一种通过体胚发生大量繁殖忽地笑的方法

摘要

本发明提供一种通过体胚发生大量繁殖忽地笑的方法，进行规模化生产和繁殖以满足市场需要的忽地笑组织培养步骤包括：A.外植体消毒，B.不定芽的诱导，C.愈伤组织的诱导，D愈伤组织的增殖，E愈伤组织的再分化，F.生根培养，H炼苗与移栽。本发明首次将除草剂毒莠定应用于忽地笑的组织培养，获得了稳定的可大量增殖的忽地笑愈伤组织，愈伤组织诱导率达到95％以上，将忽地笑的繁殖系数至少提高了8‑10倍。不仅降低生产成本，而且可以保存母体的全部优良性状，遗传性状稳定。这种方法可在短时间内形成大量的优良试管苗，进行规模化、工厂化生产，为观赏园艺、制药等产业以及忽地笑的后续研究提供了大量的原材料。

权利要求

1.一种通过体胚发生大量繁殖忽地笑的方法，其特征在于：A 外植体消毒：选取在-4℃，保存30天以上的忽地笑小鳞茎，剥去外层鳞片，切除根部，经消毒试剂消毒后，无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分；

B 丛生芽诱导和小鳞茎培养：将消毒好的忽地笑切去上部1/2，将带有鳞茎盘的鳞茎均匀分为4-8块，接种到以下培养基中：MS基本培养基，植物生长激素6-苄 基腺嘌呤（6-BA）

3.0 5.0mg/L，吲哚乙酸（IBA）0.1 0.5mg/L蔗糖20 40g/L，适当pH值；培养温度28±1℃，光~ ~ ~照强度1000 3000lx，光照时间10 16h，进行光照培养，之后将诱导出的不定芽分别接种到~ ~相同培养基上，继续培养20 30天；

~

C 愈伤组织诱导：将分化而成的丛生芽切开，去除原有鳞片和褐化部分，接种到以下培养基中：MS基本培养基，蔗糖20 40g/L，植物生长激素毒莠定（Picolarm）1.0 3.0mg/L，6-苄 ~ ~基腺嘌呤（6-BA）0.1 0.5mg/L，适当pH值；培养温度28±1℃；

~

D愈伤组织增殖：将诱导出20天左右的愈伤组织切下，接种到以下培养基上：MS基本培养基，植物生长激素毒莠定（Picolarm）1.0 2.0mg/L，6-苄 基腺嘌呤（6-BA）1.0 2.0mg/L，~ ~培养温度28±1℃，光照时间10 16h，进行光照培养30 40天；

~ ~

E 愈伤组织的分化：将进行增殖培养后的愈伤组织切成2cm左右的小块，接种到以下培养基上：MS基本培养基，植物生长激素6-苄 基腺嘌呤（6-BA）4.0 6.0mg/L，萘乙酸（NAA）0.1~

0.5mg/L，培养温度25±1℃，光照时间10 16h，进行光照培养30 40天；

~ ~ ~

F 生根培养：选取生长健壮的试管苗，连同小鳞茎接种到如下培养基中：1/2MS或MS基本培养基，蔗糖60 90g/L，植物生长激素萘乙酸（NAA）400 500mg/L，适当PH值，进行光照培~ ~养50 60天。

~

H 炼苗移栽：将组培瓶盖打开，并添加少量的蒸馏水，进行有菌条件驯化；用镊子将组培苗从瓶中取出，移栽到已经灭菌的栽培基质中，进行遮阴驯化3周，期间不定期的喷施1/

2MS营养液。

说明书

一种通过体胚发生大量繁殖忽地笑的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种体胚发生大量繁殖忽地笑方法，属于植物的人工繁殖和栽培方法技术领域。

背景技术

[0002] 忽地笑(Lycoris aurea Herb.)又称黄花石蒜，主产我国，分布于我国西南、华东、华南、西北地区的16个省区，日本和缅甸也有少量分布。忽地笑的花叶均具有颇高的观赏价值，其花为金黄色，华亭挺拔，花型奇特；花后冬春季又可观叶，其叶形似兰草，姿态优雅。在日本、荷兰等一些国家，其道路、庭院都广泛栽培忽地笑，是一种颇受人们喜爱的庭院观赏植物。

