一种同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法

摘要

本发明提供了一种同时测定酶促反应液中DL‑ATC、L‑半胱氨酸和L‑胱氨酸含量的方法，该方法包括先调节所述酶促反应液的pH值，再用HPLC法对酶促反应液中DL‑ATC、L‑半胱氨酸和L‑胱氨酸进行分离并且同时测定。本发明的方法中，通过调节酶促反应液的pH值范围，实现了酶促反应液中DL‑ATC、L‑半胱氨酸和L‑胱氨酸的浓度在一定时间内保持稳定，再通过高效液相色谱法，能实现酶促反应液中DL‑ATC、L‑半胱氨酸和L‑胱氨酸含量的快速同时测定。

权利要求

1.一种同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括先调节所述酶促反应液的pH值范围为0.5-5.0，再用HPLC法对酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸进行分离并且同时测定；其中，在进行HPLC法检测时使用的色谱柱为正相硅胶键合二醇色谱柱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行HPLC法检测时，检测条件为：水相溶液pH为1.0～5.0，水相-有机相体积比为15:85～30:70，检测波长为190-300nm，柱温为20～

40℃，进样量为5～20μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测波长为200nm。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，在调节所述酶促反应液的pH值时所用的酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸或甲酸中的一种或多种。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述酶促反应液为碱性酶促反应液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱性酶促反应液的pH值范围为7.5-

9.5。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱性酶促反应液的pH值范围为7.5-

9.5，且所述碱性酶促反应液为DL-ATC在酶催化下转化为L-半胱氨酸的反应溶液。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，调节所述酶促反应液的pH为

0.5、1.0、2.0、3.0、4.0或5.0。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述的方法具体包括如下步骤:(1)混合对照溶液的配制：

L-半胱氨酸对照贮备溶液：称取L-半胱氨酸对照品，加入磷酸二氢铵溶液溶解,得到L-半胱氨酸对照贮备溶液；

DL-ATC与L-胱氨酸混合对照贮备溶液：称取DL-ATC和L-胱氨酸对照品各适量，混合后，加入磷酸二氢铵溶液溶解，得到DL-ATC与L-胱氨酸混合对照贮备溶液；

混合对照溶液：临用前分别取L-半胱氨酸对照贮备溶液、DL-ATC和L-胱氨酸混合对照贮备溶液，混合后，加入磷酸二氢铵溶液溶解并稀释得到混合对照溶液；

(2)供试品溶液配制：

取酶法生产L-半胱氨酸酶促反应液，立即加入盐酸调节溶液pH，取上述溶液适量，加入磷酸二氢铵溶液溶解并稀释至上述混合对照溶液的浓度，过滤，取滤液作为供试品溶液；

(3)检测

分别量取混合对照溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，分别进行检测，其检测条件为在进行HPLC法检测时；检测条件为：水相溶液pH为1.0～5.0，水相-有机相体积比为

15:85～30:70，检测波长为200nm，柱温为20～40℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，过滤时采用0.45μm的水系过滤膜过滤，续取滤液，作为供试品溶液。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在进行混合对照溶液的配制时，磷酸二氢铵溶液溶解并稀释成分别含有DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸浓度为0.2～0.5、0.1～0.5、0.1～0.5mg/ml的混合对照溶液。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括在线性范围内，采用外标法计算DL-ATC、L-半胱氨酸、L-胱氨酸含量。

说明书

一种同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸

含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种HPLC法同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的高效液相色谱法，属于生物分析领域。

背景技术

[0002] L-半胱氨酸是一种重要含硫氨基酸，也是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一含有巯基的α-氨基酸。L-半胱氨酸具有许多重要的生理作用，目前已经广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品以及饲料工业等多个领域。

[0003] L-半胱氨酸的市场需求量很大，目前其主要的生产方式为毛发水解法，虽然工艺相对简单，但是能耗较大，环境污染严重。近年来酶转化法由于其具有立体选择性好、可获得单一构型产物、产物纯度高、反应条件温和和对环境友好等优点而日益受到重视，已经逐渐成为研究热点之一。

[0004] 酶转化法生产L-半胱氨酸的方法目前主要有三种工艺路线，其中之一就是以DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为起始原料，通过酶促反应生产L-半胱氨酸。日本学者Sano等在1977年首次发明这种方法，他们在土壤中筛选了一些假单胞菌，以添加甘油和DL-ATC为底物成功合成L-半胱氨酸。1990年韩国学者Ryu等也完成了由DL-ATC向L-半胱氨酸酶法转化的最佳培养条件和酶促反应条件研究。在这些研究中酶促反应的条件大多是在碱性条件下进行的，而L-半胱氨酸在酸性条件相对稳定，在中性及碱性溶液中极易被空气氧化成为L-胱氨酸。而酶促反应生产L-半胱氨酸的反应液中，DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸等三者同时存在，在酶的催化作用下，DL-ATC转化为L-半胱氨酸，与此同时在碱性条件下L-半胱氨酸又被空气氧化而生成L-胱氨酸，这种动态的变化为三者含量的准确定量带来了极大的困难。

