基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法及应用，表面分子印迹微球的制备方法是以疏水羟基磷灰石纳米粒子作为稳定粒子，以蛋白质为模板分子，通过水相中多巴胺单体的自组装制备聚合物微球，再进一步用洗脱剂除去模板分子，即得到表面分子印迹微球，表面分子印迹微球表面具有印迹位点，可以和溶液中的目标分子充分接触，实现对目标分子的高效特异性吸附，可广泛应用于生物体系中蛋白质的特异性吸附与分离；该法制备易于上手，制备简便，成本低廉，极有利于大规模而工业生产。

权利要求

1.基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将羟基磷灰石纳米稳定粒子表面进行疏水修饰后，分散至有机溶剂中，得到油相；

2）将模板分子和多巴胺溶于PBS缓冲溶液中，得到水相；

3）所述油相和所述水相混合并振荡，得到油包水型皮克林乳液；

4）将所述皮克林乳液进行自组装聚合反应，得到聚合物微球；

5）所述聚合物微球通过洗脱模板分子，即得表面分子印迹微球。

2.根据权利要求1所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：采用3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷对羟基磷灰石纳米稳定粒子进行表面疏水修饰。

3.根据权利要求1所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为甲苯、乙腈、氯仿、四氢呋喃中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：所述模板分子与多巴胺的摩尔比为 1:（4 25）。

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5.根据权利要求1或4所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：所述的模板分子为牛血红蛋白。

6.根据权利要求1所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：所述水相中多巴胺的浓度为 1.0 50 mg/mL，水相的~pH为7.4 11。

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7.根据权利要求1所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：所述的自组装聚合反应在室温条件下进行，聚合反应时间为2 24h。

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8.根据权利要求1所述的基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，其特征在于：洗脱模板分子过程中采用的洗脱剂为SDS水溶液、醋酸水溶液或SDS/醋酸水溶液。

9.权利要求 1 8 任一项所述方法制备的表面分子印迹微球的应用，其特征在于：应用~于特异性吸附溶液体系中的蛋白质。

10.权利要求9所述的表面分子印迹微球的应用，其特征在于：所述的蛋白质为牛血红蛋白。

说明书

基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表

面分子印迹微球的方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种表面分子印迹微球的制备方法及应用，特别涉及一种基于羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法及其在特异性吸附溶液体系中的蛋白应用，具体涉及一种以疏水修饰的羟基磷灰石为稳定粒子，以多巴胺为自聚功能单体，以牛血红蛋白为模板分子，通过多巴胺在皮克林乳液中的自组装聚合制备表面分子印迹微球的方法；属于功能高分子制备和生物分离工程领域。

背景技术

[0002] 蛋白质作为生物体的重要基础组成物质，对生物体的整个生命过程中发挥了不可替代的作用。研究蛋白质对于了解生命过程、医疗实践、生物工程等领域有着重大的指导意义。然而由于生物体的各种组织和细胞中都含有多种不同的蛋白质，要得到纯净的蛋白质并非易事，因此蛋白质的分离纯化是一项复杂而充满挑战的工作，生物工程和医疗科技的迅速发展又对蛋白质的分离纯化提出了更高的要求。传统的分离纯化方法诸如盐析、色谱法、沉淀法、透析、超滤、电泳等由于成本高、过程复杂，在大规模生产尤其是医疗领域的应用受到限制。

[0003] 表面分子印迹技术分离蛋白质的基本原理是：将一定结构的目标蛋白质作为模板，以硅胶粒子、有机聚合物或者壳聚糖为惰性载体，利用蛋白质中的氨基、羧基为结合位点，合成一类聚合物材料，然后去除模板蛋白，得到一类具有固定三维空间结构的孔穴，从而得到对模板蛋白具有特异选择性的表面印迹材料，对模板分子有较高的选择性和较大的吸附容量。

[0004] 目前，表面分子印迹技术在制备聚合物时采用的聚合方法诸如自由基聚合等，反应需要引发剂和相转移剂，使用大量的有毒有害有机溶剂。

发明内容

[0005] 针对现有的表面分子印迹微球的制备方法存在的缺陷，本发明的一个目的是在于提供了一种形貌均一、具有蛋白特异性结合吸附位点的表面分子印迹微球的制备方法，该方法操作步骤简单、成本低廉，有利于大规模生产。

[0006] 本发明的另一个目的是在于提供一种所述的表面分子印迹微球的在特异性吸附溶液体系中蛋白质方面的应用，以蛋白质为模板分子制备的表面分子印迹微球对蛋白质具有很好的特异性吸附，可广泛应用在医学、生物学领域里对蛋白质的选择性吸附分离。

[0007] 为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于疏水羟基磷灰石纳米稳定粒子的皮克林乳液聚合制备表面分子印迹微球的方法，该方法包括以下步骤：

