一种青霉素结合蛋白及其应用

摘要

本发明提供了一种新的青霉素结合蛋白Bt‑PBP3及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。本发明蛋白可以用于制备青霉素检测试剂，用于青霉素的检测，其不需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程简单，并且对分析人员的技术水平要求很低，适于现场快速检测。

权利要求

1.一种青霉素结合蛋白在检测青霉素残留中的应用，其特征在于，所述青霉素结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种检测青霉素残留的方法，其是用如SEQ ID No.2所示的青霉素结合蛋白与样品中的青霉素结合，并检测结合的结果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述蛋白与标准品中的青霉素结合，建立标准曲线，根据标准曲线确定样品中青霉素的含量。

说明书

一种青霉素结合蛋白及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种青霉素结合蛋白及其应用。

背景技术

[0002] 随着我国人民生活水平提高，人们对食品安全越来越关注，食品中抗生素残留的问题已经引起人们的广泛关注。β-内酰胺类抗生素指其分子结构中含有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯和青霉烯类酶抑制剂等，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。它是现有的抗生素中使用最广泛的一类。长期摄入β-内酰胺类抗生素残留的食品将严重危害人们身体健康，抗生素残留能破坏胃肠道菌群平衡，导致长期的腹泻、维生素缺乏及影响其他药物的疗效；摄入β-内酰胺类抗生素残留的食品会引起部分人群的过敏反应轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等，严重时可出现喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命；长期摄入抗生素残留的食品会增强体内细菌的耐药性，当人体发生疾病时，可增加治疗难度甚至导致治疗失败。为了避免消费者受到食品中抗生素残留的危害，保护人民的身体健康，世界各国都对食品中各种β-内酰胺类抗生素制定了严格的规定。2006年6月欧盟已经全面禁止使用各种饲用抗生素。美国FDA、兽药管理中心和国家抗微生物耐药性监控委员会制定了一套复杂的法规框架，来管理和限制食品中各类抗生素的使用。我国农业部2001年20号文件《关于发布＜饲料药物添加剂使用规范＞的通知》中对饲料添加剂、兽药品种、剂量以及使用方法、药物残留等方面进行了规范。随着人们对食品安全和健康问题的重视，国家对食品中β-内酰胺类抗生素残留的检测也越来越严格，β-内酰胺类抗生素检测技术的市场空间将会越来越大。

[0003] 传统的抗生素残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于食品企业中快速检测β-内酰胺类抗生素残留。

发明内容

[0004] 本发明的第一个目的在于提供一种青霉素结合蛋白。

[0005] 本发明的第二个目的在于提供编码所述青霉素结合蛋白的基因。

[0006] 本发明的第三个目的在于提供所述蛋白在检测青霉素中的应用。

[0007] 本发明从苏云金芽孢杆菌中得到了一个新型与青霉素有高亲和力的蛋白质Bt-PBP3，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，序列全长415个氨基酸，表观分子量为45.5Kda，等电点约为8.64，该蛋白质是一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，该酶中活性丝氨酸可以亲核攻击细胞壁肽聚糖五肽链倒数第二个丙氨酸，参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，并在合成过程中发挥转羧肽酶活性。

[0008] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Bt-PBP3的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第5位的Asp替换为Ala，将第361位的Asp替换为Gly或Ala，将第410位的Thr替换为His，将第1～5位氨基酸缺失，将第1位Met增加6个His组氨酸纯化标签或增加GST标签。因此，本发明的Bt-PBP3蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt-PBP3同等活性的由Bt-PBP3衍生得到的蛋白质。

[0009] 进一步本发明提供编码上述青霉素结合蛋白Bt-PBP3的基因。

[0010] 优选地，所述核苷酸序列为：(1)序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或(2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，编码Bt-PBP3的核苷酸序列。

[0011] 此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

[0012] 本发明的基因和蛋白质可以从苏云金芽孢杆菌中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

[0013] 可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过本领域所熟知的转基因方法转入到其他菌种中，使其具有表达所述蛋白的能力。

[0014] 在本发明的一个实施例中，将PCR扩增得到的Bt-pbp基因插入到表达载体pET28a(+)上构建得到重组表达载体pET28a(+)-pbp3，并最终转化大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)，使其能诱导表达获得Bt-PBP3蛋白。

[0015] 进一步，本发明提供一种用于检测食品中青霉素残留的检测试剂，其包括所述的Bt-PBP3蛋白。所述的食品可以是固态、半固态、液态等。固态食品可以通过研磨、粉碎等方式处理后溶于溶剂，使青霉素得以释放，并进行检测。半固态食品可以加入溶剂使青霉素得以释放，并进行检测。液态食品可以是饮料、牛奶等，通常可以直接进行检测。

[0016] 本发明提供的Bt-PBP3蛋白具有β-内酰胺环类抗生素特异性接合的能力，可用于食品中β-内酰胺环类抗生素残留的检测，其不需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程简单，并且对分析人员的技术水平要求很低，适于现场快速检测。

