顺式曲札茋苷及其制备方法与检测方法

摘要

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及顺式曲札茋苷及其制备方法与检测方法。本发明提供了顺式曲札茋苷，并提供了其制备方法，该方法工艺路线短，操作简单，能够稳定地制备和供应该化合物。此外，本发明还公开了反式曲札茋苷样品中顺式曲札茋苷杂质的检测方法。该方法操作简单，易于实现，可用于反式曲札茋苷样品的杂质定性及定量分析，从而提高反式曲札茋苷的质量。本发明对保障反式曲札茋苷的安全、有效用药有重要的指导意义。

权利要求

1.顺式曲札茋苷的制备方法，包括：

步骤1：将反式曲札茋苷溶解后以光照射，制得反应物；

步骤2：对所述反应物进行色谱分离，收集含顺式曲札茋苷的洗脱液；

步骤3：回收所述洗脱液中的溶剂，制得顺式曲札茋苷；

所述光照射的光源发射含有波长为200nm～400nm的光。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶解的溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或石油醚中的一种或它们的组合。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，光照射的时间为0.25h～5h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述色谱分离采用高效液相色谱、薄层色谱或开放柱色谱。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述回收洗脱液中的溶剂包括减压回收和冷冻干燥的步骤；所述减压回收的温度为≤80℃。

6.顺式曲札茋苷的HPLC检测方法，其特征在于，采用C18色谱柱；紫外检测器，检测波长为285nm；

以乙腈为流动相A，以质量分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B；

洗脱程序为：

0min～25min，流动相A的体积分数由15％～30％；

25min～30min，流动相A的体积分数由30％～40％；

30min～35min，流动相A的体积分数由40％～15％；

35min～40min，流动相A的体积分数为15％。

7.顺式曲札茋苷作为反式曲札茋苷质控检测中杂质对照品的应用。

说明书

顺式曲札茋苷及其制备方法与检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，尤其涉及顺式曲札茋苷及其制备方法与检测方法。

背景技术

[0002] 曲札茋苷(中文化学名：白皮杉醇-3’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，英文化学名：piceatannol-3’-O-β-D-glucopyranoside)是从拉萨大黄(Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao)的根与根茎中提取的多羟基茋苷(二苯乙烯苷)类物质。因其植物来源拉萨大黄在藏药材中又名曲札，故称该化合物为曲札茋苷。

[0003] 曲札茋苷的结构中，两个苯环之间存在一个双键。理论上说，双键中的π键不能自由旋转的情况下，存在空间上顺式和反式两种异构体。由于反式曲札茋苷(式II)在热力学上较为稳定，因此以往的研究中得到的均为反式曲札茋苷，常省略双键的顺、反构型，以曲札茋苷指代反式曲札茋苷。

[0004]

[0005] 反式曲札茋苷具有多方面的药理活性。研究表明，反式曲札茋苷对缺血性心脑血管疾病的具有显著的保护作用。反式曲札茋苷能够显著增加肺血氧张力，降低肺组织间质水肿、含水量，具有一定的肺损伤保护作用。此外，反式曲札茋苷对多种癌细胞株的增殖有较好的抑制效果。因此，反式曲札茋苷在防治心脑血管疾病、防治肺损伤或急性呼吸窘迫综合征、防治肿瘤等多个方面具有潜在的临床应用价值。

[0006] 昆药集团股份有限公司对反式曲札茋苷进行了长期和深入的开发，研究了反式曲札茋苷的纯化方法，使得反式曲札茋苷的纯度提高至97％以上。在此基础上，以反式曲札茋苷为原料药，以羟丙基倍他环糊精为辅料，研制了注射用曲札茋苷。

