聚谷氨酸/海藻酸钠粘附性水凝胶及其制备方法

摘要

本发明涉及一种聚谷氨酸/海藻酸钠粘附性水凝胶及其制备方法。本发明将具有组织粘附性能的儿茶酚基团引入到聚L‑谷氨酸/海藻酸钠席夫碱凝胶体系，通过酰肼化聚L‑谷氨酸和氧化海藻酸钠之间的席夫碱交联构建第一交联网络体系，将三价铁离子的络合作用作为第二交联网络体系构建水凝胶，尽量多地保留儿茶酚残基，同时在酰肼化的聚L‑谷氨酸组分混入一定量的三价铁，最大限度地发挥儿茶酚基团的组织粘附性，同时避免常规儿茶酚氧化交联所带来的组织毒性等的问题。所采用的材料均具有良好的生物相容性，避免了通过氧化剂氧化交联带来的各种缺陷，并最大限度地保留粘附性基元，在组织工程领域具有良好的应用前景。

权利要求

1.制备聚谷氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶的方法，其特征在于：该方法的具体步骤为：a. 将海藻酸钠溶于去离子水中，加热搅拌下至海藻酸钠完全溶解，然后冷却至常温，按海藻酸钠：高碘酸钠=（5 2）:1的摩尔比加入高碘酸钠，在避光条件下反应3 24h，加入乙~ ~二醇终止反应，常温下在去离子水中透析后冻干，得到氧化海藻酸钠；

b. 在常温下，将步骤a所得的氧化海藻酸钠配制成质量浓度为1wt% 3wt%的水溶液，调~节pH=4 5，活化1 3h后，在惰性气氛保护下，再加入盐酸多巴胺溶液，搅拌反应18 24h，在pH~ ~ ~为4-6的缓冲溶液中透析2 3天，然后在去离子水中透析，过滤，最后冷冻干燥得到多巴胺改~性的氧化海藻酸钠；此步骤中盐酸多巴胺与氧化海藻酸钠的摩尔比为：1 3:1；

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c.将聚L-谷氨酸溶于去离子水，然后逐滴滴加3mol/L NaOH溶液，使聚L-谷氨酸完全溶解于去离子水中，加入1 3倍物质的量的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸~盐）/NHS （N-羟基琥珀酰亚胺）和2 4倍己二酸二酰肼在常温下反应18-24小时，再透析3 5~ ~天后取出后过滤，将滤液冷冻干燥后得到酰肼化的聚L-谷氨酸；

d. 将步骤b所得的多巴胺改性的氧化海藻酸钠溶于去离子水配制成质量浓度为3%-7%的溶液，作为第一组份前驱溶液；将步骤c所得的酰肼化的聚L-谷氨酸配制成质量浓度3%-

7%溶液，再滴加浓度为0.5 1mol/L的三氯化铁水溶液，使得n（Fe3+）：n（儿茶酚基团）为1 3:~ ~

1，作为第二组份的前驱溶液；

e. 将步骤d所得的两种前驱体溶液以3-10ml/min的速率注射到所需模具中，等待30s~

60s，得到固化成胶；

f. 将步骤e所得固化成胶在常温下固化4 8h后将上述凝胶从模具中取出，得到聚L-谷~氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶；所制备的聚L-谷氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶，为聚L-谷氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶，该水凝胶是以儿茶酚基团接枝的氧化海藻酸钠为第一组份，以酰肼化聚L-谷氨酸为第二组份，第一组份与第二组份通过席夫碱反应构建成第一交联网络体系，再通过三价铁离子的络合作用作为第二交联网络体系，形成水凝胶，调整凝胶固含量为3% 7%；凝胶第一组份与第二组份的摩尔比为：0.5 1.5:1；儿茶酚基团接~ ~枝的氧化海藻酸钠的接枝率为：9 21%。

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说明书

聚谷氨酸/海藻酸钠粘附性水凝胶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种聚谷氨酸/海藻酸钠粘附性水凝胶及其制备方法。

背景技术

[0002] 海洋贻贝可通过足丝粘附在诸多有机及无机材料表面，这种特殊的生物粘附系统具有很高的强度、耐水性和自我修复的功能，其主要成分是富含邻苯二酚结构的粘附蛋白。水凝胶是一种可以溶胀的3D材料，近年来在组织工程领域中得到广泛关注。将具有粘附性的儿茶酚残基通过化学合成或改性的方法引入到生物相容性的高分子链上，再利用儿茶酚氧化偶联的方法构建粘附性水凝胶成为一种主流的制备方法，然而，这种制备方法存在明显的缺陷，如高碘酸钠的加入会对周围组织造成毒性，氧化过程中会有副产物生成。氧化交联过程中会损耗部分儿茶酚残基，从而减弱了材料的组织粘附性，限制了儿茶酚改性材料在组织工程中的应用。