[0005] 目前L-半胱氨酸传统的测定方法有分光光度法、纸层析法、电化学测定法等，但是由于酶促反应液的成分较为复杂，难以排除杂质干扰，因此上述方法很难应用于酶促反应液中L-半胱氨酸的检测。在碱性的酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量极不稳定，普通的方法很难满足三者的同时准确定量检测的要求，因此开发一种简便的方法用于稳定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量，同时快速和准确地实现三者含量的同时测定具有十分重要的现实意义。

[0006] 经文献检索，目前HPLC法同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法目前并未见报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种同时测定酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的方法，其特征在于，包括先调节所述酶促反应液的pH值，再用HPLC法对酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸进行分离并且同时测定。

[0010] 本发明中，在进行HPLC法检测时使用的色谱柱为正相硅胶键合二醇色谱柱。

[0011] 本发明中，在进行HPLC法检测时，检测条件为：水相溶液pH为1.0～5.0，水相-有机相体积比为15:85～30:70，检测波长为190-300nm，柱温为20～40℃，进样量为5～20μL；优选所述检测波长为200nm。

[0012] 本发明中，在调节所述酶促反应液的pH值时所用的酸为盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸或甲酸中的一种或多种。

[0013] 本发明所述酶促反应液为碱性酶促反应液；优选所述碱性酶促反应液的pH值范围为7.5-9.5；更优选所述碱性酶促反应液的pH值范围为7.5-9.5，且所述碱性酶促反应液为DL-ATC在酶催化下转化为L-半胱氨酸的反应溶液。

[0014] 本发明中调节所述酶促反应液的pH值范围为0.5～5.0；优选调节所述酶促反应液的pH为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0或5.0。

[0015] 本发明所述的方法具体包括如下步骤:

[0016] (1)混合对照溶液的配制：

[0017] L-半胱氨酸对照贮备溶液：称取L-半胱氨酸对照品，加入磷酸二氢铵溶液溶解,得到L-半胱氨酸对照贮备溶液；

[0018] DL-ATC与L-胱氨酸混合对照贮备溶液：称取DL-ATC和L-胱氨酸对照品各适量，混合后，加入磷酸二氢铵溶液溶解，得到DL-ATC与L-胱氨酸混合对照贮备溶液；

[0019] 混合对照溶液：临用前分别取L-半胱氨酸对照贮备溶液、DL-ATC和L-胱氨酸混合对照贮备溶液，混合后，加入磷酸二氢铵溶液溶解并稀释得到混合对照溶液；

[0020] (2)供试品溶液配制：

[0021] 取酶法生产L-半胱氨酸酶促反应液，立即加入盐酸调节溶液pH，取上述溶液适量，加入磷酸二氢铵溶液溶解并稀释至上述混合对照溶液的浓度，过滤，取滤液作为供试品溶液；

[0022] (3)检测：

[0023] 分别量取混合对照溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，分别进行检测，其检测条件为在进行HPLC法检测时；检测条件为：水相溶液pH为1.0～5.0，水相-有机相体积为15:85～30:70，检测波长为200nm，柱温为20～40℃。

[0024] 本发明的步骤(2)中，过滤时采用0.45μm的水系过滤膜过滤，续取滤液，作为供试品溶液。

[0025] 本发明的步骤(1)中，在进行混合对照溶液的配制时，磷酸二氢铵溶液溶解并稀释成分别含有DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸浓度为0.2～0.5、0.1～0.5、0.1～0.5mg/mL的混合对照溶液。

[0026] 本发明的方法还包括在线性范围内，采用外标法计算DL-ATC、L-半胱氨酸、L-胱氨酸含量。

[0027] 本发明的方法中，通过调节酶促反应液的pH值范围，实现了酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的浓度在一定时间内保持稳定，再通过高效液相色谱法，能实现酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的快速同时测定。