[0007] 然而，长期以来反式曲札茋苷的纯度始终无法得到进一步的提高，在保存过程中特别是光照后纯度明显下降，且其中的杂质组分也一直没有得到明确。杂质控制是药品质量控制的核心内容之一，药品中的杂质是否能被全面准确地控制，直接关系到药品的质量的可控性与安全性。因此规范地进行杂质研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围内，对注射用曲札茋苷的进一步研究开发与临床应用具有重要的意义。目前，国内外对反式曲札茋苷的杂质研究尚属空白。因此，急需对其进行研究，以提高反式曲札茋苷相关产品的质量。

发明内容

[0008] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供顺式曲札茋苷及其制备方法与检测方法，本发明明确了顺式曲札茋苷的结构，公开了其制备方法，为反式曲札茋苷的质量检测提供了对照。

[0009] 本发明提供了式I所示顺式曲札茋苷；

[0010]

[0011] 发明人在反式曲札茋苷的杂质研究中，检测出顺式曲札茋苷，顺式曲札茋苷在反式曲札茋苷原料药以及它的稳定性试验、储存过程中均有检出，特别是原料药在光照过程中产生。发明人采用色谱技术对顺式曲札茋苷进行了分离纯化，采用高分辨质谱和核磁共振氢谱(1H NMR)、核磁共振碳谱(13C NMR)对其结构进行了鉴定。顺式曲札茋苷的分子式为C20H22O9，其1H NMR及13C NMR归属见表1。表中位置信息如式I-a，经鉴定，与反式曲札茋苷不同，其两苯环之间双键为顺式结构。

[0012]

[0013] 该化合物为首次分离鉴定，为新化合物。

[0014] 表1顺式曲札茋苷的1H NMR和13C NMR数据归属(δin ppm,J in Hz,methanol-d4,800MHz)

[0015]

[0016] 本发明的又一个目的是提供顺式曲札茋苷的制备方法。本发明采用光化学反应诱导反式曲札茋苷双键异构化，采用色谱技术对产物进行分离，得到高纯度的顺式曲札茋苷，其反应式为：

[0017]

[0018] 具体的，本发明提供的顺式曲札茋苷的制备方法包括：

[0019] 步骤1：将反式曲札茋苷溶解后以光照射，制得反应物；

[0020] 步骤2：对所述反应物进行色谱分离，收集含顺式曲札茋苷的洗脱液；

[0021] 步骤3：回收所述洗脱液中的溶剂，制得顺式曲札茋苷；

[0022] 所述光照射的光源发射含有波长为200nm～400nm的光。

[0023] 本发明实施例中，所述溶解的溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或石油醚中的一种或它们的组合；

[0024] 一些实施例中，溶解的溶剂选自水、甲醇或乙醇。

[0025] 一些具体实施例中，溶剂为甲醇。

[0026] 另一个具体实施例中，溶剂为体积分数为95％的乙醇水溶液。

[0027] 本发明中，光照射的光源发射紫外光，所述紫外光的波长为254nm～400nm；优选的，采用发射含有波长为365nm的光的光源。一个具体实施例中，光源为365nm紫外灯。一个具体实施例中，光源为高压汞灯(光谱主峰365nm，250W)；另一个具体实施例中，光源为日光，所述日光的照度为100000lux。

[0028] 本发明中，光照射的时间为0.25h～5h。

[0029] 具体的，采用365nm紫外灯照射的时间为4h，采用高压汞灯(光谱主峰365nm，250W)照射的时间为4h；采用日光照射的时间为0.25h～2h。更具体的，日光照度为100000lux时，照射时间为0.25h。

[0030] 本发明实施例中，色谱分离采用高效液相色谱、薄层色谱或开放柱色谱。

[0031] 采用高效液相色谱(HPLC)分离，以十八烷基(C18)硅烷键合硅胶为固定相，以甲醇水溶液为流动相。具体的，色谱柱为Phenomenex Luna Su C18(2)column(250mm×4.60mm,5μm)；流动相为体积分数为30％的甲醇水溶液；检测波长：319nm；柱温：20℃；进样量：100μl。

