蛋白质PGR5在调控藻类抗氧化性中的应用

摘要

本发明公开了蛋白质PGR5在调控藻类抗氧化性中的应用；所述蛋白质PGR5为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；a2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗氧化性相关的蛋白质。实验证明，由于PGR5基因的缺失，导致突变藻株91对H2O2和tBOOH的抗性显著提高，本发明对筛选并获得具有较强抗氧化能力的衣藻株系，对有效开发和利用藻类资源，促进藻类资源的可持续发展有重要价值。

权利要求

1.蛋白质PGR5在调控藻类抗氧化性中的应用；所述蛋白质PGR5为氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；所述藻类是莱茵衣藻。

2.编码权利要求1所述蛋白质PGR5的核酸分子在调控藻类抗氧化性中的应用；所述藻类是莱茵衣藻。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质PGR5的核酸分子为如下b1）或b2）所示的基因：b1）核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2）其编码序列是序列表中序列2核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子。

4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述藻类是所述莱茵衣藻是如下c1）或c2):c1）莱茵衣藻藻种（Chlamydomonas reinhardtii）CC400（mt-）；

c2) 莱茵衣藻藻种（Chlamydomonas reinhardtii）突变体91号，保藏编号为CGMCC NO. 

8706。

5.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述抗氧化性为抗外源活性氧化剂。

6.一种培育重组藻类的方法，包括如下步骤：向目的藻类中导入权利要求1所述蛋白质PGR5的编码基因，得到抗氧化性低于所述目的藻类的重组藻类；所述藻类是莱茵衣藻。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质PGR5的核酸分子为如下b1）或b2）所示的基因：b1）核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2）其编码序列是序列表中序列2核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述莱茵衣藻是如下c1）或c2):c1）莱茵衣藻藻种（Chlamydomonas reinhardtii）CC400（mt-）；

c2) 莱茵衣藻藻种（Chlamydomonas reinhardtii）突变体91号，保藏编号为CGMCC NO. 

8706。

9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述抗氧化性为抗外源活性氧化剂。

10.一种培育重组藻类的方法，包括如下步骤：沉默出发藻类基因组中的权利要求1所述蛋白质PGR5的编码基因，得到抗氧化性高于所述出发藻类的重组藻类；所述藻类是莱茵衣藻。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质PGR5的核酸分子为如下b1）或b2）所示的基因：b1）核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2）其编码序列是序列表中序列2核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子。

12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述莱茵衣藻是如下c1）或c2):c1）莱茵衣藻藻种（Chlamydomonas reinhardtii）CC400（mt-）；

c2) 莱茵衣藻藻种（Chlamydomonas reinhardtii）突变体91号，保藏编号为CGMCC NO. 

8706。

13.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述抗氧化性为抗外源活性氧化剂。

说明书

蛋白质PGR5在调控藻类抗氧化性中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白质PGR5在调控藻类抗氧化性中的应用。

背景技术

[0002] 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞、真核生物，隶属于绿藻门、团藻目、衣藻科中的衣藻属，是广泛用于光合作用与产氢过程和机理研究的重要模式藻种。近年来随着资源、能源及环境等各种危机的日益加剧，各国政府及工业界都十分重视研究和开发不占用耕地的微藻生物资源。筛选并获得具有较强抗氧化能力的衣藻株系对有效开发和利用藻类资源，促进藻类资源的可持续发展有重要价值。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是如何调控藻类的抗氧化性。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质PGR5在调控藻类抗氧化性中的应用。

[0005] 本发明所提供的蛋白质PGR5为如下a1)或a2)或a3)的蛋白质：

[0006] a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

[0007] a2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0008] a3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗氧化性相关的蛋白质。

[0009] 其中，序列表中序列1由141个氨基酸残基组成。

[0010] 为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0011] 表1、标签的序列

[0012]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0013] 上述a3)中的蛋白质PGR5，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0014] 上述a3)中的蛋白质PGR5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0015] 上述a3)中的蛋白质PGR5的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0016] 编码所述蛋白质PGR5的核酸分子在调控藻类抗氧化性中的应用也属于本发明的保护范围。

