一种生防菌挥发性代谢物的检测方法

摘要

本发明公开了一种生防菌AR30挥发性代谢物的检测方法，包括：(1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；(2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；(3)用配置多模式进样口的气相色谱‑质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。该方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发物的收集、鉴定及定量检测问题，掌握细菌胞外挥发性代谢物分子时空动态信息，为研究生防菌的抗菌机理、作用方式及其在生物防治领域中的应用提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。

权利要求

1.β-倍半水芹烯在防治烟草真菌、细菌病害中的应用，其中，所述烟草真菌、细菌病害为烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌和炭疽病菌。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，β-倍半水芹烯是生防菌短小芽孢杆菌AR03的一种挥发性代谢产物，所述检测方法包括：(1)生防菌培养：取培养基倾倒于无菌顶空瓶中冷却凝固，取生防菌发酵液涂布于培养基表面，加盖密封；同时设置空白对照组，所述空白对照组不添加生防菌发酵液；

(2)空白样品挥发物收集：将步骤(1)中获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样；采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于顶空瓶的上部空间；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

(3)细菌挥发物收集：将步骤(1)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样，采样前首先向顶空瓶侧壁注入1-十五烯内标溶液，注意尽量避免接触培养基基质，然后将SPME针管刺入顶空瓶，将萃取头置于顶空瓶上部空间，采集细菌挥发性代谢物，收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

(4)吸附正构烷烃C10-C20萃取头制作：将正构烷烃C10-C20溶液于顶空瓶中，在室温中静置一定时间后，进行采样；将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于样品的上部空间，采集气态正构烷烃；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

(5)挥发物定性分析：将步骤(2)、(3)获得含挥发物的探针以及步骤(4)吸附正构烷烃C10-C20的探针，在全扫描模式下进行分析，得到空白基质挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃C10-C20的总离子流图；

(6)细菌挥发性代谢物鉴定：将步骤(5)获得细菌挥发物总离子流图，扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰，即为挥发性代谢物特征指纹峰，经NIST和WILIY谱库对总离子图中化合物进行定性识别，对于识别的每种代谢物，根据其相邻正构烷烃的保留时间和碳原子数，计算该代谢物的保留指数，然后查阅NIST Chemistry WebBook中报道的该组分在相同色谱柱中的保留指数进行验证；

(7)细菌挥发代谢物定量分析：将步骤(2)、(3)和(4)中获得含挥发性有机物的探针，进GC-MS分析，根据步骤(6)获得的挥发性代谢物的鉴定结果，以1-十五烯溶液作为内标参照，采用内标法计算各色谱峰对应代谢物的相对含量；

所述GC-MS所采用的条件为：色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×

0.25μm；进样口：大体积进样口，冷不分流模式，初始温度40℃，以100℃/min速率升至250℃，解吸时间4min；载气为99.999％氦气，流速为1.0mL/min；柱温箱：初始温度40℃，保持

2min，以5℃/min速率升至180℃，保持10min，以10℃速率升至280℃，保持15min，总运行时间为55min；EI离子源；全扫描模式，扫描范围30-400amu；

其中，生防菌短小芽孢杆菌AR03已于2010年8月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备方法为：葡萄糖15g，酵母粉1g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂15-20g，加水定容至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min。

4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述1-十五烯溶液的浓度为2μg/mL，溶剂为甲醇。

5.如权利要求2所述应用，其特征在于，步骤(6)中进行定性识别时设置匹配度阈值为

80。

说明书

一种生防菌挥发性代谢物的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于活性代谢物检测技术领域，涉及一种生防菌挥发性代谢物的检测方法。

背景技术

[0002] 本发明所涉及的生防菌AR03是从土壤根际细菌中筛选出一株性状良好的细菌菌株，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，该菌株及其在植病生防中的应用已获得国家发明专利(ZL.201110146683.8)。该菌株对果蔬作物青枯病菌(Ralostonia Solanacearum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟草黑胫病菌(Phytophora nicotianae)、烟草炭疽病菌(Colletotrichum nicotianae Av.-Sacca)和烟草白粉病(Erysiphe cichoracearum DC)等多种植物病原真菌和细菌有明显的抑制作用；另外AR03菌株对烟株还具有促生作用，在灭菌土条件下，经AR03处理后的整株干重和根干重比对照增加121.8％和176.7％；在自然土条件下，整株干重和根干重比对照增加了17.2％和14.4％。