[0032] 采用薄层色谱(TLC)分离纯化，色谱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，以95％乙醇-水(20：80～40：60)多次展开。显色方法：展开后晾干，剪取部分薄层板，喷质量分数为10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰；确定目标斑点位置后，取点样、展开、晾干后未显色的薄层板，刮取目标条带。吸附有目标化合物的填料经甲醇反复浸泡、提取。

[0033] 采用开放柱色谱分离纯化，色谱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为20μm。以甲醇-水(20：80～60：40)梯度洗脱，洗脱液经TLC检测，收集目标洗脱液。

[0034] 作为优选，反应物进行色谱分离前经过浓缩的步骤，所述浓缩采用减压回收，温度不超过80℃，优选为10℃～35℃。

[0035] 本发明中，回收洗脱液中的溶剂包括减压回收和冷冻干燥的步骤；所述减压回收的温度为≤80℃。优选的，减压回收的温度≤40℃；优选为10℃～35℃。

[0036] 一个具体的制备方法包括：

[0037] 步骤a：将反式曲札茋苷溶于甲醇后，置365nm紫外灯下照射4小时，获得反应物；

[0038] 步骤b：将反应物采用高效液相色谱进行分离纯化；

[0039] HPLC采用C18色谱柱，流动相为体积分数为30％的甲醇水溶液；检测波长：319nm；收集目标色谱峰；

[0040] 步骤c：洗脱液35℃减压回收甲醇，冷冻干燥，得顺式曲札茋苷。

[0041] 另一个具体的制备方法包括：

[0042] 步骤a：将反式曲札茋苷溶于体积分数为95％的乙醇水溶液后，置高压汞灯(光谱主峰365nm，250W)下照射4小时，获得反应物；

[0043] 步骤b：将反应物采用薄层色谱进行分离纯化；

[0044] 色谱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，以95％乙醇-水(20：80～40：60)多次展开；

[0045] 步骤c：吸附有目标化合物的填料经甲醇洗脱后，经氮气吹干，得顺式曲札茋苷。

[0046] 另一个具体的制备方法包括：

[0047] 步骤a：将反式曲札茋苷溶于甲醇后，置日光下直接照射0.25小时(照度100000lux)，获得反应物；

[0048] 步骤b：将反应物采用开放柱色谱进行分离纯化；

[0049] 色谱填料为十八烷基硅烷键合硅胶(粒径：20μm)，以甲醇-水(20：80～60：40)梯度洗脱，洗脱液经TLC检测；

[0050] 步骤c：洗脱液40℃减压回收溶剂，冷冻干燥，得顺式曲札茋苷。

[0051] 结果表明，采用本发明提供的方法制备顺式曲札茋苷，纯度可达95.5％以上，最高可达98.5％。本发明制备顺式曲札茋苷采用的反式曲札茋苷可为从植物原料中提取，也可通过化学合成、生物合成、基因工程等多种手段获得，其只要具有反式曲札茋苷的化学结构即可，本发明对其来源不做限定。

[0052] 为了检测反式曲札茋苷中的顺式曲札茋苷，本发明还提供了顺式曲札茋苷的HPLC检测方法，采用C18色谱柱；紫外检测器，检测波长为285nm；

[0053] 以乙腈为流动相A，以质量分数为0.1％磷酸水溶液为流动相B；

[0054] 洗脱程序为：

[0055] 0min～25min，流动相A的体积分数由15％～30％；

[0056] 25min～30min，流动相A的体积分数由30％～40％；

[0057] 30min～35min，流动相A的体积分数由40％～15％；

[0058] 35min～40min，流动相A的体积分数为15％。

[0059] 对顺式曲札茋苷的定量采用峰面积归一化法计算。

[0060] 此外，对顺式曲札茋苷检测进样前，需将样品溶解，溶解采用的溶剂选自水、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚。

