中，在冰水浴中进行超声破碎，将超声破碎机设置为on 4s、off 8s(破碎机的工作模式为间断式，具体设置为：on 4s表示工作4秒钟，off 8s表示停止8秒钟。整个细胞破碎过程中必须在冰水浴中进行。)率为150w，时间为30min。将破碎后的溶液再次低温高速(12000r/min，4℃)离心30min，收集上清液258mL。在4℃下，用硫酸铵梯度盐析8h，将离心机转数设置为15000r/min，温度设置为4℃，离心45min收集沉淀，加入适量PBS溶解沉淀，再经Sephadex G-25(交联葡聚糖)ps：每克凝胶膨胀时吸水2.5克的交联葡聚糖，Sephadex G-25葡聚糖凝胶G-25分离范围1000-5000适用于脱盐、肽与其它小分子的分离。这里可以简称：交联葡聚糖。过柱除盐收集过柱后的液体，透析浓缩，冻干后得血链球菌蛋白(即血链素)，将其置于－80℃保存备用。

[0032] 1.2正常念珠菌菌体和菌丝的粘附力、杨氏模量的测定方法

[0033] 本实验采用相对测量法(基准值设为3.5Mpa)，以赫兹模型为细胞模型，选取出芽生殖期的白色念珠菌的AFM(原子力显微镜)平面成像图，将细胞中心作为基本观测点，在菌体细胞上以“#”字形随机选取4条观测线并划分菌体，测得每条观测线所有位点的XzDate(观测线上的x轴(水平方向)的每个点位所对应的z轴观测线上数值)数值(在粘附力测量通道时表示各点粘附力值，在杨氏模量测量通道时表示各点杨氏模量值)，计算每条观测线的粘附力及杨氏模量的平均值，然后将4条观测线的平均值求和后再取平均值，最终分别获得较精确的菌体粘附力及杨氏模量。随机选取出芽生殖期菌丝的AFM平面成像图，由于出芽生殖的菌丝长度不一，本实验随机选取长度为8至20μm的菌丝，取垂直于菌丝长轴的四条观测线平均五等分划分菌丝，测得每条观测线上所有位点的XzDate数值。菌丝粘附力、杨氏模量的平均值的求算方法与菌体粘附力、杨氏模量的平均值的求算方法相同。本实验每个样品在2h内完成扫描，每个样品测量至少随机选取8个细胞。

[0034] 1.3经血链素作用后的白色念珠菌的形变量、粘附力及杨氏模量的测定方法[0035] 分别取浓度为1g/L的血链素200μL，浓度为5×106cfu/mL的白色念珠菌菌悬液500μL加入到1mL的RPMI-1640(细胞培养基)ps：建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其他与血清中浓度相似的营养物质的一种细胞培养基。震荡混匀，37℃恒温培养24h后取出涂片待检[19]。借助白色念珠菌的AFM平面成像图，随机选取经血链素作用后的白色念珠菌进行观测，以垂直于菌体直径的方向将菌体直径划分为五等份，获得四条观测线。在形变量、粘附力及杨氏模量测量通道下，分别输出各通道下每条线上的所有位点的XzDate值，将4条观测线的平均值求和后再次取平均值，观测经血链素作用后的白色念珠菌菌体的形变量、粘附力及杨氏模量的变化情况。

[0036] 1.4统计分析

[0037] 数据分析采用SPSS19.0(是一款常用的统计产品与服务解决方案的软件)统计软件，计量资料采用x±s表示，采用配对样本T检验分析，P<0.05(实验数据经配对样本T检验，组间比较有明显统计学差异)有显著性差异。