[0003] 生防细菌对植物病原真菌病害的防病机制，主要包括抗生竞争诱导抗性及寄生等多种方式，其中通过分泌胞外代谢物抑制病原的生长和代谢是抗生作用的主要方式。因此，验证菌株拮抗活性的重要指标是该菌株的发酵上清液具有抑菌作用，即抗菌活性物质的提取是通过生防菌株的发酵滤液来完成。在研究该菌株对植物病原真菌和细菌拮抗作用的过程中发现，不同浓度AR03菌悬液(发酵原液、稀释30倍、100倍、200倍)对真菌菌丝形态，分生孢子萌发表现出较强的抑制作用，但其除菌上清液无抑菌活性。因此我们初步判断该菌株产生的具备抑菌活性的胞外代谢物不是存在于菌液中，而是以挥发态存在。对该菌株胞外挥发性抗菌物质进行鉴定和定量分析，对于进一步研究AR03菌株对病原菌的抗菌机理、作用方式及其田间防治提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。

[0004] 目前，挥发性有机物的收集方式主要有液液萃取(LLE)、水蒸气蒸馏(SD)、同时蒸馏萃取(SDE)、热脱附(TD)、吹扫捕集(P&D)、超临界萃取(SFE)、固相微萃取(SPME)等，其中LLE、SD、SDE是传统的提取方法，对人员、仪器配置要求不高，是挥发性成分收集的常用方法，但这些传统方法通常需要耗费较长的提取时间、大量的溶剂和繁琐的操作过程，此外高温的蒸馏过程会导致许多热不稳定的挥发性有机物降解，测的结果不能反映目标物的真实组成。而TD、P&T、SFE这三种提取方式均需要专门的设备，对人员和仪器配置要求都较高，且不太适用于痕量挥发性有机物的收集。SPME是近年来应用较为广泛的一种样品前处理技术，它的发展就是为了适应实验室和现场样品的快速处理的需求，其操作通常将少量具有吸附功能的涂层材料固定于基质表面，直接或间接接触样品，然后进行脱附分析。传统的分析方法和样品预处理技术存在的缺点固相微萃取技术几乎都能克服，该技术集取样萃取浓缩于一体，无需溶剂，具有快速高效成本低安全性高，能够与其他仪器联用等众多优点，使得样品处理技术及分析操作简单省时，因此成为目前最常用应用最广泛的样品预处理方法之一。近几年有大量的SPME研究论文出现，其中应用最多的是食品分析领域，在细菌挥发性代谢物研究方面还处于刚刚起步阶段。

[0005] 细菌挥发性代谢产物是细菌代谢产物的重要组成部分，与细菌生命活动和细菌生长数量密切关联，其中大多具有抑菌活性的代谢物质是细菌生命活动的中间产物，易被氧化、降解和发生分子重排。而现有针对微生物挥发性产物研究方法中，大多对于实验条件的控制不够严格，不适合于稳定性差的活性物质的分析，且定量分析过程大都采用峰面积归一化法，以各挥发性代谢物的峰面积占总峰面积之比值表示代谢物的相对含量，不能准确反映样品中目标代谢物真实组成情况。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本申请提供一种生防细菌挥发性代谢物鉴定与定量分析于一体的活体、实时、无损检测方法。该方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发物的收集、鉴定及定量检测问题，掌握细菌胞外挥发性代谢物分子时空动态信息，为研究生防菌的抗菌机理、作用方式及其在生物防治领域中的应用提供支持，为丰富抗菌物质种类和挖掘新的抗菌基因提供理论基础。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0008] 一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，包括：