[0061] 优选的，溶解样品的溶剂选自水、甲醇、乙腈或乙醇。更优选的，溶解样品的溶剂为甲醇。溶解至样品浓度为40μg/ml。

[0062] 本发明中，流动相的流速为1.0ml/min；进样量为10μL。

[0063] 本发明还对顺式曲札茋苷的生理活性进行了考察，结果表明，顺式曲札茋苷同样具有抑制凝血酶的作用，其对凝血酶的抑制的IC50值为48.42μM。因此，本发明提供了顺式曲札茋苷在制备凝血酶抑制剂中的应用。但是本发明的实验同时显示，同等条件下反式曲札茋苷对凝血酶的抑制的IC50值为3.4μM；说明构象的改变造成顺式曲札茋苷的活性较反式曲札茋苷大大降低，提示顺式曲札茋苷是影响反式曲札茋苷防治缺血性脑卒中药效的关键杂质之一，应对其进行相应的控制。

[0064] 故而，本发明还提供了顺式曲札茋苷作为反式曲札茋苷质控检测中杂质对照品的应用。

[0065] 使用顺式曲札茋苷作为杂质对照品或称杂质标准品，能够更有效的鉴定反式曲札茋苷中的杂质，对反式曲札茋苷品质进行控制。

[0066] 本发明还提供了一种纯化反式曲札茋苷的方法，其为对反式曲札茋苷样品溶解后加热。所述加热的温度为50℃～100℃；所述溶解的溶剂选自水、乙醇或甲醇；优选的，溶剂为甲醇水溶液或乙醇水溶液；更优选的，溶剂为体积分数为25％的乙醇水溶液。

[0067] 具体的，纯化的方法包括：

[0068] 步骤1：将反式曲札茋苷样品溶解于体积分数为25％的乙醇水溶液，80℃加热1h；

[0069] 步骤2：将步骤1中经加热的溶液于100℃加热1h后，滤过，获得纯化后的反式曲札茋苷。

[0070] 采用本发明提供的方法，能够将样品中的顺式曲札茋苷含量由9.16％降低至0.77％。大大提高了产品的纯度和用药的有效性、安全性。

[0071] 本发明提供了顺式曲札茋苷，并提供了其制备方法，该方法工艺路线短，操作简单，能够稳定地制备和供应该化合物。此外，本发明还公开了反式曲札茋苷样品中顺式曲札茋苷杂质的检测方法。该方法操作简单，易于实现，可用于反式曲札茋苷样品的杂质定性及定量分析，从而提高反式曲札茋苷的质量。本发明对保障反式曲札茋苷的安全、有效用药有重要的指导意义。

附图说明

[0072] 图1示顺式曲札茋苷的高分辨质谱；

[0073] 图2示顺式曲札茋苷的核磁共振氢谱；

[0074] 图3示顺式曲札茋苷的核磁共振碳谱；

[0075] 图4示HPLC色谱图；其中，图4-a示未避光保存的反式曲札茋苷样品的色谱图；图4-b示反式曲札茋苷标准品色谱图；图4-c示顺式曲札茋苷标准品色谱图；

[0076] 图5示HPLC色谱图；其中，图5-a示纯化前的反式曲札茋苷样品；图5-b示经80℃加热1h后的反式曲札茋苷样品；图5-c示经100℃加热1h后的反式曲札茋苷样品。

具体实施方式

[0077] 本发明提供了顺式曲札茋苷及其制备方法与检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0078] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

[0079] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0080] 实施例1：顺式曲札茋苷的分离纯化

[0081] 1.主要仪器

[0082] Agilent 1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、VWD检测器)(安捷伦公司)、Bruker Avance 800M核磁共振仪(Bruker公司)、CP225D分析天平(赛多利斯公司)、Milli-Q超纯水机(Millipore公司)、Agilent QTOF 6540质谱仪(安捷伦公司)、Buchi R-3旋转蒸发仪(Buchi公司)、ED-IE-50冻干机(上海比郎仪器有限公司)。

[0083] 2.实验材料

[0084] (1)试剂：甲醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、超纯水、反式曲札茋苷样品(昆药集团股份有限公司药物研究院自制，含顺式曲札茋苷约2.0％)、氘代甲醇(Sigma-Aldrich公司)。