[0038] 2.测定结果

[0039] 2.1白色念珠菌菌体和菌丝粘附力及杨氏模量的测量结果

[0040] 从图1a、1b和1c可见，白色念珠菌的酵母相菌体呈均匀的圆形或椭圆形，表面光滑平整。图2a、2b和2c可见，经过诱导出芽生殖后白色念珠菌的菌丝相，菌丝长度8至20μm不等，菌体和菌丝表面光滑平整、无破坏及凹陷。图3至4可见，0至10.2μm所对应的纵坐标值表明，白色念珠菌菌丝的粘附力参数约在9至12nN范围内波动，10.2至16μm所对应的纵坐标值表明，白色念珠菌的菌体粘附力参数约在7至10nN范围内波动，菌丝的粘附力值明显高于菌体粘附力值。选取图4中12.4μm处(粘附力为0nN(该位置处的粘附力值为零)作为参照点，测得菌丝平均粘附力为9.82±0.39nN，菌体的平均粘附力值为7.35±0.77nN，见下面的表1。图5至6所示，菌体的杨氏模量在7至9MPa之间，而菌丝的杨氏模量在4至6MPa之间，菌丝的杨氏模量小于菌体的杨氏模量。经下面的表2统计所得：菌体杨氏模量的平均值为7.33±
1.29Mpa，菌丝杨氏模量的平均值为4.04±0.76Mpa。综上所述，白色念珠菌的菌丝粘附力大于菌体的粘附力，菌丝的杨氏模量小于菌体的杨氏模量。

[0041] 表1白色念珠菌菌体、菌丝粘附力(nN)

[0042]

[0043] 注:采用配对t检验，t＝4.171，p＝0.025<0.05，有统计学差异。

[0044] 表2白色念珠菌菌体、菌丝杨氏模量(MPa)

[0045]

[0046] 注：采用配对t检验，t＝-4.580，p＝0.020<0.05，有统计学差异。

[0047] 2.2经血链素作用后白色念珠菌的形变量、粘附力及杨氏模量的测量结果[0048] 图7为血链素作用后白色念珠菌细胞群的AFM成像图，可见菌体扭曲、折叠、变形，菌体表面粗糙皱褶，细胞局部见“盘状”凹陷。

[0049] 2.2.1经血链素作用后白色念珠菌形变量的测量结果

[0050] 在形貌成像图上，AFM可直接观察到经血链素作用后的白色念珠菌形变量的情况，见图8。通过AFM的定量分析技术，可直接读取血链素作用白色念珠菌前后，其形变量数值变化，见图9。实验组(经血链素作用后的白色念珠菌)形变量明显大于对照组(正常生长白色念珠菌)，见表3和图10。

[0051] 2.2.2经血链素作用后，白色念珠菌粘附力的测量结果

[0052] 正常白色念珠菌的粘附力平均值为7.35±0.77nN。经血链素作用后的白色念珠菌的粘附力平均值为5.69±0.62nN，见表4。实验证实血链素可明显降低白色念珠菌菌体的粘附力，经血链素作用后的白色念珠菌的粘附力随着作用区域凹陷深度的增加(形变量的增大)而逐渐减小。如图11至13所示。

[0053] 2.2.3经血链素作用后白色念珠菌杨氏模量测量结果

[0054] 正常的白色念珠菌的杨氏模量的平均值为7.33±1.29Mpa。而血链素作用后的菌体杨氏模量已降低至5.03±0.81Mpa，见表5。故血链素可使菌体杨氏模量降低，弹性增大，细胞更易发生形变。如图14至16所示。

[0055] 表3血链素作用前后白色念珠菌形变量(nm)的改变

[0056]

[0057] 注：对照组：白色念珠；实验组：血链素—白色念珠菌；采用配对t检验，t＝4.273，与对照组比，p＝0.002＜0.05，有统计学差异。

[0058] 表4血链素作用前后白色念珠菌粘附力(nN)的改变

[0059]

[0060] 注：对照组：白色念珠；实验组：血链素—白色念珠菌；采用配对t检验，t＝-5.923，与对照组比，p<0.001，，有统计学差异。

[0061] 表5血链素作用前后白色念珠菌杨氏模量(MPa)的改变

[0062]

[0063] 注：对照组：白色念珠；实验组：血链素—白色念珠菌；采用配对t检验，t＝-9.490，与对照组比，p<0.001，有统计学差异。

[0064] 3.结论

[0065] 白色念珠菌是一种条件致病菌，可通过多种途径致病：1)通过粘附作用实现对宿主的识别。2)通过孢子相和菌丝相之间的转换侵入宿主。3)白色念珠菌形态具有可塑性和多样性，通过调节自身形态应对宿主体内环境变化等。其中粘附是白色念珠菌致病性的第一步，也是其他毒力因子发挥致病作用的必要条件，粘附力表征了细菌附着于另一宿主表面或材料表面的能力，粘附作用与病原菌的毒力密切相关。杨氏模量用于表征细胞弹性及硬度的大小，反映固体材料抵抗形变的能力，细胞的杨氏模量越小，其弹性越大。现阶段，生物力学已成为研究热点，以原子力显微镜在生物领域的应用为标志。血链素可抑制白色念珠菌的生长，甚至使其细胞形态改变，细胞膜通透性增大。本实验通过低温高速离心、细胞破碎等方法提取血链素，将其分别作用于白色念珠菌的孢子相和菌丝相，应用原子力显微镜对白色念珠菌菌体菌丝进行扫描，从而获得经血链素作用前后的白色念珠菌形貌及力学信息。从力学性质的角度探讨血链素对白色念珠菌致病性的影响。