[0009] (1)将细菌发酵液涂布于培养基上，所述培养基置于顶空瓶中；

[0010] (2)采用固相微萃取技术收集细菌挥发物；

[0011] (3)用配置多模式进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下结合商业谱库检索和正构烷烃保留指数匹配的方式对细菌挥发物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果，对细菌挥发物含量进行定量分析。

[0012] 具体的，一种生防菌挥发性代谢物的检测方法，包括如下步骤：

[0013] (1)生防菌培养：取培养基倾倒于无菌顶空瓶中冷却凝固，取生防菌发酵液涂布于培养基表面，加盖密封；同时设置空白对照组，所述空白对照组不添加生防菌发酵液；

[0014] (2)空白样品挥发物收集：将步骤(1)中获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样；采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。萃取头置于顶空瓶的上部空间；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

[0015] (3)细菌挥发物收集：将步骤(1)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置一定时间后，进行采样，采样前首先向顶空瓶侧壁注入1-十五烯内标溶液，注意尽量避免接触培养基基质，然后将SPME针管刺入顶空瓶，将萃取头置于顶空瓶上部空间，采集细菌挥发性代谢物，收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

[0016] (4)吸附正构烷烃(C10-C20)萃取头制作：将正构烷烃(C10-C20)溶液于顶空瓶中，在室温中静置一定时间后，进行采样；将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管；萃取头置于样品的上部空间，采集气态正构烷烃；收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析；

[0017] (5)挥发物定性分析：将步骤(2)、(3)获得含挥发物的探针以及步骤(4)吸附正构烷烃(C10-C20)的探针，在全扫描模式下进行分析，得到空白基质挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃(C10-C20)的总离子流图；

[0018] (6)细菌挥发性代谢物鉴定：将步骤(5)获得细菌挥发物总离子流图，扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰，即为挥发性代谢物特征指纹峰，经NIST和WILIY谱库对总离子图中化合物进行定性识别，对于识别的每种代谢物，根据其相邻正构烷烃的保留时间和碳原子数，计算该代谢物的保留指数(retention index)，然后查阅NIST Chemistry WebBook中报道的该组分在相同色谱柱中的保留指数，与本文计算结果相比较，进一步验证谱库检索结果的准确性；

[0019] (7)细菌挥发代谢物定量分析：将步骤(2)、(3)中获得含挥发性有机物的探针，进GC-MS分析，根据步骤(6)获得的挥发性代谢物的鉴定结果，以1-十五烯溶液作为内标参照，采用内标法计算各色谱峰对应代谢物的相对含量；

[0020] 优选的，所述生防菌为短小芽孢杆菌AR03，该菌已于2010年8月23日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.4117；

[0021] 优选的，步骤(1)和步骤(2)中所述培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基，所述牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基的制备方法为：葡萄糖15g，酵母粉1g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂15-20g，加水定容至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min；

[0022] 优选的，所述1-十五烯溶液的浓度为2μg/mL，溶剂为甲醇；所述1-十五烯分子中含一个双键，极性较大，跟挥发性代谢物的极性、沸点和色谱保留行为接近，且易溶于醇类溶液，用甲醇做溶剂添加到细菌培养基质中甲醇溶剂峰不会对目标组分造成干扰。

[0023] 优选的，步骤(6)中进行定性识别时设置匹配度阈值为80；

[0024] 优选地，GC-MS所采用的条件为：色谱柱DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格为[0025] 30m×0.25mm×0.25μm；进样口：大体积进样口(LVI)，冷不分流模式，初始温度40℃，以100℃/min速率升至250℃，解吸时间4min；载气为99.999％氦气，流速为1.0mL/min；柱温箱：初始温度40℃，保持2min，以5℃/min速率升至180℃，保持10min，以10℃速率升至
280℃，保持15min，总运行时间为55min；EI离子源；全扫描模式，扫描范围30-400amu。

[0026] 本发明还公开了由上述检测方法检测得到的挥发性代谢物，所述挥发性代谢物共7种，分别为二氢姜黄烯、(E)-β-金合欢烯、γ-姜黄烯、α-姜烯、π-红没药烯、β-倍半水芹烯和gamma-E-红没药烯。