[0085] (2)色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×9.4mm,5μm)

[0086] 3.顺式曲札茋苷的分离纯化

[0087] 取反式曲札茋苷样品500mg，溶于甲醇，HPLC系统分离纯化。色谱条件：流动相：甲醇-水(30：70)；检测波长：319nm；柱温：20℃；流速：2.5ml/min；进样量：700μl。反复进样，收集目标峰。含有目标化合物的洗脱液先用旋转蒸发仪35℃减压回收甲醇，之后冷冻干燥，得顺式曲札茋苷5mg(白色粉末)。4.顺式曲札茋苷的结构鉴定

[0088] 顺式曲札茋苷的分子式C20H22O9经高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)确定，负离子模式下给出[M-H]-准分子离子峰，质荷比(m/z)为:405.1198(计算值405.1191)。质谱图见附图1。

[0089] 本发明采用1H NMR及13C NMR对制得的白色粉末进行了分析。1H NMR光谱中，烯氢的偶合常数为12.0Hz，提示双键为顺式(反式曲札茋苷烯氢偶合常数为16.0Hz)，结合文献(KASHIWADA Y.,NONAKA G.,NISHIOKA I..Studies on Rhubarb(Rhei Rhizoma).VI:isolation and characterization of stilbenes,Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1984,32(9):3501-3517.)中结构类似化合物的核磁数据，该化合物的结构鉴定为顺式曲札茋苷，1H NMR及13C NMR图谱见附图2和附图3，信号归属见表1。经文献检索，顺式曲札茋苷系首次得到，为新化合物。

[0090] 实施例2：生物活性测定

[0091] 凝血酶是机体凝血系统中的一种重要组成因子，是一种生成于损伤处血管内皮细胞的多功能蛋白酶，位于凝血激活通路后段，是触发凝血反应的效应器。当血管内膜损伤，血小板粘附、聚集、激活，促进血液凝结，进而激活凝血系统，凝血酶原复合物激活凝血酶，使纤维蛋白原变成不溶的纤维蛋白，形成血栓。前期实验表明，反式曲札茋苷具有抑制凝血酶的活性，该活性与其防治缺血性脑卒中的药效密切相关。

[0092] 本实验采用荧光法测定，凝血酶与底物结合促使底物中的荧光基团暴露，在激发光波长360/40nm，发射光波长460/40nm下酶反应发生荧光，此时酶活力与平均反应速度成正比，即平均反应速度越大，酶活力越强。根据样品测定孔、溶媒标准孔的凝血酶活性，可计算化合物对凝血酶的抑制率，从而比较顺式曲札茋苷和反式曲札茋苷的活性。

[0093] 1.主要仪器

[0094] HS-25型pH计(丹佛仪器有限公司)、SYNERGY HT酶标仪(BioTek)、IMS-70型全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)、移液器(Eppendorf、Sartorius)、96孔板(黑色)(Corning)。

[0095] 2.主要试剂

[0096] Tris-base，Purity≥99.9％(Amresc)、浓HCl(云南汕滇药业有限公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)、酶：Human thrombin(HYPHEN)Vial of 10NIH、荧光底物：Thrombin substrate2(FR-2)Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC(BIOMATIK)、阿加曲班原料药(湖北鑫源顺医药化工有限公司)、纯化水。

[0097] 3.试剂配制

[0098] Buffer：称取Tris-base 0.18165g，加水25ml溶解，加入0.3M(0.52596g)NaCl，以浓HCl调节pH 8.40，定容至30ml，4℃保存。

[0099] 4mM Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC底物储备液：称取Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC2.0mg，加入862.7μl去离子水溶解，置4℃保存，临用前加去离子水稀释至所需浓度。

