可降解青霉素的贪噬菌、细胞级分及其组合物

摘要

本发明涉及一种可降解青霉素的贪噬菌、细胞级分及其组合物，所述贪噬菌以保藏编号CGMCC No.12495保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的可降解青霉素的贪噬菌、细胞级分及其组合物，可对青霉素废菌丝进行无害化处理，具有绿色环保、节约能源、节省成本的优点。

权利要求

1.一种可降解青霉素的贪噬菌（Variovorax sp.）KDSPL-04 ，其特征在于，该贪噬菌以保藏编号CGMCC No. 12495保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

说明书

可降解青霉素的贪噬菌、细胞级分及其组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种可降解青霉素的贪噬菌、细胞级分及其组合物。

背景技术

[0002] 青霉素(Benzylpenicillin)是一族抗生素的总称，它通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交联桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用，其属于广谱抗感染药物。

[0003] 目前工业上青霉素的生产主要是用淀粉、玉米浆、豆饼粉等为原料，经产黄青霉菌发酵、萃取、纯化而成。该发酵液经固液分离得到青霉素水溶液后，剩余的固体废渣即为废菌丝。青霉素废菌丝主要成分为粗蛋白、纤维素和粗脂肪等，其中也尚有少量青霉素残留，其残留含量约为0.2g/kg-0.5g/kg。由于菌丝中残留青霉素的理化性质稳定，具有长期的残留性、生物蓄积性，其进入生物链后容易引起生物耐药性等各种安全隐患。根据目前国际及国内法律法规，青霉素废菌丝只能按照固体危险废物标准进行处理，这样不但会对环境造成二次污染，同时会造成粮食资源的浪费以及相关企业生产成本的提高。国内每年产生的青霉素菌渣能达到10万吨以上，可见，迫切需要开发一种青霉素废菌丝无害化处理的实用新技术。

[0004] 然而，现有无害化处理青霉素菌丝的方法主要有热蒸法、酸碱降解法，这些方法或者耗能大，或者引发二次污染，且会产生难闻废气。如何利用绿色环保的手段对菌渣中残留青霉素进行适当无害化处理并进行 有效利用，成为相关行业的技术难题。

发明内容

[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一株能选择性降解青霉素的菌株KDSPL-04，从而为开发青霉素废菌丝无害化生物处理技术奠定了基础。KDSPL-04菌株为贪噬菌，该贪噬菌以保藏编号CGMCC No.12495保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0006] 其中，所述贪噬菌在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形、乳黄色、凸起、表面光滑、不透明、边缘整齐；

[0007] 菌体特征为：革兰氏阴性，菌体呈杆状，大小介于0.4-0.5μm×0.9-2.3μm，单个或成对排列。

[0008] 其中，所述贪噬菌的L-吡咯烷基芳胺酶、谷氨酰芳胺酶pNA、γ-谷氨酰转移酶、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、尿素酶、埃尔曼试剂实验呈阳性；脂酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱酸酶、组氨酸同化实验呈阴性；D-甘露醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、古老糖发酵实验呈阴性。

[0009] 其中，所述贪噬菌可以青霉素为唯一碳源生长。

[0010] 其中，所述的贪噬菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。

[0011] 本发明另外提供了一种可降解青霉素的贪噬菌，其通过诱变或遗传转化上述贪噬菌得到。

[0012] 其中，所述的贪噬菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING 所示。

[0013] 本发明同时提供了一种可降解青霉素的细胞级分，包括：从上述贪噬菌的培养物中得到的DNA制备物或细胞壁制备物，从上述贪噬菌中得到的培养液，这些培养液的上清液，该上清液的级分以及上述贪噬菌的细胞分级的培养液。

[0014] 本发明还提供一种组合物，其包含上述贪噬菌和/或上述细胞级分。

[0015] 本发明提供的可降解青霉素的贪噬菌、细胞级分及其组合物，可对青霉素废菌丝进行无害化处理，具有绿色环保、节约能源、节省成本的优点。

具体实施方式

[0016] 为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。

[0017] 本发明提供了一种可降解青霉素的分类命名为贪噬菌(Variovorax sp.)，该贪噬菌以保藏编号CGMCC No.12495于2016年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株编号为KDSPL-04。

[0018] 较优的，所述贪噬菌在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形、乳黄色、凸起、表面光滑、不透明、边缘整齐；