[0017] 上述应用中，所述编码所述蛋白质PGR5的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的基因：

[0018] b1)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

[0019] b2)其编码序列是序列表中序列2核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；

[0020] b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质PGR5的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0021] b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质PGR5的cDNA分子或基因组DNA分子。

[0022] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0023] 其中，序列表序列2由426个核苷酸组成，序列表序列2的核苷酸编码序列表序列1所示的氨基酸序列。

[0024] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质PGR5的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质PGR5的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质PGR5且与抗氧化性相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0025] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0026] 上述应用中，所述藻类是如下c1)-c6)中的任一种：c1)绿藻门藻类；c2)团藻目藻类；c3)衣藻科藻类；c4)衣藻属藻类；c5)莱茵衣藻；c6)莱茵衣藻藻种(Chlamydomonas reinhardtii)CC400(mt-)。

[0027] 上述应用中，所述抗氧化性为抗外源活性氧化剂。

[0028] 本发明还提供了一种培育重组藻类的方法一。

[0029] 本发明所提供的一种培育重组藻类的方法一，包括如下步骤：向目的藻类中导入所述蛋白质PGR5的编码基因，得到抗氧化性低于所述目的藻类的重组藻类。

[0030] 所述重组藻类可为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)91号，于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.8706。所述莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)91号为向莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400(mt+)中导入pChlamiRNA3质粒(购买自美国杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center，http://
www.chlamy.org/)，得到的重组衣藻。

[0031] 本发明还提供了一种培育重组藻类的方法二。

[0032] 本发明所提供的一种培育重组藻类的方法二，包括如下步骤：沉默出发藻类基因组中的所述蛋白质PGR5的编码基因，得到抗氧化性高于所述出发藻类的重组藻类。

[0033] 上述方法中，所述蛋白质PGR5的编码基因可为如下d1)或d2)或d3)或d4)所示的基因：

[0034] d1)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

[0035] d2)其编码序列是序列表中序列2核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子；

[0036] d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质PGR5的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0037] d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质PGR5的cDNA分子或基因组DNA分子。

[0038] 上述方法中，所述藻类是如下c1)-c6)中的任一种：c1)绿藻门藻类；c2)团藻目藻类；c3)衣藻科藻类；c4)衣藻属藻类；c5)莱茵衣藻；c6)莱茵衣藻藻种(Chlamydomonas reinhardtii)CC400(mt-)。

[0039] 上述方法中，所述抗氧化性为抗外源活性氧化剂。

[0040] 上述任一所述外源活性氧化剂可为H2O2或tBOOH。

[0041] 实验证明，将PGR5基因转入突变藻株91号，得到转PGR5基因莱茵衣藻。突变藻株91对H2O2和tBOOH的抗性高于转PGR5基因莱茵衣藻对H2O2和tBOOH的抗性，表明，由于PGR5基因的缺失，导致突变藻株91对H2O2和tBOOH的抗性显著提高，这对筛选并获得具有较强抗氧化能力的衣藻株系，对有效开发和利用藻类资源，促进藻类资源的可持续发展有重要价值。

附图说明

[0042] 图1为转PGR5基因莱茵衣藻的蛋白水平检测结果。

[0043] 图2为H2O2处理转PGR5基因莱茵衣藻的表型分析及生长曲线。

[0044] 图3为H2O2和tBOOH处理转PGR5基因莱茵衣藻的平板恢复实验。

具体实施方式

[0045] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0046] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0048] 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400(mt-)(简称为莱茵衣藻CC400)，从美国杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)购买。

[0049] 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)91号(为突变菌株，因此下文中简称突变藻株91号)：于2013年12月31日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.8706，分类命名为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。遗传背景：向莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400(mt-)中导入pChlamiRNA3质粒(含有巴龙霉素抗性基因，购买与美国杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)，得到重组衣藻。