[0100] Human thrombin原液：临用前取10IU/ml的原液适量，以去离子水稀释至所需浓度并置于冰上待用。

[0101] 顺式曲札茋苷、反式曲札茋苷、阿加曲班：分别称取顺式曲札茋苷、反式曲札茋苷、阿加曲班，加入DMSO溶解，常温保存，临用前用DMSO稀释至所需浓度。

[0102] 4.样品测定

[0103] 顺式曲札茋苷配制浓度为30mM，稀释成5个浓度，分别为15、7.5、3.75、1.875、0.9735mM系列浓度，按下表体系加入板中，每个浓度置两个副孔进行检测。

[0104] 反式曲札茋苷配制浓度为3mM，稀释成5个浓度，分别为1.5、0.75、0.375、0.1875、0.09735系列浓度，按下表体系加入板中，每个浓度置两个副孔进行检测。

[0105] 阿加曲班配制浓度为50μM，稀释成5个浓度，分别为16.67、5.56、1.85、0.62、0.21μM系列浓度，按表2体系加入板中，每个浓度置两个副孔进行检测。

[0106] 表2酶浓度测定体系(反应体系100μl)

[0107]

[0108] 立即于酶标仪上测定，荧光方法，激发光390/40，发射光460/40(测定时间间隔51s)，顶部检测，增益70，25℃反应10min凝血酶抑制率计算：

[0109] 抑制率(％)＝((△V(标准孔)－△V(样品孔))/△V(标准孔))×100％

[0110] △V：扣除本底后的平均反应速度均值

[0111] IC50值测定：用软件GraphPad Prism6对样品反应浓度对数与Mean V作图，得IC50。

[0112] 5.结果

[0113] 阳性药阿加曲班的IC50为29.63nM，表明模型建立成功。顺式曲札茋苷和反式曲札茋苷的IC50分别为48.42μM和3.40μM。顺式曲札茋苷同样具有抑制凝血酶的作用，但活性较反式曲札茋苷显著降低，提示顺式曲札茋苷是影响反式曲札茋苷防治缺血性脑卒中药效的关键杂质之一，应对其进行相应的控制。

[0114] 实施例3：顺式曲札茋苷的制备

[0115] 1.主要仪器

[0116] Agilent 1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、VWD检测器)(安捷伦公司)、CP225D分析天平(赛多利斯公司)、Milli-Q超纯水机(Millipore公司)、ZF-6紫外灯(上海嘉鹏科技有限公司)、Buchi R-3旋转蒸发仪(Buchi公司)、ED-IE-50冻干机(上海比郎仪器有限公司)。

[0117] 2.实验材料

[0118] (1)试剂：甲醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、超纯水、曲札茋苷对照品(昆药集团股份有限公司药物研究院自制)。

[0119] (2)色谱柱：Phenomenex Luna Su C18(2)column(250mm×4.60mm,5μm)3.反式曲札茋苷的异构化

[0120] 取反式曲札茋苷样品130mg，溶于50ml甲醇，置365nm紫外灯下照射4h，35℃减压浓缩至2ml。

[0121] 4.顺式曲札茋苷的分离纯化

[0122] 顺式曲札茋苷由HPLC系统分离纯化，色谱条件：流动相：甲醇-水(30：70)；检测波长：319nm；柱温：20℃；进样量：100μl。

[0123] 反复进样，收集目标峰，35℃减压回收甲醇后冷冻干燥，得顺式曲札茋苷16mg，经测定纯度为98.5％。

[0124] 实施例4：顺式曲札茋苷的制备

[0125] 1.主要仪器

[0126] CP225D分析天平(赛多利斯公司)、高压汞灯(国产，光谱主峰365nm，250W)。

[0127] 2.实验材料

[0128] (1)试剂：95％乙醇(工业级)、甲醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、去离子水、曲札茋苷对照品(昆药集团股份有限公司药物研究院自制)、浓硫酸(分析纯)。

[0129] (2)色谱填料：十八烷基硅烷键合硅胶制备型薄层板(默克公司)