[0019] 菌体特征为：革兰氏阴性，菌体呈杆状，大小介于0.4-0.5μm×0.9-2.3μm，单个或成对排列。

[0020] 较优的，所述贪噬菌的L-吡咯烷基芳胺酶、谷氨酰芳胺酶pNA、γ-谷氨酰转移酶、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、尿素酶、ELLMAN试剂阳性；脂酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱酸酶、组氨酸同化阴性；D-甘露醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、古老糖发酵阴性。

[0021] 较优的，所述贪噬菌可以青霉素为唯一碳源生长。

[0022] 较优的，所述的贪噬菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。

[0023] 本发明提供的可降解青霉素的贪噬菌(Variovorax sp.)，具有高效降解青霉素的能力，能够对发酵工业产生的菌丝体中的青霉素进行有效降解，以消除青霉素废菌丝中的抗生素残留，可用于青霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，为菌丝的无害化处理提供了有效的途径。

[0024] 本发明另外提供了一种可降解青霉素的贪噬菌，其通过诱变或遗传转化上述贪噬菌得到。具体的，本发明通过对上述贪噬菌进行诱变或遗传转化筛选得到另一种降解青霉素的突变贪噬菌，该菌株至少保留了原菌株可降解青霉素的特性，该突变的贪噬菌菌株包括通过原贪噬菌菌株通过插入突变、整合突变得到的突变贪噬菌菌株。

[0025] 较优的，所述的贪噬菌16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。

[0026] 本发明同时提供了一种可降解青霉素的细胞级分，包括：从上述贪噬菌(包括原贪噬菌以及经诱变或遗传转化得到的突变贪噬菌)的培养物中得到的DNA制备物或细胞壁制备物，从上述贪噬菌中得到的培养液，这些培养液的上清液，该上清液的级分以及上述贪噬菌的细胞分级的培养液。

[0027] 本发明还提供一种组合物，其包含上述贪噬菌和/或上述细胞级分。

[0028] 本发明提供的贪噬菌，具体可通过下述方法进行筛选、鉴定，并测定 其对青霉素的降解能力及基因序列：

[0029] 实施例1：贪噬菌菌株的筛选、鉴定、降解能力及序列测定

[0030] 步骤一：从某抗生素企业周边采集污泥10g，接种到含有30mg青霉素的100mL无机盐培养基中，于30℃、160rpm摇床震荡培养。培养开始后每7天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量转接到较高浓度的含青霉素的培养基中，青霉素的含药浓度依次为10mg/L、30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L，依次类推，至900mg/L，得到不同浓度的含有菌体的富集培养液。

[0031] 其中，本发明中的无机盐培养基的组成及配比为(g/L)：K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.025g，FeCl3·6H2O 0.0023g，NH4NO3 0.5g，琼脂
20.0g，用1mol/L HCl或NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌30min。

[0032] 本发明中的某一浓度的富集培养基的组成及配比为(g/L)：K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.025g，FeCl3·6H2O 0.0023，NH4NO3 0.5g，酵母浸膏
0.5g，葡萄糖1g，蛋白胨1g，琼脂20.0g，用1mol/L HCl或NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌30min。

[0033] 步骤二：取0.1mL步骤一中含有细菌的富集培养液涂布到相应含药浓度的选择平板上，30℃下培养72小时。得到一株生长速度最快且菌落周围出现明显透明圈的菌株，将该菌株接种到含有30mg/L青霉素的无机盐培养基上，菌落周围可出现清晰的透明圈，将该菌株编号为KDSPL-04，即为本发明提供的贪噬菌。

[0034] KDSPL-04菌株的主要生物学特性为：该菌株在富集培养基上形成的 菌落特征为：圆形、乳黄色、凸起、表面光滑、不透明、边缘整齐；

[0035] 该菌株的菌体特征为：革兰氏阴性，菌体呈杆状，大小约为0.4-0.5μm×0.9-2.3μm，单个或成对排列。

[0036] 经过试验测定，KDSPL-04菌株的L-吡咯烷基芳胺酶、谷氨酰芳胺酶pNA、γ-谷氨酰转移酶、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、尿素酶、ELLMAN试剂阳性；脂酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱酸酶、组氨酸同化阴性；D-甘露醇、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-麦芽糖、古老糖发酵阴性。

