一种紫杉醇抗癌药物、其制备方法及应用

摘要

本发明提供一种紫杉醇抗癌药物，其结构式为结构式1所示结构式1所示。本发明还提供上述紫杉醇抗癌药物制备方法为包括以下步骤：步骤1：将PTX与NBD‑Cl于有机溶剂中混合反应得PTX‑NBD混合液；步骤2：去除所述PTX‑NBD混合液中的杂质，冻干，得PTX‑NBD，所述PTX‑NBD为紫杉醇抗癌药物。本发明还提供上述PTX‑NBD在标记或显示PTX在活细胞中分布的应用。本发明的PTX‑NBD具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好及高选择性标记肿瘤细胞的特点。

权利要求

1.一种紫杉醇抗癌药物，其特征在于，其结构式为结构式1所示

2.一种权利要求1所述的紫杉醇抗癌药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将PTX与NBD-Cl于有机溶剂中混合反应得PTX-NBD混合液；

步骤2：去除所述PTX-NBD混合液中的杂质，冻干，得PTX-NBD,所述PTX-NBD为紫杉醇抗癌药物。

3.根据权利要求2所述的紫杉醇抗癌药物的制备方法，其特征在于，所述步骤1的具体操作为：将PTX与NBD溶于有机溶剂中，常温磁力搅拌22～26h，得PTX-NBD混合液。

4.根据权利要求2所述的紫杉醇抗癌药物的制备方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作为：在所述PTX-NBD混合液中加入去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-Cl和有机溶剂，冻干，得PTX-NBD。

5.根据权利要求2所述的紫杉醇抗癌药物的制备方法，其特征在于，所述PTX与NBD-Cl的摩尔比为1∶1～4。

6.根据权利要求2所述的紫杉醇抗癌药物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、氯仿或丙酮中的一种或多种。

说明书

一种紫杉醇抗癌药物、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物标记领域，特别涉及一种紫杉醇抗癌药物、其制备方法及应用。

背景技术

[0002] 紫杉醇(Paclitaxel，PTX)，CAS号为33069-62-4，相对分子量为853.92，二萜生物碱类化合物，是一种从红豆杉中提取得到的天然抗癌药物，属细胞周期非特异性抗肿瘤药，抗肿瘤谱广。

[0003] PTX是白色结晶体粉末，难溶于水和正己烷，易溶于甲醇、乙腈、氯仿、丙酮等有机溶剂。

[0004] PTX的作用机制：微管是真核细胞的一种重要组成成分，它由两条类似的多肽亚单位构成的微管二聚体形成。在正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡。PTX作为一种新型抗微管药物，可使二者之间失去这种动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定。这些作用致使细胞在进行有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，有效抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。

[0005] 该药临床主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌，也可用于治疗肺癌、大肠癌、头颈部瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、脑瘤。但其具有全身毒性，特别是持久的骨髓抑制和外周神经毒性，恶心、呕吐、腹泻、脱发、黏膜炎、肌肉关节疼痛和不适等亦有发生。近年来，人们相继发展了很多PTX药物新剂型，以达到只消灭癌细胞，而同时最小化对正常细胞影响的目的。尽管这些药物新剂型虽在某些方面有了较大改善，却也很难消除其对正常的细胞、组织、器官的高毒性。

[0006] 让一种药物在细胞乃至活体中可视化将会极大程度上促进药理学的发展，半个世纪以来荧光显微镜和荧光标记法的快速发展为药物标记提供了新思路。目前，追踪PTX在细胞及活体中的运动行为的最基本思路是将合适的荧光团共价的连接到药物的位点上，所选荧光团一般都是价格昂贵的异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)。所以，筛选出价格低廉的、能与PTX共价连接的、适合激光共聚焦显微镜使用的、能在活细胞和动物体内可视化的荧光探针是极其必要的。

[0007] 因此，有必要发明一种方便追踪且价格低的紫杉醇抗癌药物、其制备方法及应用。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于克服了上述缺陷，提供一种方便追踪且价格低的紫杉醇抗癌药物、其制备方法及应用。

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

[0010] 本发明提供一种紫杉醇抗癌药物，其结构式结构式为结构式1所示

[0011]

[0012] 本发明还提供一种上述紫杉醇抗癌药物的制备方法，包括以下步骤：

[0013] 步骤1：将PTX与NBD-Cl于有机溶剂中混合反应得PTX-NBD混合液；

[0014] 步骤2：去除所述PTX-NBD混合液中的杂质，冻干，得PTX-NBD，所述PTX-NBD为紫杉醇抗癌药物。

[0015] 所述NBD-Cl为4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑，别名4-氯-7-硝基苯呋咱，其CAS号为10199-89-0，英文名4-Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole或NBDchloride。