[0130] 3.反式曲札茋苷的异构化

[0131] 取反式曲札茋苷样品150mg，溶于50ml 95％乙醇，置高压汞灯下照射4h，35℃减压浓缩至2ml。

[0132] 4.顺式曲札茋苷的分离纯化

[0133] 顺式曲札茋苷由制备薄层色谱(TLC)分离纯化：展开条件：95％乙醇-水(20：80～40：60)多次展开。显色方法：展开后晾干，剪取部分薄层板，喷10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。确定目标斑点位置后，取点样、展开、晾干后未显色的薄层板，刮取目标条带。吸附有目标化合物的填料经甲醇反复浸泡、提取，提取液滤过，滤液室温氮气吹干，得顺式曲札茋苷10mg，经测定纯度为98.0％。

[0134] 实施例5：顺式曲札茋苷的制备

[0135] 1.主要仪器

[0136] CP225D分析天平(赛多利斯公司)、Buchi R-3旋转蒸发仪(Buchi公司)。2.实验材料

[0137] (1)试剂：甲醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)、去离子水、曲札茋苷对照品(昆药集团股份有限公司药物研究院自制)。

[0138] (2)色谱填料：十八烷基硅烷键合硅胶(粒径：20μm)(YMC公司)。

[0139] 3.反式曲札茋苷的异构化

[0140] 取反式曲札茋苷样品1g，溶于250ml甲醇，置日光下直射0.25h(照度100000lux)，40℃减压浓缩。

[0141] 4.顺式曲札茋苷的分离纯化

[0142] 顺式曲札茋苷由开放柱色谱分离纯化，以甲醇-水(20：80～60：40)梯度洗脱，洗脱液经TLC检测，收集目标洗脱液，40℃减压回收溶剂，得顺式曲札茋苷200mg，经测定纯度为95.5％。

[0143] 实施例6：顺式曲札茋苷的检测

[0144] 1.主要仪器

[0145] Agilent 1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器)(安捷伦公司)、CP225D分析天平(赛多利斯公司)、Milli-Q超纯水机(Millipore公司)。

[0146] 2.实验材料

[0147] (1)试剂：色谱纯乙腈(德国默克股份两合公司)、色谱纯甲醇(德国默克股份两合公司)、磷酸(分析纯)、甲酸(色谱纯)、超纯水、顺式曲札茋苷和反式曲札茋苷对照品(昆药集团股份有限公司药物研究院自制)、反式曲札茋苷样品(昆药集团股份有限公司药物研究院自制)。

[0148] (2)色谱柱：Grace Apollo C18column(250mm×4.6mm,5μm)、Phenomenex Luna Su C18(2)column(250mm×4.60mm,5μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18column(250mm×4.60mm,5μm)。

[0149] 3.对照品及供试品溶液的制备

[0150] 顺式曲札茋苷、反式曲札茋苷可溶于水、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚等溶剂中的一种或几种的组合。考虑到与HPLC系统的兼容性，优选甲醇、乙腈、乙醇或它们的水溶液，本研究最终选用甲醇。兼顾信号强度与对照品用量，顺式曲札茋苷、反式曲札茋苷对照品溶液和反式曲札茋苷供试品溶液的浓度均优选为40μg/ml。顺式曲札茋苷、反式曲札茋苷对光照敏感，优选棕色容量瓶。

[0151] 因此规定对照品溶液的制备方法：分别精密称取顺式曲札茋苷与反式曲札茋苷对照品适量，置于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释配制成每1ml含40μg的溶液，滤过，即得顺式曲札茋苷和反式曲札茋苷对照品溶液。反式曲札茋苷样品供试品溶液制备方法：精密称取反式曲札茋苷样品适量，置于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释配制成每1ml含40μg的溶液，滤过，即得反式曲札茋苷供试品溶液。

[0152] 4.色谱条件优化

[0153] 色谱柱考察：为保证分析方法的通用性，本发明采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的(C18)色谱柱，对多个厂家(Grace、Phenomenex、Agilent)的C18色谱柱进行了考察，结果显示不同厂家的C18色谱柱均能满足分析要求，方法重现性良好，以Grace Apollo C18column(250mm×4.6mm,5μm)为最佳。