[0050] 质粒pDble：由伦敦大学学院Saul purton教授提供，记载于“Grovenstein PB,Wilson DA,Lennox CG et al.(2013)Identification and molecular characterization of a novel Chlamydomonas reinhardtii mutant defective in chlorophyll biosynthesis F1000Research 2013,2:138”一文，该载体含有博来霉素抗性基因。

[0051] 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为DP209-03。pEasy-blunt simple载体、大肠杆菌(Escherichia coli)Trans-T1感受态细胞均为北京全式金生物技术有限公司的产品。tBOOH为国药集团化学试剂有限公司产品。

[0052] 下述实施例中所用的培养基及固体平板：

[0053] (1)TAP液体培养基：NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaC12·2H2O 0.05g/L，K2HPO40.108g/L，KH2PO40.056g/L，Trisbase 2.423g/L，亨特微量元素(Hunter’s trace elements)1mL/L，冰乙酸1ml/L；其余为水；

[0054] 其中亨特微量元素(Hunter’s trace elements)配方如下：H3BO411.4g/L，ZnSO4·7H2O 22.0g/L，MnCl2·4H2O 5.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)
6Mo7O24·4H2O 1.10g/L，FeSO4·7H2O 4.99g/L，其余为水。

[0055] (2)TAP固体培养基：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL。

[0056] (3)博来霉素平板：含有10μg/L的博来霉素的TAP固体培养基，趁热倒入培养皿中，得到博来霉素平板。

[0057] (4)TAP固体平板：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL趁热倒入培养皿中，得到TAP固体平板。

[0058] 实施例1、PGR5蛋白的功能验证

[0059] 一、互补载体构建

[0060] 互补载体的构建步骤如下：

[0061] 1、莱茵衣藻CC400总RNA的提取

[0062] 采用植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)并按使用说明书从莱茵衣藻CC400中提取总RNA。具体步骤如下：

[0063] (1)用接种针从TAP固体培养基上挑取莱茵衣藻CC400单克隆，接种到TAP液体培养基中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃，60rpm，100μEs-1m-2)，，获得衣藻细胞培养液1(莱茵衣藻CC400的细胞浓度为4-6×106个/mL培养液)。

[0064] (2)取2mL步骤(1)获得的衣藻细胞培养液1，5000rpm离心5min后，加入1mL裂解液RZ，振荡混匀，室温放置5min，然后4℃、12000rpm离心5min，取上清，转入新的无RNase的离心管中。

[0065] (3)向完成步骤(2)的离心管中加200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min，然后4℃、12000rpm离心10min，把上层水相转移到新的无RNase的离心管中。

[0066] (4)向步骤(3)得到的装有上层水相的离心管中缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀全部转入吸附柱中，然后4℃、12000rpm离心30s，弃废液。

[0067] (5)向完成步骤(4)的吸附柱中加500μL去蛋白液，4℃、12000rpm离心30s，弃废液。

[0068] (6)向完成步骤(5)的吸附柱中加700μL漂洗液，室温静置2min，4℃、12000rpm离心30s，弃废液。

[0069] (7)向步骤(6)的吸附柱中加500μL漂洗液，室温静置2min，4℃、12000rpm离心30s，弃废液。

[0070] (8)将步骤(7)的吸附柱4℃、12000rpm离心2min，去除残余液体，开盖晾干。

[0071] (9)将步骤(8)的吸附柱转入一个新的无RNase的离心管中，加50μL RNase-free ddH2O，室温放置2min，4℃、12000rpm离心2min。

[0072] 步骤(9)的离心管中的液体即为莱茵衣藻CC400的总RNA。

[0073] 2、cDNA第一链合成

[0074] 以步骤1获得的莱茵衣藻CC400的总RNA为模板，使用cDNA第一链合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)合成cDNA第一链。

[0075] 反应程序为：50℃温浴30min，然后70℃加热15min终止反应。

[0076] 反应体系(20μL)：2μL 10×TSII mix，1μl Oligo dT20(在反应体系中的终浓度为10μM)，1-5μg莱茵衣藻CC400的总RNA，补灭菌双蒸水至20μL。