[0008] 1)将羟基磷灰石纳米粒子表面进行疏水修饰后，分散至有机溶剂中，得到油相；

[0009] 2)将模板分子和多巴胺溶于PBS缓冲溶液中，得到水相；

[0010] 3)所述油相和所述水相混合并振荡，得到油包水型皮克林乳液；

[0011] 4)将所述皮克林乳液进行自组装聚合反应，得到聚合物微球；

[0012] 5)所述聚合物微球通过洗脱模板分子，即得表面分子印迹微球。

[0013] 本发明的技术方案利用多巴胺在弱碱性条件下进行自聚(自组装)的特点，设计皮克林乳液聚合反应来制备表面分子印迹微球，该制备方法步骤简单，可以在室温下反应，且原料利用率高(95％以上)，无需采用交联剂和引发剂，克服了现有技术中的自由基聚合需采用交联剂和引发剂，且需要加热，反应难以控制等缺点。本发明的技术方案首次采用了疏水羟基磷灰石纳米粒子作为皮克林乳液的稳定剂，羟基磷灰石纳米粒子表面含有大量的羟基，亲水性良好，难以形成稳定的油包水型皮克林乳液，通过对羟基磷灰石表面的亲水羟基进行适当疏水修饰后，提高了羟基磷灰石的亲油性，在无需使用表面活性剂的条件下，能获得稳定性特别好的皮克林乳液，有利于多巴胺的自组装聚合。本发明的技术方案以疏水羟基磷灰石纳米粒子作为稳定粒子，制备的表面分子印迹微球，形貌均匀，呈标准的微米级球形颗粒。本发明的技术方案采用的羟基磷灰石表面含有大量羟基，易于进行各种功能化修饰，且羟基磷灰石作为脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机组成成分，具有良好的生物相容性和生物活性，将其应用于蛋白质的选择性分离当中，有助于保持蛋白质的生物活性，减少甚至避免蛋白质的变性失活。

[0014] 优选的方案，采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对羟基磷灰石纳米粒子进行表面疏水修饰。将羟基磷灰石纳米粒子进行表面疏水修饰的具体过程为:将3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷滴加到含羟基磷灰石的甲苯悬浮液中，在氮气保护下，于110～130℃温度下反应，12～36h。

[0015] 优选的方案，有机溶剂为甲苯、乙腈、氯仿、四氢呋喃中的至少一种。

[0016] 优选的方案，模板分子与多巴胺的摩尔比为1:(4～25)。

[0017] 较优选的方案，模板分子一般根据表面分子印迹微球的应用要求而选择合适的蛋白质，本发明优选为牛血红蛋白。

[0018] 优选的方案，所述水相中多巴胺的浓度为1.0～50mg/mL；优选为10～40mg/mL；更优选为20～30mg/mL。

[0019] 优选的方案，所述水相的pH为7.4～11。保持溶液的偏弱碱性，有利于多巴胺的自组装聚合。

[0020] 优选的方案，自组装聚合反应在室温条件下进行，聚合反应时间为2～24h。

[0021] 优选的方案，洗脱模板分子时采用的洗脱剂为SDS水溶液、醋酸水溶液或SDS/醋酸水溶液。SDS水溶液、醋酸水溶液或SDS/醋酸水溶液的浓度为0.1～20wt.％。

[0022] 优选的方案，疏水羟基磷灰石纳米粒子通过超声分散在有机溶剂中，超声分散的时间一般为15～120min。

[0023] 本发明采用的羟基磷灰石纳米粒子为常规的市售产品。

[0024] 本发明还提供了一种表面分子印迹微球的应用，将其应用于特异性吸附溶液体系中的蛋白质。

[0025] 优选的方案，蛋白质为牛血红蛋白。

[0026] 相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

[0027] 1)本发明的技术方案以多巴胺为聚合单体，基于皮克林乳液聚合反应来制备表面分子印迹微球，具有步骤简单，反应条件温和，原料利用率高(95％以上)的特点，且无需采用交联剂和引发剂等，有利于节约成本和降低安全隐患，克服了现有技术中的自由基聚合需采用交联剂和引发剂，且需要加热，反应难以控制等缺点。

[0028] 2)本发明的技术方案采用了疏水羟基磷灰石纳米粒子作为皮克林乳液的稳定剂，能在无需使用表面活性剂的条件下，能获得稳定性特别好的皮克林乳液，简化了乳液的制备过程，且有利于多巴胺的自组装聚合，同时以疏水羟基磷灰石纳米粒子作为稳定粒子，制备的表面分子印迹微球，形貌均匀，呈标准的微米级球形颗粒。

[0029] 3)本发明的技术方案选用疏水羟基磷灰石纳米粒子是生物体骨骼的主要成分改性得到，其生物相容性良好，将其应用于蛋白质的选择性分离当中，有助于保持蛋白质的生物活性，减少甚至避免蛋白质的变性失活，有利于表面分子印迹微球在生物学、医学领域得到广泛的应用。

[0030] 4)本发明的技术方方可以根据不同的目标分子设计表面印迹微球，使表面印迹微球对目标分子具有特异性吸附功能，以实现目标分子的吸附分离、纯化等，可在生物学、医学领域得到广泛的应用。