附图说明

[0017] 图1是PCR扩增Bt-pbp3基因的凝胶电泳图，其中M是DNAMaker，1、2为以苏云金芽孢杆菌BMB171为模板PCR扩增得到的Bt-pbp3基因。

[0018] 图2是重组质粒pET28a(+)-pbp3图谱。

[0019] 图3是pET28a(+)-pbp3的验证，M为DNAMaker，1、2为pET28a载体经EcoRV,XhoI酶切结果，片段大小分别为3958bp,1415bp；3、4为pET28a(+)-pbp3，经EcoRV,XhoI酶切结果，片段大小分别为3958bp,2587bp

[0020] 图4是Bt-PBP3蛋白质的纯化结果，其中，M是蛋白分子量标准，1是诱导上清，2、3是纯化蛋白。

[0021] 图5是Bt-PBP3测定青霉素含量标准曲线。

具体实施方式

[0022] 实施例1Bt-PBP3蛋白的制备

[0023] 1、苏云金芽孢杆菌总DNA提取

[0024] (1)将苏云金芽孢杆菌菌株BMB171接种于5ml PA瓶中28℃过夜活化，次日按1％接种量转接至50ml液体培养基中LB培养基中，28℃，200r/min培养至对数生长期，离心收集菌体，STE洗一次。

[0025] (2)加5.75ml Solution I(25mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM葡萄糖)和250μL溶菌酶(200mg/mL)冰浴过夜，

[0026] (3)加3ml 10％SDS于50-60℃水浴30min；随后加入3.6ml5MNaCl，冰上10min后直接加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)去除蛋白质；12000r/min，离心15min后取上清，加2倍体积无水乙醇沉淀。70％乙醇洗涤一次。

[0027] (4)干燥沉淀，用200μL ddH2O或TE溶30min。并用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的浓度和质量。

[0028] 2、引物设计与合成

[0029] 根据苏云金芽孢杆菌BMB171中预测的基因序列，设计上下游引物，并在上游引物引入酶切位点及其保护碱基，下游引物引入酶切位点及其保护碱基，引物由北京奥科生物科技有限公司合成。

[0030] 上游引物 (下划线为NdeI酶切位点，灰色背景为保护碱基)

[0031] 下游引物 (下划线为XhoI酶切位点，灰色背景为保护碱基)

[0032] 3、PCR扩增Bt-pbp3基因，具体反应体系如下：

[0033] DNA模板，0.5μL

[0034] 上游引物，1μL

[0035] 下游引物，1μL

[0036] 10倍Buffer，2.5μL

[0037] dNTP混合物(2.5mmol/L)，2μL

[0038] pfu Tap酶，1μL

[0039] ddH2O，17μL

[0040] 反应条件如下：95℃预变性5min；95℃0.5min，55℃0.5min，72℃1.3min，30个循环；72℃延伸10min，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段(图1)。

[0041] 4、Bt-PBP3蛋白表达菌株的构建

[0042] 回收的PCR产物37℃NdeI和XhoI双酶切4小时，载体pET28a(+)也经过NdeI和XhoI双酶切4小时，T4连接酶将外源基因与pET28a(+)连接成pET28a(+)-pbp3重组载体(图2)，转入E.coli DH5ɑ菌株；提取含有Bt-pbp3基因的重组载体pET28a(+)-pbp3转化大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)。

[0043] 5、Bt-PBP3蛋白的诱导

[0044] 将含有重组质粒pET28a(+)-pbp3的E.coli BL21(DE3)在平板上挑取单菌落，接种含有卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃过夜活化培养，约14小时后，将菌液按1/100比例加入新鲜的卡拉霉素LB液体培养基，200r/min培养至OD600＝0.8～1.0，加入IPTG诱导(IPTG终浓度为0.1mM)200r/min，16℃培养12小时，将培养瓶置于冰上5分钟；4℃，12000r/min离心收集菌体，预冷的ddH2O重悬菌体沉淀，再次离心收集菌体，备用。

[0045] 6、Bt-PBP3蛋白的纯化

[0046] 用4℃的Soluble Binding Buffer(10mM咪唑，NaCl 0.5M，20mM Tris-HCl，pH＝7.9)重悬菌体，置于冰上超声波破碎至悬液变澄清；4℃，12000r/min离心60分钟，收集上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后缓缓加入到Ni琼脂糖凝胶柱中，随后使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗脱杂蛋；然后用Elution Buffer(500mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH＝7.9)洗脱柱子，收集洗脱液。随后5KDa截流管去除咪唑，PBS重新溶解，得到纯化蛋白质Bt-PBP3，SDS-PAGE鉴定提取蛋白为单一条带无明显杂蛋白(图4)。经鉴定为本发明Bt-PBP3。