[0003] 聚L-谷氨酸(PLGA)是α-氨基酸之间由肽键相连接而成的合成高分子多肽，具有优良的生物相容性和低免疫原性，促进组织修复和细胞生长，无毒副作用，可模拟细胞外基质(ECM)的成分，且其降解产物为谷氨酸单体，可被人体吸收；海藻酸钠(ALG)是从褐藻中提取出的天然线性多糖，具有良好的生物相容性，部分氧化的海藻酸钠的生物降解性能明显改善，使其在组织工程中的应用更加广泛。

[0004] 同现有技术相比，本发明具有如下突出的优点：本发明没有直接使用在人体内不易降解的海藻酸钠，而是采用氧化海藻酸钠，既提供席夫碱反应的醛基位点，又可有效改善海藻酸钠不易降解的缺陷；通过席夫碱反应构建水凝胶，尽量多地保留儿茶酚残基，最大限度地发挥儿茶酚基团的组织粘附性，同时避免了儿茶酚氧化交联所带来的组织毒性，通过控制粘附基团的接枝度进一步控制最终凝胶的粘附性能；以三价铁离子作为第二物理交联点，使得凝胶时间及凝胶强度方面更加可控。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种聚谷氨酸/海藻酸钠粘附性水凝胶.[0006] 本发明的目的之二在于提供该水凝胶的制备方法。

[0007] 本发明方法是先用高碘酸钠氧化海藻酸钠，得到部分氧化的海藻酸钠；然后通过盐酸多巴胺上氨基和海藻酸钠上的酸基之间的碳二亚胺偶联反应，在氧化后的海藻酸钠侧链接枝儿茶酚基团，在此过程中将体系的PH值调至酸性，以防止发生席夫碱反应。用酰肼化的聚L-谷氨酸作为第二组份，两种组分的水溶液作为前躯体溶液，混合后便得到粘附性水凝胶。反应过程如下：

[0008]

[0009] 根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：

[0010] 一种聚谷氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶，其特征在于该水凝胶是以儿茶酚基团接枝的氧化海藻酸钠为第一组份，以酰肼化聚L-谷氨酸为第二组份，第一组份与第二组份通过席夫碱反应构建成水凝胶，调整凝胶固含量为3％～7％；凝胶第一组份与第二组份的摩尔比为：0.5～1.5:1；儿茶酚基团接枝的氧化海藻酸钠的接枝率为：9％～21％。

[0011] 一种制备上述的聚谷氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

[0012] a.将海藻酸钠溶于去离子水中，加热搅拌下至海藻酸钠完全溶解，然后冷却至常温，按海藻酸钠：高碘酸钠＝(5～2):1的摩尔比加入高碘酸钠，在避光条件下反应3～24h，加入乙二醇终止反应，常温下在去离子水中透析后冻干，得到氧化海藻酸钠；

[0013] b.在常温下，将步骤a所得的氧化海藻酸钠配制成质量浓度为1wt％的水溶液，调节pH＝4～5，活化1～3h后，在惰性气氛保护下，再加入盐酸多巴胺溶液，搅拌反应18～24h，在pH为4-6的缓冲溶液中透析2～3天，然后在去离子水中透析，过滤，最后冷冻干燥得到多巴胺改性的氧化海藻酸钠；盐酸多巴胺与氧化海藻酸钠的摩尔比为：1～3：1；

[0014] c.将聚谷氨酸溶于去离子水，然后逐滴滴加3mol/LNaOH溶液，使PLGA完全溶解于去离子水中，加入1～3倍物质的量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和2～4倍己二酸二酰肼在常温下反应18-24小时，再透析3～5天后取出后过滤，将滤液冷冻干燥后得到酰肼化的聚谷氨酸(PLGA-ADH)；

[0015] d.将步骤b所得的多巴胺改性的氧化海藻酸钠溶于去离子水配制成质量浓度3％-7％的溶液，作为第一组份前驱溶液；将步骤c所得的酰肼化的聚谷氨酸配制成质量浓度为
3％-7％的溶液，再滴加三氯化铁水溶液再滴加浓度为0.5～1mol/L的三氯化铁水溶液，使
3+
得n(Fe )：n(儿茶酚基团)为1～3:1，作为第二组份的前驱溶液；

[0016] e.将步骤d所得的两种前驱体溶液以3-10ml/min的速率注射到所需模具中，等待30s～60s，固化成胶；

[0017] f.将步骤e所得固化成胶在常温下固化4～8h后将上述凝胶从模具中取出，得到聚谷氨酸/海藻酸钠组织粘附性水凝胶。

[0018] 本发明首次提出在氧化后的海藻酸钠分子链上接枝多巴胺作为第一组份，酰肼化的聚L-谷氨酸作为第二组份构建生物粘附性水凝胶的方法。该方法通过在水相体系中严格控制体系的pH值、通过抽真空控制氧气含量等，使氧化海藻酸钠与盐酸多巴胺反应，将儿茶酚基团接枝到氧化海藻酸钠侧链，再通过席夫碱反应与酰肼化聚L-谷氨酸构建水凝胶，为了增加凝胶强度加入三价铁离子作为第二物理交联点。所采用的材料均具有良好的生物相容性，避免了通过氧化剂氧化交联带来的各种缺陷，并最大限度地保留粘附性基元，在组织工程领域具有良好的应用前景。