附图说明

[0031] 【图1】是实施例1制备的MIPs的扫描电镜图；

[0032] 【图2】是实施例1制备的MIPs的动态吸附图；

[0033] 【图3】是实施例1制备的MIPs的静态吸附图；

[0034] 【图4】是实施例1制备的MIPs的选择性吸附图。

具体实施方式

[0035] 以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

[0036] 实施例1

[0037] 称取5.0g羟基磷灰石，加入到含有150mL无水甲苯的三颈瓶中，超声波辅助分散30分钟。向该体系慢慢滴加2mL的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，然后在氮气保护下120℃反应1天。冷却至室温后用甲苯通过离心洗去未反应的硅烷偶联剂并将所得样品于60℃真空干燥2天，即得疏水羟基磷灰石纳米粒子。

[0038] 称取170mg疏水羟基磷灰石纳米粒子，加入到10mL甲苯中，超声分散30分钟，得到油相。称取20mg牛血红蛋白，加入到4mLPBS缓冲液(pH＝7.4)中，振荡使其充分溶解，再加入100mg多巴胺盐酸盐，振荡使充分溶解，此为水相。将水相和油相分别置于冰箱冷藏20min，然后混合，大力振荡形成稳定的皮克林乳液。将得到的乳液置于室温下聚合2h，将产物用甲苯和纯净水洗涤干净，然后用洗脱剂(SDS：10％，醋酸：10％)除去模板分子，得到有特异性位点的分子印迹聚合物(MIP)，非分子印迹和聚合物(NIP)在制备时不加入牛血红蛋白，其他步骤完全相同。

[0039] (1)吸附动力学试验

[0040] 称取10mgMIP或NIP置于10mL螺口瓶中，加入浓度为0.5mg/mL的牛血红蛋白PBS缓冲液，从振荡开始计时，分别在3,5,10,20,30,40,50分钟时，取上清液测紫外，得到动态吸附曲线。

[0041] (2)静态吸附试验

[0042] 称取10mgMIP或NIP置于10mL螺口瓶中，加入浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/mL的牛血红蛋白的PBS溶液，振荡2h，取上清液测紫外，得到静态吸附曲线。

[0043] (3)特异性吸附试验

[0044] 称取10mgMIP或NIP置于10mL螺口瓶中，分别加入浓度为0.5mg/mL的牛血红蛋白PBS溶液，或牛血清蛋白的PBS溶液，或牛胰蛋白的PBS溶液，或溶菌酶的PBS溶液，振荡1h，取上清液测紫外，得到特异性吸附图。

[0045] 图1表明了制得的聚合物微球的形貌，其直径约为40μm左右。

[0046] 图2为聚合物微球的动态吸附曲线，MIP和NIP在20min内均实现快速吸附，20min后吸附速度降低，30min后达到吸附平衡。传统的分子印迹聚合物需要数小时才能达到吸附平衡，而该表面分子印迹微球显示出了明显优于传统材料的优势，大大提高了吸附效率。

[0047] 图3是聚合物微球的静态吸附曲线，MIP和NIP的最大吸附容量分别为438mg/g和134mg/g，表明该聚合物微球具有显著的特异性。

[0048] 图4表明了聚合物微球的选择性吸附曲线，MIP和NIP对其他作为参照的蛋白质平均显示出了较低的吸附容量。

[0049] 实施例2

[0050] 称取120mg的疏水羟基磷灰石纳米粒子(由实施例1制备)，加入到8mL乙腈中，超声分散20分钟，得到油相。称取15mg牛血红蛋白，加入到4mLPBS缓冲液(pH＝8.5)中，振荡使其充分溶解，再加入100mg多巴胺盐酸盐，振荡使充分溶解，此为水相。将水相和油相分别置于冰箱冷藏20min，然后混合，大力振荡形成稳定的皮克林乳液。将得到的乳液置于室温下聚合5h，将产物用乙腈和纯净水洗涤干净，然后用洗脱剂(SDS：5％，醋酸：10％)除去模板分子，得到有特异性位点的分子印迹聚合物(MIP)，非分子印迹和聚合物(NIP)在制备时不加入牛血红蛋白，其他步骤完全相同。吸附试验同实施例1，吸附结果表明该分子印迹聚合物对目标分子牛血红蛋白具有显著的特异性吸附，且吸附效率高。

[0051] 实施例3

[0052] 称取200mg的疏水的羟基磷灰石纳米粒子(由实施例1制备)，加入到15mL甲苯中，超声分散50分钟，得到油相。称取20mg牛血清蛋白，加入到7mLPBS缓冲液(pH＝10.0)中，振荡使其充分溶解，再加入100mg多巴胺盐酸盐，振荡使充分溶解，此为水相。将水相和油相分别置于冰箱冷藏30min，然后混合，大力振荡形成稳定的皮克林乳液。将得到的乳液置于室温下聚合8h，将产物用甲苯和纯净水洗涤干净，然后用洗脱剂(SDS：10％，醋酸：6％)除去模板分子，得到有特异性位点的分子印迹聚合物(MIP)，非分子印迹和聚合物(NIP)在制备时不加入牛血清蛋白，其他步骤完全相同。吸附试验同实施例1，吸附结果表明该分子印迹聚合物对目标分子牛血清蛋白具有显著的特异性吸附。

[0053] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方案，但本发明保护范围并不局限于此，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同交换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。