[0077] 3、PGR5基因的获得

[0078] (1)引物合成

[0079] 在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上游引物和下游引物，引物序列如下：

[0080] 上游引物：5’-CATATGCTGGCCTCCAAGCCCGTTGT-3’(下划线部分为Nde I的识别序列，该序列的第4-26位为序列表中序列2的第1-23位)；

[0081] 下游引物：5’-GAATTCTTAAGCCAGGAAGCCCAGCTTC-3’(下划线部分为EcoR I的识别序列，该序列的第7-28位为序列表中序列2的第405-426位的反向互补序列)。

[0082] (2)PCR扩增

[0083] 以步骤2合成的cDNA第一链为模板，以上游引物和下游引物为引物，进行PCR扩增，获得426bp的PCR扩增产物。

[0084] 反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

[0085] 反应体系(25μL)：2×HS GC buffer I 12.5μL，dNTP mixture(各2.5mM)2μL，模板cDNA 1μL，PRIMERSTAR(5U/μL)0.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，补ddH2O至25μL。

[0086] (3)测序

[0087] 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化步骤(2)获得的PCR扩增产物，然后与pEasy-blunt simple载体连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)Trans-T1感受态细胞，用蓝白斑方法筛选阳性克隆。挑取单克隆培养，用通用引物M13F和M13R进行PCR鉴定，将阳性克隆送至北京三博生物技术有限责任公司测序。

[0088] 测序结果表明，阳性克隆中含有序列表中序列2所示的核苷酸序列，将该阳性克隆的命名为pEasy-PGR5。

[0089] 将序列表中序列2所示基因命名为PGR5基因，编码序列表中序列1所示的蛋白质，将该蛋白命名为PGR5蛋白，由141个氨基酸残基组成。

[0090] 经鉴定突变藻株91号中，PGR5基因被沉默了。

[0091] 4、用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切步骤3的(2)得到的PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收426bp的DNA片段。

[0092] 5、用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切质粒pDble，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收约7.29kb的载体骨架。

[0093] 6、将载体骨架与步骤4得到的DNA片段连接，得到重组质粒pDble-PGR5。

[0094] 根据测序结果，对重组质粒pCT-fogac进行结构描述如下：将质粒pDble的NdeI识别序列和EcoRI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列2自5'末端第7位至第426位所示的DNA分子，得到重组质粒pDble-PGR5。

[0095] 7、用限制性内切酶Kpn I酶切重组质粒pDble-PGR5，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收约7.7kb的线性化质粒pDble-PGR5。

[0096] 二、转PGR5基因莱茵衣藻的获得

[0097] 用玻璃珠法将步骤一中7的线性化质粒pDble-PGR5转化突变藻株91号，具体步骤如下：

[0098] 1、用接种针从TAP固体培养基上挑取突变藻株91号单克隆，接种到TAP液体培养基中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃，60rpm，100μEs-1m-2)，，获得衣藻细胞培养液2(突变藻株91号的细胞浓度为4-6×106个/mL培养液)。

[0099] 2、称取0.1g玻璃珠(直径425-600μm，Sigma公司产品)，置于1.5mL离心管中，121℃灭菌20min后，放于室温待用。

[0100] 3、向完成步骤2的离心管加入100μl步骤1获得的衣藻细胞培养液2和10μl步骤一中7的线性化质粒pDble-PGR5(5μg/μl)，然后涡旋震动15s，室温25℃放置4min。

[0101] 4、完成步骤3后，将离心管中的藻液转移到新鲜的TAP液体培养基中，置于恒温光-1 -2照培养箱中的摇床上连续光照培养24小时后(25℃，60rpm，110μEs m )，2500rpm离心，收集沉淀用TAP液体培养基重悬，涂布在博来霉素平板上，两周后，获得拟转PGR5基因莱茵衣藻。