[0066] 3.1未经血链素作用的白色念珠菌，其菌体和菌丝的粘附力与致病性的关系[0067] 未经血链素作用的白色念珠菌，菌体和菌丝粘附力的实验结果显示，菌体平均粘附力为7.35±0.77nN，菌丝的平均粘附力为9.82±0.39nN，白色念珠菌菌体的粘附力小于菌丝的粘附力。有研究表明，白色念珠菌菌丝的形成是其由定植菌向致病菌转变的标志，也是临床鉴定白色念珠菌的依据之一。菌丝的形成与白色念珠菌毒力的增强密切相关。本实验从力学性质的角度论证了粘附力是白色念珠菌致病因素之一。

[0068] 3.2未经血链素作用的白色念珠菌，其菌体和菌丝的杨氏模量与致病性的关系[0069] 未经血链素作用的白色念珠菌，菌体菌丝杨氏模量的实验结果显示，菌体的杨氏模量平均值为7.33±1.29Mpa，菌丝的杨氏模量平均值为4.04±0.76Mpa，菌体的杨氏模量大于菌丝的杨氏模量。实验证实，白色念珠菌的菌丝较菌体更易发生形变，菌丝可能更易通过调节自身形态以应对宿主体内环境的变化，故出芽生殖产生的菌丝可提高白色念珠菌的致病性。本实验从杨氏模量的角度论证了菌丝的致病性大于菌体的致病性，本文推测，杨氏模量可能作为衡量白色念珠菌致病性的一个力学参数。

[0070] 3.3血链素对白色念珠菌粘附力的影响

[0071] 经血链素作用后的白色念珠菌，其粘附力实验结果显示，血链素可明显降低白色念珠菌的粘附力。白色念珠菌的致病性可能是多阶段渐进式的。在白色念珠菌致病的不同时期，不同的毒力因子发挥着主要作用，其过程可能根据环境和营养物质的不同而动态交替。所以在白色念珠菌入侵宿主细胞的不同时期用药，其作用效果和研究结果很可能具有巨大的差异性。本实验将血链素作用于白色念珠菌的孢子期并检测其粘附力，相对于未经血链素作用的白色念珠菌菌体，血链素作用后其粘附力明显下降，且随着作用区域形变量的增大其粘附力值不断减小。血链素可降低白色念珠菌细胞表面的疏水作用而抑制白色念珠菌的粘附作用。白色念珠菌粘附受体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽结构，含RGD结构的多肽可抑制白色念珠菌的粘附作用。故本文推测，血链素中可能含有RGD结构，可与白色念珠菌的粘附蛋白配体相结合，从而使其粘附力降低。

[0072] 3.4血链素对白色念珠菌杨氏模量的影响

[0073] 白色念珠菌最外层的细胞壁结构，具有保持细胞形态，提高菌体机械性能等作用。当利用原子力显微镜测量白色念珠菌的杨氏模量时，实验探针所扫描的细胞表面，即为白色念珠菌的细胞壁结构。本实验结果显示，经过血链素作用后的菌体，其杨氏模量明显减小，即为细胞壁的硬度的减小。故本文推测血链素可能使细胞壁的结构或成分受到影响甚至破坏，血链素抑制白色念珠菌的作用区域可能是其细胞壁。其作用途径可能是使白色念珠菌的细胞壁结构松散、解体，也可能通过与细胞壁上的某种物质相结合，导致细胞壁破坏等。

[0074] 综上所述，从形态学和力学的角度来讲，血链素对白色念珠菌的抑制作用是多因素、多途径的，本文认为：1)血链素使白色念珠菌菌体的形变量增大，形成盘状凹陷；血链素也能抑制白色念珠菌的出芽生殖，阻断菌丝的生成。2)血链素能通过降低白色念珠菌的粘附力，抑制和破坏白色念珠菌的粘附作用，从而切断白色念珠菌与宿主紧密接触。3)血链素可减小白色念珠菌的杨氏模量，能降低其对宿主环境的适应能力。