[0016] 一种上述紫杉醇抗癌药物的应用，所述PTX-NBD在标记或显示PTX在活细胞中分布的应用。

[0017] 本发明的有益效果在于：通过在紫杉醇(PTX)的结构中引入荧光探针NBD-Cl得到PTX-NBD(PTX轭合物)，进而实现PTX在细胞及活体中的可视化，方便追踪，，相对PTX-FITC而言，本发明的PTX-NBD价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好；本发明PTX-NBD的制备方法，合成工艺简单，易操作；实验结果证实，本发明的PTX-NBD能用于标记或显示PTX在活细胞中分布，具有高选择性标记肿瘤细胞的特点，减缓PTX对正常的细胞、组织、器官的影响，为PTX抗肿瘤研究提供了廉价、简捷、直观的生物检测试剂；所述NBD-CL荧光探针和DID、DIR具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。

附图说明

[0018] 图1是本发明实施例5中NBD-CL、PTX及PTX-NBD的电喷雾质谱(Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)图谱：(a)荧光探针NBD-Cl，(b)PTX，(c)PTX-NBD。

[0019] 图2是本发明实施例5中PTX、NBD-Cl、PTX和NBD-Cl的混合物及PTX-NBD)的红外光谱(FTIR)图谱；(a)PTX，(b)荧光探针NBD-Cl，(c)PTX和NBD-Cl的混合物,(d)PTX-NBD。

[0020] 图3是本发明实施例5中PTX、NBD-Cl、PTX和NBD-Cl的混合物及PTX-NBD)的红外光谱(FTIR)图谱；(a)PTX，(b)荧光探针NBD-Cl，(c)PTX和NBD-Cl的混合物,(d)PTX-NBD。

[0021] 图4是本发明实施例5中PTX-NBD对Hela细胞进行染色0.5h后的成像照片，(a)DAPI：激发波长为405nm，荧光收集波长为420-460nm；(b)NBD，激发波长为458nm，荧光收集波长为500-580nm；(c)明场图片；(d)Merge1：DAPI和NBD叠加图片；(e)Merge2：DAPI，NBD和明场叠加图片。

[0022] 图5是本发明实施例5中PTX-NBD对Hela细胞进行染色4h后的成像照片，(a)DAPI：激发波长为405nm，荧光收集波长为420-460nm；(b)NBD：激发波长为458nm，荧光收集波长为
500-580nm；(c)明场图片；(d)Merge1：DAPI和NBD叠加图片；(e)Merge2：DAPI，NBD和明场叠加图片。

具体实施方式

[0023] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

[0024] 本发明最关键的构思在于：荧光探针NBD-CL与PTX通过亲核取代反应合成PTX-NBD。

[0025] NBD作为荧光团不像荧光素那么熟为人知，NBD-Cl的反应活性不如FITC，本领域人员不易想到，因此，以更廉价的NBD-Cl标记紫杉醇一直没有相关报道，同时NBD-Cl标记紫杉醇的反应条件需要自行摸索和优化。

[0026] 请参照图1-5，本发明提供一种紫杉醇抗癌药物，其结构式为结构式1所示[0027]

[0028] 本发明的原理为：荧光探针NBD-CL与PTX通过亲核取代反应合成PTX-NBD，将PTX-NBD用于标记或显示PTX在活细胞中分布。

[0029] 从上述描述可知，本发明的有益效果在于：通过在紫杉醇(PTX)的结构中引入荧光探针NBD-Cl得到PTX-NBD，进而实现PTX在细胞及活体中的可视化，方便追踪，，相对PTX-FITC而言，本发明的PTX-NBD价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好。

[0030] 本发明还提供一种上述紫杉醇抗癌药物的制备方法，包括以下步骤：

[0031] 步骤1：将PTX与NBD-Cl于有机溶剂中混合反应得PTX-NBD混合液；

[0032] 步骤2：去除所述PTX-NBD混合液中的杂质，冻干，得PTX-NBD，所述PTX-NBD为紫杉醇抗癌药物。

[0033]

[0034] 从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明PTX-NBD的制备方法，合成工艺简单，易操作。

[0035] 进一步的，所述步骤1的具体操作为：精确称量一定量的PTX与NBD，并将其溶于有机溶剂中，常温磁力搅拌22-26h，优选24h，得淡黄绿色PTX-NBD混合液。

[0036] 进一步的，所述步骤2的具体操作为：在所述PTX-NBD混合液中加入去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-CL和有机溶剂，得到纯化的PTX-NBD，冻干，得淡黄色PTX-NBD。