具体实施方式

[0019] 下面结合实施例对本发明进行详细描述。

[0020] 实施例一

[0021] 1、氧化海藻酸钠的制备：称取5.0g海藻酸钠于250mL烧杯中，加入150mL去离子水，磁力搅拌并加热至60℃，待其完全溶解后冷却至常温，加入物质的量为所加海藻酸钠结构单元的量0.2倍的高碘酸钠1.08g。在完全避光条件下反应3h后加650ul乙二醇终止反应，搅拌20min后在2000mL乙醇中沉降，得到棉花状固体，然后再用200mL去离子水溶解所得到的固体，在去离子水中透析3天，冷冻干燥得到氧化度为19.4％的氧化海藻酸钠。

[0022] 2、儿茶酚改性氧化海藻酸钠的制备：称取步骤1所制备的氧化海藻酸钠0.2g于100mL烧杯中，加入40mL去离子水，充分溶解后加入适量的EDC/NHS，将体系的PH值调至4.4左右，再加入盐酸多巴胺0.6g，将反应液转移至三口瓶中，在氮气保护条件下反应24h，反应结束后体系PH应在4.4-5.0之间。将反应液装入透析袋在PH为5.5的缓冲溶液中透析2天，然后在去离子水中透析4h后过滤，去除不溶物及杂质，将滤液冷冻干燥得到儿茶酚改性的氧化海藻酸钠，儿茶酚改性率为14％。

[0023] 3.酰肼化聚L-谷氨酸的制备：称取0.1g聚L-谷氨酸于100mL烧杯中，加入20mL去离子水中，逐滴滴加3mol/L NaOH溶液使得聚L-谷氨酸完全溶解，再加入EDC/NHS，将反应体系PH控制在4-6之间，在常温下反应24h，反应结束后将反应液装入分子量为7000的透析袋中透析3天，冷冻干燥得到酰肼化聚L-谷氨酸针状晶体，酰肼化改性率为34％。

[0024] 4.凝胶前驱体的制备：称取步骤2所制备的儿茶酚改性氧化海藻酸钠40mg，加入400uL去离子水配置成10％的前驱体溶液A；称取步骤3制备的酰肼化聚L-谷氨酸40mg，加入
750uL去离子水，50uL 0.05mol/L的FeCl3溶液配置成5％的含铁离子的酰肼化聚L-谷氨酸前驱体溶液B。

[0025] 5.凝胶的制备：用移液枪量取前驱体溶液A 400uL，前驱体溶液B 400uL，分别装入双针筒注射器的两个针筒中，将前驱体溶液注射到圆形模具中，45s后便得到圆柱形水凝胶样品，其弹性模量为1600-1700Pa，粘结强度测试：软骨切片搭接剪切模量为32KPa。

[0026] 实施例二

[0027] 本实施例与实施例一基本相同，所不同的是：步骤2中盐酸多巴胺的加入量由0.6g减少到0.4g，其他试剂用量及操作条件不变。所得到的儿茶酚改性氧化海藻酸钠改性率为9％，所得凝胶弹性模量为1500Pa-1600Pa，粘结强度测试：软骨切片搭接剪切模量为28KPa。

[0028] 实施例三

[0029] 本实施例与实施例一基本相同，所不同的是：步骤4中的聚L-谷氨酸前驱体溶液配制过程中，未加入FeCl3溶液。仅将40mg ALG-CHO-DP固体加入800uL去离子水配制5％的溶液，其他试剂用量及操作条件不变。所得凝胶的弹性模量为1500Pa，粘结强度测试：软骨切片搭接剪切模量为28KPa。

[0030] 实施例四

[0031] 本实施例与实施例一基本相同，所不同的是：步骤4中的前驱体溶液A和前驱体溶液B浓度均下降到3wt％(其它地方也要更改)，其他试剂用量及操作条件不变。所得凝胶的弹性模量为450Pa。粘结强度测试：软骨切片搭接剪切模量为20KPa。

[0032] 实施例六

[0033] 本实施例与实施例一基本相同，所不同的是：步骤4中的聚L-谷氨酸前驱体溶液配制过程中加入的是浓度较低的0.01mol/L的FeCl3溶液，40mg ALG-CHO-DP固体加入800uL去离子水配制5％的溶液，其他试剂用量及操作条件不变。所得凝胶的弹性模量为1600Pa。粘结强度测试：软骨切片搭接剪切模量为25KPa。

[0034] 实施例七

[0035] 本实施例与实施例一基本相同，所不同的是：步骤4中的前驱体溶液A和前驱体溶液B浓度均升至7％，其他试剂用量及操作条件不变。所得凝胶的弹性模量为4300Pa，粘结强度测试：软骨切片搭接剪切模量为35KPa。