[0027] 本发明还公开了所述β-倍半水芹烯在防治烟草真菌、细菌病害中的应用。

[0028] 优选的，所述烟草真菌、细菌病害包括烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌。

[0029] 与现有技术相比，本发明方法具有如下优点和进步性：

[0030] (1)传统挥发性有机物前处理过程步骤多、时间长，目标分子容易降解、代谢，造成分析结果失真，而本方法可一步完成目标挥发物的采集、净化、富集，是一种活体、原位、无损前处理技术，有助于掌握细菌胞外挥发性代谢物分子时空动态信息；

[0031] (2)本方法在样品汽化过程中采用冷不分流模式，从低温开始设置梯度升温程序，促使吸附在萃取头上的代谢物在最低的进样口温度下解吸、汽化，从而使发生热裂解和分子结构重排的可能性降至最低，能最大程度的保证分析结果的准确性；

[0032] (3)本方法选取与代谢物结构相似的1-十五烯为内标，通过加入的内标物的量，计算各色谱峰对应代谢物的含量。与现有技术采用的峰面积归一化法相比，本方法更能准确反映样品中目标代谢物真实组成情况；

[0033] (4)本方法检测得到的挥发性代谢物能够有效抑制烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌和炭疽病菌，为研发制备新一代烟草真菌、细菌杀菌剂奠定基础。

附图说明

[0034] 图1、空白基质挥发物总离子流图；

[0035] 图2、生防菌AR03挥发物总离子流图；

[0036] 图3、正构烷烃(C10-C20)总离子流图。

具体实施方式

[0037] 实施例1生防菌AR03挥发性代谢物的检测

[0038] 1、仪器与试剂：

[0039] 美国安捷伦7890B-5975C气相色谱质谱仪；生防菌AR03来自中国农科院烟草研究所植物保护研究中心；手动萃取手柄，50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，20mL棕色顶空瓶，购自美国Supelco公司；1-十五烯，正构烷烃(C10-C20)购自北京百灵威公司；二氯甲烷、甲醇均为色谱纯。

[0040] 2、细菌培养及挥发性物收集

[0041] (1)培养基制作：牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基制备方法如下：葡萄糖15g，酵母粉1g，胰蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，加水定容至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min。

[0042] (2)空白样品制作：取3mL尚未冷却的NA培养基(约55℃)加入无菌顶空瓶中，旋紧瓶盖，同时倾斜(15度)放置顶空瓶，待NA培养基冷却凝固，获得培养斜面。

[0043] (3)1-十五烯内标溶液配制：准确称取20mg 1-十五烯对照品，纯度不低于98.5％，用甲醇定容于10mL容量瓶中，得到浓度为2000μg/mL 1-十五烯内标母液，然后取一定量1-十五烯内标母液用甲醇稀释1000倍，得到浓度为2μg/mL 1-十五烯内标溶液，待用。

[0044] 根据前期实验结果，初步判定生防菌AR03产生的抑菌代谢物为倍半萜烯类物质(C15H24)，本方法选用结构式相近的1-十五烯为内标物(C15H30)，因其属性与目标代谢物相似，在色谱图中出峰时间比较接近，且经检验生防菌AR03代谢物在十五烯的保留时间内，无干扰峰出现。

[0045] (4)生防菌培养：移取50μL生防菌AR03发酵液均匀涂布到步骤(2)获得空白样品培养基表面，迅速用含有聚四氟内涂层的瓶盖封口，将顶空瓶置于28度恒温箱中静置、黑暗培养。

[0046] (5)空白样品挥发物收集：将步骤(2)获得的空白培养基的顶空瓶在室温中静置0.5h后，进行采样。采样时使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。萃取头置于顶空瓶的上部空间，采样时间为0.5h。收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，进GC-MS分析，。