[0102] 用质粒pDble代替线性化质粒pDble-PGR5，其它同步骤1-4，得到转空载体莱茵衣藻，作为对照。

[0103] 三、转PGR5基因莱茵衣藻的分子水平鉴定

[0104] 以步骤二获得的拟转PGR5基因莱茵衣藻中随机选取的两株(分别命名为Comp-18和Comp-50)、转空载体莱茵衣藻、突变藻株91号和莱茵衣藻CC400为实验材料。在转录水平检测各藻株中PGR5基因的表达量。按照步骤一中1和2的方法，提取各实验材料的总RNA并反转录获得cDNA。

[0105] 以cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分析PGR5基因在各实验材料中的相对表达量(以CBLP基因为内参基因)。同时以等体积ddH2O为模板，其它步骤均相同，设置阴性对照。扩增PGR5基因的引物序列为：引物1：5’-CCTCTGGTCATCGTTGTTCGC-3’；引物2：5’-TTAAGCCAGGAAGCCCAGC-3’。扩增内参CBLP基因的引物序列为：引物3：5’-ATGACCACCAACCCCATCATC-3’，引物4：5’-GGTCCCACAGCATGGCAATG-3’。

[0106] 反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸5min。

[0107] 反应体系：2×GC I buffer I 10μL，dNTP mixture(各2.5mM)2μL，模板cDNA(1μg/μL)1μL，LA-Taq(5U/μL)0.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，补ddH2O至20μL。

[0108] 结果表明，突变藻株91号和转空载体莱茵衣藻中扩增不出PGR5基因；而Comp-18和Comp-50中PGR5基因的表达量与莱茵衣藻CC400中PGR5基因的表达量基本一致，无统计学差异。

[0109] 四、转PGR5基因莱茵衣藻的蛋白水平鉴定

[0110] 以Comp-18、Comp-50、转空载体莱茵衣藻、突变藻株91号和莱茵衣藻CC400为实验材料。在蛋白水平检测各藻株中PGR5蛋白的表达量。

[0111] 用Peterson GL(1977)Simplification of protein assay method of Lowry et al-which is more generally Applicable.Anal Biochem 83:346-356记载的方法提取各实验材料的总蛋白，进行SDS-PAGE分离，然后通过考马斯亮蓝染色(指示总蛋白的浓度)和Western blot实验(以PGR5抗体作为一抗检测PGR5蛋白)，实验结果见图1(图1中A为Western blot实验结果，图1中B为考马斯亮蓝染色结果，其中CC400为莱茵衣藻CC400，hpm91为突变藻株91号，Comp-18和Comp-50为转入PGR5基因的突变藻株91号的两个互补藻株)。

[0112] PGR5抗体为由北京博尔迈生物技术有限公司制备，制备方式具体为用2mgPGR5重组蛋白免疫兔，收集血清得到PGR5抗体。PGR5重组蛋白的制备方法如下：

[0113] (1)将上述步骤一中的pEasy-PGR5单克隆接种到900mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，当大肠杆菌的培养菌液的OD600达到0.6～0.8，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，使IPTG在体系中浓度为0.5mM，28℃诱导6h，得到诱导后的培养菌液。

[0114] (2)将步骤(1)诱导后的培养菌液用4000rpm、离心20min，收集菌体，然后用高压细胞破碎仪裂解，得到全细胞裂解液，30000g离心50min，经检测，重组蛋白在沉淀的包涵体中，用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，0.2mM DTT,2％Triton,2M Urea)洗涤包涵体，用溶解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，0.2mM DTT,2％Triton,8M Urea)溶解包涵体，离心取上清上样至镍离子金属亲和层析柱(镍-氨乙二酸(Nickel-nitri lotriacetic acid,Ni-NTA)琼脂糖介质填充的层析柱，层析柱型号E0001V，纽英伦生物技术公司产品)，用5mL漂洗液(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，10mM imidazole)漂洗去除杂蛋白，然后用5mL洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，300mM imidazole)洗脱并收集重组蛋白。用透析液(50mM  Tris-HAc  pH  8.0，1mM 
dithiothreitol)对洗脱的重组蛋白冰上透析过夜。12％SDS-PAGE检测纯化得到的PGR5重组蛋白。