[0037] 步骤三：通过液相色谱法测定在无菌自来水中，该菌株对青霉素的降解能力。

[0038] 培养液中菌体的含量为每毫升培养液中107个，青霉素的浓度为30mg/L，于30℃、160rpm摇床震荡降解6h，经测定，青霉素的降解率为100％。同时，该菌株与发酵菌渣共培养一天，采用液相色谱法测定，该菌株对青霉素的降解率可达到100％。实验证明，降解溶液体系为自来水，KDSPL-04；菌株在pH 7.0-8.0，温度30至40℃生长良好，能以青霉素为唯一碳源生长，是一株很有潜力的降解菌。

[0039] 步骤四：测定KDSPL-02菌株的16S rDNA的序列，将该测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为D88006的16S rDNA的基因序列进行同源性分析。

[0040] 首先，采用DNA小量提取方法提取KDSPL-04菌株的总DNA。其次，采用16S rRNA通用引物27F-1492R扩增其16S rRNA基因序列，将扩增得到的PCR产物直接进行测序(测序结果见序列表中SEQUENCE LISTING)，将获得的16SrRNA基因序列输入GeneBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析。

[0041] 本发明的菌株KDSPL-04的16SrRNA基因序列与贪噬菌属的已有模式菌株具有较高的相似性。其与Variovorax paradoxusLAM12373T的序列相似性为99.42％。该菌株属于Variovorax sp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为Variovorax sp.，即贪噬菌菌株。

[0042] 实施例2：贪噬菌菌株的筛选、鉴定及对青霉素的降解能力测定

[0043] 步骤一：取10g污泥盛于灭菌的250mL锥形瓶中，加入100mL浓度为0.3g/L的青霉素溶液中，于30℃转速为160r/min摇床培养。培养开始后，每7天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量接种到新鲜的青霉素溶液驯化培养基中，并逐步提高青霉素的含量。检测青霉素的降解率，挑选出最好的一组以便分离菌株所用。

[0044] 步骤二：将1mL中上述菌株的菌悬液(1×107个/mL)接入到100mL含30mg/L青霉素的自来水中，取三次平行，并以不接种细菌但含相同浓度的青霉素的自来水为对照。30℃、160rpm摇床培养，分别培养2、4、6小时，液相色谱法检测青霉素的含量，实验结果见表一。降解6小时，所选菌株可将青霉素几乎完全降解。将得到的菌株编号为KDSPL-04。

[0045] 表一KDSPL-04菌株在自来水中对青霉素的降解率

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[0048] 步骤三：测定KDSPL-04菌株的16S rDNA的序列，将测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为D88006的16S rDNA的基因序列进行同源性分析，认为KDSPL-04菌株属于Variovorax sp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为Variovorax sp.，即贪噬菌。

[0049] 实施例3：贪噬菌菌株筛选及对菌渣中青霉素的降解能力测定

[0050] 将青霉素废湿菌丝过0.2mm筛子，称取10g过筛后的废菌丝，并放入100mL自来水中，于30℃左右向废湿菌丝溶液中加入经培养了48小时培养获得的贪噬菌菌体6g(湿重)，设3组平行试验，以加青霉素菌丝但不加贪噬菌体为对照，分别作用0、2、4、6小时取样，高效液相法检测菌丝中青霉素的残留量。结果表明，贪噬菌菌体与青霉素菌丝在30℃条件下，作用6小时后，对青霉素的降解率可达到100％。

[0051] 表二KDSPL-04菌株对菌渣中青霉素的降解效果

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[0053] 本发明的有益效果在于：

[0054] 1、本发明提供的可降解青霉素的贪噬菌，具有高效降解青霉素的 能力，能够对发酵工业产生的菌丝体中的青霉素进行有效降解，以消除青霉素废菌丝中抗生素残留，可用于青霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，为菌丝的无害化处理提供了有效的途径。

[0055] 2、本发明提供的可降解青霉素的贪噬菌，其可以利用青霉素为唯一碳源生长，该菌株对1g/L青霉素的降解能力在6小时以内可达到100％。该菌株可用于青霉素工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法高效、绿色环保、节约资源、处理成本低，彻底消除了青霉素废菌丝对环境的不利影响。

[0056] 3、本发明的贪噬菌与降解相关的基因及关键酶在生物修复和净化及工业和生物医药领域具有广泛的应用。

[0057] 虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。