[0028] 本发明中所研究的酶促反应液为碱性酶促反应液。DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸三者均同时存在于碱性酶促反应液中，在pH＝8.0的酶促反应条件下DL-ATC会在酶的催化作用下转化为L-半胱氨酸，L-半胱氨酸在碱性条件下容易氧化为L-胱氨酸。因此，要实现DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸三者含量的准确测定首先必须保持溶液中三种物质的浓度在一定时间内稳定。通过若干次实验的研究，我们发现通过调节酶促反应溶液的pH值，可以有效降低酶促反应的速度。我们对pH＝0.5-5.0条件下，酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的稳定性进行了研究，实验数据表明在一定时间内，DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸稳定性良好。本发明的发明人通过大量实验出乎意料地发现，在pH为0.5-5.0的条件下，包括pH为0.5-5.0、0.5-4.0、0.5-3.0、0.5-2.0、0.5-1.0、0.5-0.8、0.8-5.0、0.8-4.0、0.8-3.0、0.8-2.0、0.8-1.2、0.8-1.0、1.0-5.0、1.0-4.0、1.0-3.0、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-
1.2、1.5-5.0、1.5-4.0、1.5-3.0、1.5-2.0、1.0-1.5、2.0-5.0、2.0-4.0、2.0-3.0、2.0-2.5、
2.5-5.0、2.5-4.0、2.5-3.0、3.0-5.0、3.0-4.0、3.0-3.5、3.5-5.0、3.5-4.0、4.0-5.0、4.0-
4.5、4.5-5.0的条件下，DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸稳定性良好。优选地，在pH为0.5、
1.0、2.0、3.0、4.0、5.0的条件下，DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸稳定性尤其良好。此外，由于本领域常规的色谱柱难以满足三种物质的同时检测要求，通过大量试验，我们发现正相硅胶键合二醇色谱柱能对DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸这三种物质进行有效分离并进行测定。

[0029] 本发明所述的方法简单、快速，准确度高，重现性好，能应用于酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸含量的同时检测，为酶法生产L-半胱氨酸中间过程质量控制提供依据。

附图说明

[0030] 图1DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸混合对照HPLC图谱

[0031] 图2酶促反应液中DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的同时测定的HPLC图谱[0032] 图3 L-半胱氨酸线性图

[0033] 图4 DL-ATC线性图

[0034] 图5 L-胱氨酸线性图

具体实施方式

[0035] 实施例1

[0036] 本实施例涉及混合对照溶液的检测

[0037] 一、仪器设备及检测条件：

[0038] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0039] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0040] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)(80:20)

[0041] 检测波长：200nm

[0042] 流速：1.5mL/min

[0043] 柱温：35℃

[0044] 进样量：20μL

[0045] 二、具体步骤：

[0046] L-半胱氨酸对照贮备溶液：精密称取L-半胱氨酸对照品50mg至10mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解，定容，摇匀，得到5.0mg/mL的L-半胱氨酸对照贮备溶液。

[0047] DL-ATC和L-胱氨酸混合对照贮备溶液:分别精密称取DL-ATC和L-胱氨酸对照品各50mg置于100mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解并定容，得到0.25mg/mL的DL-ATC和L-胱氨酸混合对照贮备溶液。

[0048] 混合对照溶液：临用前分别取1ml 5.0mg/mL的L-半胱氨酸对照贮备溶液和2mL0.25mg/mL的DL-ATC和L-胱氨酸混合对照贮备溶液至10mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解并稀释至刻度线，定容，作为混合对照品溶液。

[0049] 取混合对照溶液20μL，立即注入液相色谱仪中，记录色谱图。

[0050] 结果见附图1，图中1号峰为L-半胱氨酸峰，2号峰为DL-ATC峰，3号峰为L-胱氨酸峰。

[0051] 实施例2

[0052] 本实施例涉及供试品溶液的检测

[0053] 一、仪器设备及检测条件：

[0054] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0055] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0056] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)(80:20)

[0057] 检测波长：200nm

[0058] 流速：1.5mL/min

[0059] 柱温：35℃

[0060] 进样量：20μL

[0061] 二、具体步骤：

[0062] 取酶法生产L-半胱氨酸酶促反应液，立即加入盐酸调节溶液pH为2.0，取上述溶液1mL至10mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解并定容，取上述溶液用0.45μm的水系过滤膜过滤，续取滤液，作为供试品溶液。取供试品溶液20μL，立即注入液相色谱仪中，记录色谱图。

[0063] 结果见附图2，图中1号峰为L-半胱氨酸峰，2号峰为DL-ATC峰，3号峰为L-胱氨酸峰。

[0064] 实施例3

[0065] 本实施例涉及酶促反应液在不同pH值时的稳定性检测

[0066] 一、检测设备和条件

[0067] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0068] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0069] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)(80:20)

[0070] 检测波长：200nm

[0071] 流速：1.5mL/min

[0072] 柱温：35℃

[0073] 进样量：20μL

[0074] 取酶法生产L-半胱氨酸酶促反应液50mL，立即加入盐酸调节溶液pH，分别调溶液pH为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，室温放置，分别于0、4、8h取上述溶液1mL至10mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解并定容，取上述溶液用0.45μm的水系过滤膜过滤，续取滤液，作为供试品溶液。取供试品溶液20μL，立即注入液相色谱仪中，记录色谱图，按照外标法计算不同时间DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量。