[0047] 实施例2Bt-PBP3蛋白与青霉素接合能力测定

[0048] 1、青霉素G标准样品的制备

[0049] 青霉素溶于PBS缓冲溶液配置成浓度为1μg/m L的标准使用溶液，向已知无抗复原乳中加入此溶液调配含青霉素浓度一定的标准样品。随后，标准样品置于摇床15min充分混匀。

[0050] 2、Bt-PBP3包被酶标板

[0051] 向酶标板微孔中加入100μL青霉素结合蛋白Bt-PBP3溶液(4μg/mL)，4℃放置过夜，以使Bt-PBP3蛋白固定于微孔表面。倾去孔内液体，每孔加入PBS缓冲溶液(1.47g/LNa2HPO4，0.43g/L KH2PO4和6.79g/L NaCl；pH7.2)300μL，洗涤3遍，滤纸上拍干。

[0052] 3、酶标板的封闭

[0053] 每空加入150μL 2％BSA封闭液，37℃孵育3小时，使用PBS缓冲溶液洗涤3次后，滤纸上拍干。

[0054] 4、加入标准溶液样品

[0055] 将青霉素G溶于PBS缓冲溶液中配制成质量梯度为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0μg/L的标准溶液。每孔中加入50μL不同梯度的标准溶液，再加入50μL辣根过氧化物酶标记的青霉素(HRP-Amp)，37℃孵育30min，倾去孔内液体，用PBST溶液洗涤4次后，滤纸上拍干。

[0056] 5、加入酶解底物显色

[0057] 加入100μL新配置的四甲基联苯胺溶液(TMB)，避光37℃孵育10min。立即向每孔中加入50μL 2M H2SO4终止液，蓝色变黄色。

[0058] 6、测定吸光值

[0059] 使用酶标仪10min内测测定微孔在450nm处的吸光A450。反应过程中，青霉素和HRP-Amp竞争性结合Bt-PBP3，若样品中含有青霉素G越多，HRP-Amp结合在受体上的量越少，最终导致酶解液的吸光度变小，即样品中的青霉素浓度与微孔中酶解液的吸光度值成反比。

[0060] 7、标准曲线建立

[0061] 以标准样品浓度为横坐标，标准样品的％吸光度值为纵坐标，用Origin 8软件，绘制标准曲线。当青霉素浓度在0.5到64ng/mL的时候，吸光度与青霉素浓度有线性关系A450＝-0.2024ln(CAmp)+0.9606，R2＝0.9969计算得出其IC50＝4.842ng/mL。根据检出限的定义LOD＝3δcef/D(其中δcef为空白的相对标准偏差，D为线性方程的斜率)计算，本方法测定青霉素残留的检出限为1.49μg/kg(图4)。

[0062] 实施例3应用Bt-PBP3蛋白测定食品中青霉素G残留

[0063] 1、检测样品的前处理

[0064] 检测样品为牛奶：脱脂奶样本直接上样检测，纯牛奶样本5000转/分，离心5分钟，脱脂后直接检测。

[0065] 检测样品为肉类，鱼，虾及蛋类：称取10g样品，加入20mL10％乙腈水溶液(体积比)，剧烈混匀15分钟，8000rpm，离心5分钟，取上清，氮气吹干，用1mL去离子水溶解，用于检测。

[0066] 检测样品为蜂蜜：称取10g样品，加入20mL去离子水溶解，过Oasis固相萃取柱富集青霉素，用5mL去离子水洗柱，负压下抽干，再用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液氮气吹干，用1mL去离子水溶解，用于检测。

[0067] 2、牛奶中青霉素残留含量的测定

[0068] 按照实施例2方法依次配置不同浓度的青霉素G标准脱脂牛奶样品，酶标仪测定微孔在450nm处的吸光度A450，以标准样品浓度为横坐标，标准样品的％吸光度值为纵坐标，用Origin 8软件，绘制标准曲线。取不同浓度下牛奶样品，使用酶标仪测定微孔在450nm处的吸光A450。重复3次，每次6个平行，带入标准曲线公式计算出牛奶中青霉素的含量。

[0069] 3、准确性(添加回收率)的测定

[0070] 在不含有青霉素G的脱脂牛奶中添加一定量的青霉素G，添加终浓度为2.5、5、10、20ng/mL，然后用实施例2方法检测样品中青霉素G的含量，每个样品做6个平行样(n＝6)。测定结果表明，此方法具有很好的精密度及回收率，牛奶中添加浓度为2.5ng/mL时，回收率平均达到88.9％±13.1％；添加浓度为5ng/mL时，回收率平均达到90.8％±8.4％；添加浓度为10ng/mL时，回收率平均达到94.0％±7.2％；在添加浓度为0ng/m L中，没有出现假阳性，也没有假阴性(表1)。

[0071] 表1：准确性(添加回收率)的测定

[0072]