[0003] 另外，忽地笑亦具有很高的药用价值，其鳞茎是提取加兰他敏的良好原料，加兰他敏在忽地笑中的含量很高，野生资源中发现的最高含量为0.2％。目前加兰他敏的市场价格为40万元每公斤，因此忽地笑的人工繁育栽培蕴藏着巨大的市场前景和社会效益。

[0004] 虽然我国的忽地笑资源丰富，但由于目前忽地笑种球市场需求日益增大。而其栽培技术落后，种球繁殖率低，导致其野生资源遭到乱采滥挖。近几年来，由于制药工业的大量提取，原分布最广、蕴藏量最多的红花石蒜(L.radiata)和忽地笑(L.aurea)的野生资源也急剧减少。要解决这一问题，组织培养是一条有效途径，但长期以来忽地笑的组织培养受其种球繁殖率低、褐化等问题较为严重的影响，效率一直较低。之前报道的忽地笑组织培养大多以诱导不定芽为主，少数诱导愈伤的报道主要以小鳞茎和种子为材料，而且诱导率和再分化率较低，繁殖系数不高。本发明通过先诱导出忽地笑的不定芽，再对其无菌苗进行诱导，从体细胞胚的发生途径进行忽地笑愈伤组织诱导，首次将除草剂毒莠定用于忽地笑的组织培养，获得了稳定的可继代增殖的愈伤组织，诱导率可达到95％以上，经过合理的激素调配，诱导出的愈伤组织可再分化出大量的不定芽。此方法对比传统的植物生长激素调节，将忽地笑的繁殖系数至少提高了8倍以上，大大提高了忽地笑组培的繁殖效率。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种体胚发生的忽地笑的繁殖方法，进行规模化生产以及以忽地笑组培为基础的其他学科的研究工作的需要。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的，该种忽地笑繁殖方法的主要特点是：

[0007] A外殖体消毒：选取在-4℃，保存30天以上的忽地笑小鳞茎，剥去外层鳞片，切除根部，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min，流水冲洗30～60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含2～5％次氯酸钠灭菌20～30min，无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分；

[0008] B丛生芽诱导：将消毒好的忽地笑切去上部1/2，将带有鳞茎盘的鳞茎均匀分为4-8块，接种到以下培养基中：MS基本培养基，适当浓度的植物生长激素，蔗糖(食用糖)20～40g/L，适当pH值；培养温度28±1℃，光照强度1000～3000lx，光照时间10～16h，进行光照培养；

[0009] C愈伤组织诱导：将分化而成丛生芽(含小鳞茎)切开，去除原有鳞片和褐化部分，接种到以下培养基中：MS基本培养基，蔗糖(食用糖)20～40g/L，适当浓度植物生长激素，适当pH值；培养温度28±1℃；

[0010] D愈伤组织增殖：将诱导出20天左右的愈伤组织切下，接种到以下培养基上：MS基本培养基，适当植物生长激素，培养温度28±1℃，光照时间10～16h，进行光照培养30～40天；

[0011] E愈伤组织的分化：将进行增殖培养后的愈伤组织切成2cm左右的小块，接种到以下培养基上：MS基本培养基，适当植物生长激素，培养温度25±1℃，光照时间10～16h，进行光照培养30～40天；

[0012] F生根培养：选取生长健壮的试管苗，连同小鳞茎接种到如下培养基中：1/2MS或MS基本培养基，蔗糖60～90g/L，适当浓度的植物生长激素，适当PH值，进行光照培养50～60天。

[0013] H炼苗移栽：将组培瓶盖打开，并添加少量的蒸馏水，进行有菌条件驯化；用镊子将组培苗从瓶中取出，移栽到已经灭菌的栽培基质中，进行遮阴驯化3周，期间不定期的喷施1/2MS营养液。

[0014] 所述的忽地笑速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤A中的消毒试剂和时间、步骤B中的pH值范围以及步骤B、C、D、E、F中忽地笑繁殖所述的培养基中涉及的植物生长激素，包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、毒秀定(Picolarm)、萘乙酸(NAA)其中一种或几种。

[0015] 所述的忽地笑繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤A中的种子消毒用试剂0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～20min和含2％次氯酸钠灭菌20～30min。

[0016] 所述的忽地笑繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤B中pH值范围为5.8～7.0，植物生长激素包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)4.0～6.0mg/L，吲哚乙酸(IBA)0.1～0.5mg/L。

[0017] 所述的忽地笑繁殖方法的延伸技术方案包括：其特征在于步骤C所涉及里面到的植物生长激素包括毒莠定(Picolarm)1.0～3.0mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)0.1～0.5mg/L。