[0037] 进一步的，所述PTX与NBD-Cl的摩尔比为1∶1～4。

[0038] 进一步的，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、氯仿或丙酮中的一种或多种。

[0039] 进一步的，所述有机溶剂为甲醇。

[0040] 本发明还提供上述PTX-NBD在标记或显示PTX在活细胞中分布的应用。

[0041] 从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本本发明的PTX-NBD能用于标记或显示PTX在活细胞中分布，具有高选择性标记肿瘤细胞的特点，减缓PTX对正常的细胞、组织、器官的影响，为PTX抗肿瘤研究提供了廉价、简捷、直观的生物检测试剂；所述NBD-CL荧光探针和DID、DIR具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值[0042] 进一步的，所述活细胞为HeLa细胞。

[0043] 实施例1

[0044] (PTX-NBD(a)的合成)：称取PTX、NBD(摩尔比为：1：4)，置于圆底烧杯中，加入适量有机溶剂甲醇，常温磁力搅拌反应24h，即可获得淡黄绿色PTX-NBD溶液并在其中加入适量去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-CL和有机溶剂甲醇，得到纯化的PTX-NBD，冻干得到黄色固体。产率：90％。

[0045] 实例2

[0046] (PTX-NBD(b)的合成)：称取PTX、NBD(摩尔比为：1：3)，置于圆底烧杯中，加入适量有机溶剂甲醇，常温磁力搅拌反应24h，即可获得淡黄绿色PTX-NBD溶液并在其中加入适量去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-CL和有机溶剂甲醇，得到纯化的PTX-NBD，冻干得到黄色固体。产率：92％。

[0047] 实例3

[0048] (PTX-NBD(c)的合成)：称取PTX、NBD(摩尔比为：1：2)，置于圆底烧杯中，加入适量有机溶剂甲醇，常温磁力搅拌反应24h，即可获得淡黄绿色PTX-NBD溶液并在其中加入适量去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-CL和有机溶剂甲醇，得到纯化的PTX-NBD，冻干得到黄色固体。产率：88％。

[0049] 实例4

[0050] (PTX-NBD(d)的合成)：称取PTX、NBD(摩尔比为：1：1)，置于圆底烧杯中，加入适量有机溶剂甲醇，常温磁力搅拌反应24h，即可获得淡黄绿色PTX-NBD溶液并在其中加入适量去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-CL和有机溶剂甲醇，得到纯化的PTX-NBD，冻干得到黄色固体。产率：91％。

[0051] 实例5

[0052] 请参照图1至图5，(PTX-NBD(e)的合成)：称取PTX、NBD(摩尔比为：1：1.2)，置于圆底烧杯中，加入适量有机溶剂甲醇，常温磁力搅拌反应24h，即可获得淡黄绿色PTX-NBD溶液并在其中加入适量去离子水，使用1000DA分子量的透析袋进行透析去除未反应的NBD-CL和有机溶剂甲醇，得到纯化的PTX-NBD，冻干得到黄色固体。产率：92％。

[0053] 优选的，上述实例中的PTX-NBD合成工艺中，所述PTX与NBD-CL的摩尔比为：1：1.2，所合成的PTX-NBD的分子量为1017.8(NBD-CL、PTX、PTX-NBD的ESI-MS图谱见图1，ESI-MS图谱的横坐标表示质荷比值，纵坐标表示相对丰度)；(PTX、PTX-NBD及PTX-NBD)的红外光谱(FTIR)图谱见图2及图3，FTIR图谱的横坐标表示波数(cm-1)。

[0054] Hela细胞的培养：HeLa细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清培养液中，在37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中培养，每2～3d换液传代1次。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100ml细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1ml 0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1x105)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。

[0055] Hela细胞对PTX-NBD(e)的细胞摄取：将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，用PBS稀释的250nM的DAPI溶液在CO2培养箱中染色细胞0.5h，染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，再用PBS稀释的2μM的本发明所述PTX-NBD溶液在CO2培养箱中分别染色细胞0.5h和4h。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果分别见图4及图5。

[0056] 结果发现，PTX-NBD在活细胞中荧光并未淬灭，而是随着培养时间的延长，荧光强度随之增强，亦或表明活细胞对PTX药物的摄取量随之增强，这从一方面证实了本发明所述PTX-NBD可高选择性标记肿瘤细胞。

[0057] 综上所述，本发明提供的紫杉醇抗癌药物、其制备方法及应用，通过在紫杉醇(PTX)的结构中引入荧光探针NBD-Cl得到PTX-NBD，进而实现PTX在细胞及活体中的可视化，方便追踪，，相对PTX-FITC而言，本发明的PTX-NBD价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好；本发明PTX-NBD的制备方法，合成工艺简单，易操作；实验结果证实，本发明的PTX-NBD能用于标记或显示PTX在活细胞中分布，具有高选择性标记肿瘤细胞的特点，减缓PTX对正常的细胞、组织、器官的影响，为PTX抗肿瘤研究提供了廉价、简捷、直观的生物检测试剂；所述NBD-CL荧光探针和DID、DIR具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。

[0058] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。