[0075] 不同pH稳定性实验结果见表1。由表1可以看出，酶促反应液在pH为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0时稳定性尤其良好。

[0076] 表1不同pH稳定性实验数据

[0077]

[0078]

[0079] 实施例4

[0080] 一、检测设备和条件

[0081] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0082] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0083] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)(80:20)

[0084] 检测波长：200nm

[0085] 流速：1.5mL/min

[0086] 柱温：35℃

[0087] 进样量：20μl

[0088] 二、具体步骤：精密称取L-半胱氨酸对照品50mg至10mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解，定容，摇匀，得到5.0mg/mL的L-半胱氨酸对照贮备溶液。分别取贮备液加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)稀释至0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.002、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0mg/mL的溶液，精密量取20μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积对浓度作图。

[0089] 结果见附图3，L-半胱氨酸浓度在0.0005～5.0mg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

[0090] 实施例5

[0091] 一、检测设备和条件

[0092] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0093] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0094] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)(80:20)

[0095] 检测波长：200nm

[0096] 流速：1.5mL/min

[0097] 柱温：35℃

[0098] 进样量：20μL

[0099] 二、具体步骤：

[0100] 精密称取DL-ATC对照品50mg至100mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶，定容，摇匀，得到0.5mg/mL的对照贮备溶液。分别取贮备液适量加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)稀释至0.001、0.002、0.004、0.005、0.0075、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、
0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的溶液，精密量取20μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积对浓度作图。

[0101] 结果见附图4，DL-ATC浓度在0.001～0.5mg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

[0102] 实施例6

[0103] 一、实验设备和检测条件

[0104] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0105] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0106] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)(80:20)

[0107] 检测波长：200nm

[0108] 流速：1.5mL/min

[0109] 柱温：35℃；进样量：20μL

[0110] 精密称取L-胱氨酸对照品50mg至100mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液pH＝3.0)溶解，定容，摇匀，得到0.5mg/mL的对照贮备溶液。分别取贮备液适量加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)稀释至0.001、0.002、0.004、0.005、0.0075、0.01、0.02、0.03、0.04、
0.05、0.10、0.20、0.30、0.40mg/mL的溶液，精密量取20μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积对浓度作图。

[0111] 结果见附图5，L-胱氨酸浓度在0.001～0.4mg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

[0112] 对比例1

[0113] 本对比例涉及酶促反应液在pH值低于0.5时稳定性检测

[0114] 一、检测设备和条件

[0115] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0116] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0117] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(调节pH＝3.0)(80:20)

[0118] 检测波长：200nm

[0119] 流速：1.5mL/min

[0120] 柱温：35℃；进样量：20μL

[0121] 取酶法生产L-半胱氨酸酶促反应液50mL，立即加入盐酸调节溶液pH，分别调溶液pH为0.1、0.3，室温放置，分别于0、4、8h取上述溶液1mL至10ml量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解并定容，取上述溶液用0.45μm的水系过滤膜过滤，续取滤液，作为供试品溶液。取供试品溶液20μl，立即注入液相色谱仪中，记录色谱图，按照外标法计算不同时间DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量。

[0122] 酶促反应液pH低于0.5时稳定性实验结果见表2。由表2可以看出，酶促反应液在pH为0.1、0.3时稳定性不好。

[0123] 表2pH低于0.5时不同pH稳定性实验数据

[0124]

[0125] 对比例2

[0126] 本对比例涉及酶促反应液在pH值高于5.0时稳定性检测

[0127] 一、检测设备和条件

[0128] 仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪

[0129] 色谱柱：正相硅胶键合二醇色谱柱

[0130] 流动相：乙腈-0.01M磷酸二氢铵溶液(调节pH＝3.0)(80:20)

[0131] 检测波长：200nm

[0132] 流速：1.5mL/min

[0133] 柱温：35℃

[0134] 进样量：20μL

[0135] 取酶法生产L-半胱氨酸酶促反应液50mL，立即加入盐酸调节溶液pH，分别调溶液pH为5.5、6.0、6.5，室温放置，分别于0、4、8h取上述溶液1mL至10mL量瓶中，加入0.01M磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)溶解并定容，取上述溶液用0.45μm的水系过滤膜过滤，续取滤液，作为供试品溶液。取供试品溶液20μL，立即注入液相色谱仪中，记录色谱图，按照外标法计算不同时间DL-ATC、L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量。

[0136] 酶促反应液pH高于5.0时稳定性实验结果见表3。由表3可以看出，酶促反应液在pH为5.5、6.0、6.5时稳定性不好。

[0137] 表3pH高于5.0时不同pH稳定性实验数据

[0138]

[0139] 以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。