[0018] 所述的忽地笑繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤D中所涉及到的植物生长激素包括6-卞基腺嘌呤(6-BA)4.0～6.0mg/L，萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg/L。

[0019] 所述的忽地笑繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤E中所涉及到的植物生长激素萘乙酸(NAA)400～500mg/L，浸泡时间为10-15min。

[0020] 所述的忽地笑繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤H中添加蒸馏水5～10ml，进行有菌驯化2-3天。

[0021] 采用体胚发生培养的方法繁殖忽地笑，不仅可以摆脱外界条件的影响，四季都能进行生产，而且可以节约育苗占地，降低生产成本。本技术是利用细胞的全能性，采取植物体上的细胞团伙一块组织，通过人为条件的控制，使这些组织形成千百万植株，并且保存了母体的全部优良性状，且遗传性状稳定。组织培养快速繁殖是目前尽快满足市场需求的有效途径，同时也是种质保存(超低温保存)、诱变育种及遗传转化的基础。这种方法保留了忽地笑的植株活性，可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。

附图说明

[0022] 图1是开始萌发不定芽的忽地笑鳞茎图，图2是体细胞胚诱导出的愈伤组织，图3是愈伤组织再分化，图4是炼苗移栽前的忽地笑小鳞茎和植株。

具体实施方式

[0023] 下面结合忽地笑体外繁殖的实例说明本发明的具体实施方式。

[0024] 实例1愈伤组织的诱导和培养

[0025] 1.取忽地笑的地下鳞茎，剥去外层鳞片，切除根部，切去鳞茎上半部分约1/2～2/3。将留有鳞茎盘的鳞茎均分为4～8块，用0.1％的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15～
20min，流水冲洗60min后，再在超净工作台上用75％的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含1％次氯酸钠溶液消毒20～30min(在次氯酸钠溶液中加入几滴吐温80)，无菌水冲洗4-5次，最后用无菌滤纸吸干小鳞茎表面水分。

[0026] 2.将消毒好的忽地笑鳞茎小块直接接种到不定芽诱导培养基中：MS基本培养基中添加，6-卞基腺嘌呤(6-BA)3.0mg/L，吲哚乙酸(IBA)0.2mg/L，蔗糖30g/L，适当pH值；培养温度28±1℃，光照强度1000～3000lx，光照时间10～16h，进行光照培养。

[0027] 3.将生长出的不定芽继续培养30天后，将丛生芽(含小鳞茎)切开接种到本发明的愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养。愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加植物生长激素毒莠定(Picolarm)3.0mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L，培养30天以上，诱导率达到90％。

[0028] 4.待忽地笑愈伤组织诱导培养30天以上，将愈伤组织转接到本发明的愈伤组织增殖培养基上，进行增殖培养。愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加植物生长激素毒莠定(Picolarm)1.5mg/L，6-卞基腺嘌呤(6-BA)1.5mg/L，培养30天以上，愈伤组织可增殖2～3倍。

[0029] 实例2愈伤组织的分化和试管苗的生根、移栽

[0030] 1.培养30-60天后，待愈伤组织生长至2-3cm，将其切开重新接种到本发明的愈伤组织分化培养基中，进行分化培养。愈伤组织分化培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加植物生长激素6-卞基腺嘌呤(6-BA)6.0mg/L，萘乙酸(NAA)0.2mg/L，蔗糖30g/L，进行增殖培养。培养30天以上，诱导率达到98％，大部分愈伤可诱导出丛生芽数达到5-6个[0031] 2.选取生长健壮的试管苗，然后接种到1/2MS基本培养基上，吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L，蔗糖60g/L，进行生根诱导。培养40天后，生根率达86％，平均根数目达8.5根。

[0032] 3.将忽地笑组培苗生根培养1.5-2个月后开始进行炼苗移栽，首先将组培瓶移入光照培养箱，进行变温变光驯化5-7天，再将组培瓶盖打开，并添加10ml蒸馏水，进行有菌条件驯化2-3天。然后将组培苗移栽到已经灭菌的栽培基质(泥潭：珍珠岩：园土＝1：1：5)中，放置无加温加光的温室中，进行遮阴驯化3周，期间不定期的喷施1/2MS营养液，移栽后成活率达78％。以上实例的忽地笑组织培养状况见附图。