[0154] 流动相选择：对流动相组成进行了考察(乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-水、甲醇-磷酸-水、甲醇-甲酸-水)，乙腈系统略好于甲醇系统，梯度洗脱效果好于等度洗脱，磷酸和甲酸的加入有利于改善峰形。在此基础上，考察了不同浓度(0.01～3％，体积百分比)的磷酸-水和甲酸-水对分离效果的影响，以0.1％磷酸-水为最佳。

[0155] 检测波长的选择：本研究采用二极管阵列紫外检测器对检测波长(210～400nm)进行了考察。对于反式曲札茋苷，以285nm最为灵敏，因此优选285nm作为检测波长。

[0156] 此外我们对流速(0.1～2.0ml/min)和进样量(0.1～100μl)进行了考察和优化。

[0157] 综合以上研究，规定色谱条件为：Grace Apollo C18column(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；流速：1.0ml/min；检测波长：319nm；按表3中的规定进行梯度洗脱；进样量10μl。

[0158] 表3洗脱梯度

[0159]时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 15 85
25 30 70
30 40 60
35 15 85
40 15 85

[0160] 5.方法学考察

[0161] 本研究对建立的分析方法进行了方法学考察，结果表明其精密度(n＝6)、重复性(n＝6)符合要求(顺式、反式曲札茋苷的峰面积RSD小于5％，保留时间RSD小于2％)，样品于24小时内稳定(顺式、反式曲札茋苷的峰面积RSD小于5％，保留时间RSD小于2％)。

[0162] 6.样品测定

[0163] 采用上述高效液相色谱方法对对照品溶液和不同批次、保存方式的反式曲札茋苷供试品溶液进行测定。其中，反式曲札茋苷样品的HPLC色谱图如图4-a；反式曲札茋苷对照品的HPLC色谱图如图4-b；顺式曲札茋苷对照品的HPLC色谱图如图4-c。

[0164] 通过与对照品溶液色谱图对照保留时间，确定供试品溶液色谱图中的顺式曲札茋苷和反式曲札茋苷色谱峰。以峰面积归一化法计算顺式曲札茋苷和反式曲札茋苷的含量。结果如表4。

[0165] 表4：检测结果

[0166]批次 顺式曲札茋苷含量(％) 反式曲札茋苷含量(％) 备注
1 0.40 99.60 样品避光保存
2 0.18 99.82 样品避光保存
3 0.55 99.45 样品避光保存
4 4.12 95.88 样品未避光保存
5 3.69 96.31 样品未避光保存

[0167] 以上研究表明本发明建立的分析方法能够用于反式曲札茋苷样品的质量控制。反式曲札茋苷样品须避光保存。

[0168] 实施例6反式曲札茋苷样品的纯化

[0169] 精密量取一暴露于日光下的曲札茋苷样品25.28mg，置50ml容量瓶中，加入25％乙醇溶液至刻度，摇匀，即得曲札茋苷储备液。精密量取曲札茋苷储备液4ml，置50ml容量瓶中，加入25％乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液1。

[0170] 取供试品溶液1经实施例6所述的方法进行HPLC检测，其中顺式曲札茋苷样品的质量分数为9.16％。

[0171] 取供试品溶液1置烧杯中，精密称定，置80℃水浴锅中加热1h，补足失重，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液2，进行HPLC检测，其中顺式曲札茋苷样品的质量分数为3.69％。

[0172] 取供试品溶液2置烧杯中，精密称定，置100℃水浴锅中加热1h，补足失重，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液3，进行HPLC检测，其中顺式曲札茋苷样品的质量分数为0.77％。

[0173] 结果表明，在水浴及煮沸过程中，曲札茋苷顺式异构体会迅速转化为反式异构体，按峰面积归一化法计算，其峰面积占总峰面积的百分比由约9.16％下降至约0.77％。该方法可用于反式曲扎的进一步纯化。

[0174] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。