[0115] 结果表明，突变藻株91号和转空载体莱茵衣藻中无PGR5蛋白表达；而Comp-18和Comp-50中PGR5蛋白的表达量均与莱茵衣藻CC400中PGR5蛋白的表达量基本一致，无统计学差异。可见，Comp-18和Comp-50均为突变藻株91号的互补藻株。

[0116] 五、抗氧化性比较

[0117] 通过外加活性氧试剂处理衣藻细胞，检测衣藻细胞(Comp-18、Comp-50、突变藻株91号或莱茵衣藻CC400)的抗氧化性。实验重复三次，取平均值。

[0118] 1、用接种针从TAP固体培养基上挑取衣藻细胞单克隆，接种到TAP液体培养基中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃，60rpm，100μEs-1m-2)，获得衣藻细胞6
培养液(衣藻细胞的细胞浓度均为5×10个/mL培养液)。

[0119] 取衣藻细胞培养液，调节衣藻细胞在750nm处光吸收值为0.05，然后加入H2O2，使H2O2在体系中的终浓度1mM，置于恒温光照培养箱中的摇床上，25℃、60rpm、60μEs-1m-2连续光照培养。从加入H2O2开始计时，在培养过程中每12小时取样，测定衣藻细胞在750nm处光吸收值。以培养时间为横坐标，衣藻细胞在750nm处光吸收值为纵坐标，绘制衣藻细胞的生长曲线。

[0120] 实验结果见图2(图2中A为衣藻细胞用1mM H2O2处理24h和48h生长状态，图2中B为衣藻细胞用1mM H2O2处理0h-48h的生长曲线；其中CC400为莱茵衣藻CC400，hpm91为突变藻株91号，Comp-18和Comp-50为转PGR5基因莱茵衣藻的两个株系)。结果表明，用1mM H2O2处理衣藻细胞，突变藻株91号的细胞生长速率大于莱茵衣藻CC400、Comp-18和Comp-50的细胞生长速率。

[0121] 2、用接种针从TAP固体培养基上挑取衣藻细胞单克隆，接种到TAP液体培养基中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃，60rpm，100μEs-1m-2)，悬浮培养衣藻细胞，获得衣藻细胞培养液(衣藻细胞的细胞浓度均为2×106个/mL培养液)

[0122] 取24孔板，每孔加入1mL衣藻细胞培养液，然后加入H2O2，使H2O2在体系中的浓度为0mM、1mM、3mM或5mM，置于恒温光照培养箱中的摇床上，25℃、80rpm、50μEs-1m-2连续光照培养，培养24h后，每孔取5μL均匀涂布在TAP固体平板上，置于恒温光照培养箱连续光照培养(25℃，60μEs-1m-2)，从涂布在TAP固体平板上开始计时，一周后观察恢复情况并拍照记录，得到不同浓度H2O2处理后的平板恢复实验结果。每个H2O2浓度设置5个复孔。

[0123] 按照上述方法，将H2O2替换为tBOOH，H2O2在体系中的浓度为0mM、1mM、3mM或5mM替换为tBOOH在体系中的浓度为0μM、60μM、80μM或100μM，其它步骤均不变，得到不同浓度tBOOH处理后的平板恢复实验结果。

[0124] 实验结果见图3(图3中左图为不同浓度H2O2处理后的平板恢复实验结果，图3中右图为不同浓度tBOOH处理后的平板恢复实验结果；其中CC400为莱茵衣藻CC400，hpm91为突变藻株91号，Comp-18和Comp-50为转入PGR5基因的突变藻株91号的两个互补藻株)。结果表明，突变藻株91对H2O2和tBOOH的抗性都高于莱茵衣藻CC400、Comp-18和Comp-50对H2O2和tBOOH的抗性，可见，由于PGR5基因的缺失，导致突变藻株91对H2O2和tBOOH的抗性显著提高。