[0047] 采集空白样品挥发物的目的，是为了排除培养基释放的挥发物和萃取头涂层流失对细菌挥发物鉴定结果的干扰。

[0048] (6)细菌挥发物收集：将步骤(4)获得含生防菌的顶空瓶在室温中静置0.5h后，用5μL锥形微量注射器，准确量取适量正十五烯内标溶液，注入到顶空瓶侧壁，注意尽量避免接触培养基基质，注入完毕后迅速将针头拔出，然后进行采样。采样时使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。萃取头置于样品的上部空间，采样时间为0.5h。收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析。

[0049] (7)吸附正构烷烃(C10-C20)探针制作：量取一定量正构烷烃(C10-C20)溶液于顶空瓶中，在室温中静置0.5h后，进行采样。采样时用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME针管刺入顶空瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。萃取头置于样品的上部空间，采样时间为0.5h。收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS分析。

[0050] 3、细菌挥发性代谢物定性分析

[0051] (1)挥发物GC-MS分析：将上述获得的吸附挥发物的萃取头，在全扫描模式下进行分析，得到空白样品挥发物、细菌挥发性代谢物和正构烷烃(C10-C20)的总离子流图，见图1、2、3。

[0052] (2)目标挥发物谱库检索：将步骤(1)获得细菌挥发物总离子流图，扣除空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰，即为生防菌AR03释放的挥发性特征指纹峰，使用NIST和WILIY谱库，对总离子图中色谱峰进行定性识别，设置匹配度阈值为80，生防菌AR03活性代谢物定性匹配结果见表1。

[0053] 表1生防菌AR03活性代谢物定性鉴定结果

[0054]

[0055] 注：RI：保留指数(Retention Index)；IS：内标(Internal Standard)[0056] (3)保留指数确证：将上述步骤(2)中匹配的细菌挥发性代谢物组分，根据公式(1)计算其保留指数，并查找NIST Chemistry WebBook和相关文献报道的该组分在相同色谱柱中的保留指数，比较两者之间差异，一般相差较小，且各组分保留指数大小跟其保留时间大小趋势一致时，即可判定目标挥发物匹配结果准确。公式计算和文献报道保留指数结果见表1。

[0057] 保留指数计算公式：

[0058] RI＝100Z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)](线性程序升温)…………公式(1)

[0059] 式中：TR(x)，TR(z)，TR(z+1)分别代表组分x及碳数为Z，Z+1正构烷的保留温度。且TR(z)

[0060] 4、细菌挥发性代谢物定量分析

[0061] (1)细菌挥发物定量计算公式：根据步骤3获得细菌挥发性代谢物定性鉴定结果，按照下述公式(2)计算目标代谢物的相对含量。

[0062] mi＝m15*(Ai/A15)…………公式(2)

[0063] 式中mi为目标代谢物含量，μg；m15为加入1-十五烯的量，μg；Ai为目标代谢物总离子流图峰面积；A15为1-十五烯总离子流图峰面积。

[0064] (2)不同生长期细菌挥发物定量分析结果：将培养培养1、3、6天的生防菌AR03，按照步骤2、3收集细菌挥发物，并进行定量分析，结果见表2。

[0065] 表2培养1、3、6天后生防菌AR03挥发性代谢物定量分析结果

[0066]

[0067] 实施例2挥发性代谢物β-倍半水芹烯对烟草真菌、细菌病原菌的拮抗作用[0068] 本实施例中所用的β-倍半水芹烯纯品购买自International laboratory。

[0069] 采用滤纸条法测定β-倍半水芹烯的抗菌活性。将样品配成质量浓度为10mg/ml的甲醇溶液，按照滤纸条法测定其对烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌的拮抗活性，具体方法如下：分别在无菌滤纸条(7mm×3mm)均匀滴入50μl，按照十字交叉方向小心将滤纸条置于培养皿中，然后将上述病菌分别等距离接种在滤纸条的空当中，30℃培养5d；对照组添加甲醇；观察对烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌的拮抗活性，实验结果表明，β-倍半水芹烯对烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌均有很强的抑制生长作用，而对照组中烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌基本无变化。

[0070] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围。