齿瓣石斛均一多糖的分离纯化及一级结构鉴定方法

摘要

由于齿瓣石斛多糖粘性高，高活性多糖段分子量大，所以在其分离纯化以及结构解析方面存在一定难度。为此本发明公开了一种分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，先用分步醇沉方法进行分离，然后经凝胶柱纯化，能够得到纯净的齿瓣石斛的均一多糖。另外，本发明还采用多光谱解析鉴定了齿瓣石斛均一多糖的骨架结构，能够对该多糖的一级结构准确鉴定，明确齿瓣石斛中的主要多糖为乙酰基葡甘露聚糖。

权利要求

1.一种分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，其特征在于将水提醇沉粗多糖先用分步醇沉方法进行分离，然后经凝胶柱纯化，得到齿瓣石斛的均一多糖；

其中，采用分步醇沉方法进行分离包括：将粗多糖复溶于水，加酒精至50％进行乙醇醇沉，得到沉淀物，将该沉淀物去除，继续加酒精至体系酒精70％，得到絮状沉淀，该絮状沉淀为50-70％醇沉粗多糖片段；

凝胶柱纯化包括：将50-70％醇沉粗多糖片段复溶于水，用凝胶柱进行纯化，用硫酸苯酚法跟踪监测收集，蒸发浓缩，透析，冷冻干燥，得到凝胶柱分离纯化过的均一多糖；

通过核磁分析推断所提纯齿瓣石斛均一多糖的糖苷键→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值为：1.46:1.74:1.00，齿瓣石斛中的主要多糖为乙酰基葡甘露聚糖；

所述均一多糖的分子量为1.94×105Da；

其单糖摩尔比组成为：甘露糖:葡萄糖＝0.77:0.23。

2.如权利要求1所述分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，其特征在于，所述50-70％醇沉粗多糖片段的纯度在90％以上。

3.如权利要求1所述分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，其特征在于采用superdex-

200凝胶柱进行纯化；收集对称峰33-45管；采用旋转蒸发仪浓缩，浓缩时间40-80分钟。

4.如权利要求1所述分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，其特征在于水提醇沉粗多糖包括：将齿瓣石斛在水中煎煮，并进行固液分离，所得液体为水提液；向水提液中加入乙醇醇沉，使体系内乙醇浓度为70％-80％，得到粗多糖。

说明书

齿瓣石斛均一多糖的分离纯化及一级结构鉴定方法

技术领域

[0001] 本案涉及石斛多糖领域，尤其涉及一种分离纯化齿瓣石斛多糖的方法，以及对该多糖进行一级结构鉴定的方法。

背景技术

[0002] 多糖是重要的生物活性大分子，有提高免疫力、抗炎、延缓衰老、抗氧化等功效。多糖所链接的大量亲水性羟基，使其具有强吸水性、乳化性、高黏度性。

[0003] 石斛为九大仙草之首，齿瓣石斛多糖有较好的提高免疫力、抗肿瘤等功效，其多糖含量丰富，高达35-42％。前期通过实验发现，齿瓣石斛多糖与灵芝多糖相比，其抗肿瘤、提高免疫力功效更为显著。目前石斛多糖的提取方法主要是采用水提法、回流提取法、超声波/微波提取法、酶提取法、超高压提取法等。但由于齿瓣石斛多糖粘性高，高活性多糖段分子量大，在分离纯化以及结构解析方面存在一定难度。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，利用水提醇沉分离、凝胶柱纯化等手段，能够得到齿瓣石斛的均一多糖。

[0005] 本发明的另一个目的，采用多光谱解析鉴定了齿瓣石斛均一多糖的骨架结构。

[0006] 为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 分离提纯齿瓣石斛均一多糖的方法，将水提醇沉粗多糖先用分步醇沉方法进行分离，然后经凝胶柱纯化，得到齿瓣石斛的均一多糖。

[0008] 其中采用分步醇沉方法进行分离包括：将粗多糖复溶于水，加酒精至50％进行乙醇醇沉，得到沉淀物，将该沉淀物去除，继续加酒精至体系酒精70％，得到絮状沉淀，该絮状沉淀为50-70％醇沉粗多糖片段。50-70％醇沉粗多糖片段的纯度在90％以上。

[0009] 采用凝胶柱纯化包括：将50-70％醇沉粗多糖片段复溶于水，用凝胶柱进行纯化，用硫酸苯酚法跟踪监测收集，蒸发浓缩，透析，冷冻干燥，得到凝胶柱分离纯化过的均一多糖。其中优选采用superdex-200凝胶柱进行纯化；优选收集对称峰33-45管；优选采用旋转蒸发仪浓缩，浓缩时间40-80分钟。

[0010] 水提醇沉粗多糖可采用如下工艺：将齿瓣石斛在水中煎煮，并进行固液分离，所得液体为水提液；向水提液中加入乙醇醇沉，使体系内乙醇浓度为70％-80％，得到粗多糖。

[0011] 本发明还提供了一种齿瓣石斛均一多糖的一级结构鉴定方法：

[0012] 首先用HPGPC分析仪器、高效液相色谱仪、蒸发光散射检测器ELSD测定均一多糖的分子量为1.94×105Da；

[0013] 然后将均一多糖甲基化衍生，利用气相色谱-质谱联用仪与单糖标准品对照，测定单糖组成；单糖组成中甘露糖:葡萄糖的摩尔比为0.77:0.23；

[0014] 最后通过核磁分析推断糖苷键→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值为：1.46:1.74:1.00。核磁谱图结构分析如下：

[0015] 根据碳谱信号，石斛多糖的异头碳信号峰为δ101.3，通过de pt135图谱，可以确定C6的信号峰为δ61.7；C2，C3，C4，C5的化学位移分布在δ70～80ppm区域内；δ77.76信号峰应归属于C4，由此推测出石斛多糖的链接方式可能为1,4-Man；

[0016] 另外，在δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信号峰，应归属于乙酸根的甲基和羰基信号，由此推断在石斛多糖的多糖结构中，C2，C3对应的羟基可能由乙酸根取代；

[0017] 在HSQC图谱中可以看出，葡萄糖糖苷的异头碳信号峰应分布在101.2/4.7，而C4信号峰应为79.1/4.07，其它C6的化学位分布着61-62.3ppm，C2，C3，C5的化学位移应分布在70-77ppm之间，由此推断石斛多糖存在→4)-Glc-(1→糖苷键；

[0018] 对碳谱的δ99-103，δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信号峰进行积分，可以得到三个峰信号的积分比值为：1.02:1.12:3.22，由于δ99-103为异头峰区域，积分值应为→4)-man-(1→，→4)-2-o-acetyl-man-(1→和→4)-Glc-(1→糖苷键的总和，而δ20.3-21.0和δ172.9-173.9为→4)-2-o-acetyl-ma n-(1→糖苷键的特殊信号峰，且比值(1.02:1.12:)接近于1:1，而甘露糖和葡萄糖的比例为0.77:0.23，因此可以推断出糖苷键→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值应为：1.46:0.74:1.00。

[0019] 通过上述方法能够纯化得到纯净的均一多糖，分步醇沉完全可以代替纤维素柱分离，达到良好的效果，节省资源，省时省力；并且能够对该多糖的一级结构准确鉴定，明确齿瓣石斛中的主要多糖为乙酰基葡甘露聚糖。

附图说明

[0020] 图1是样品HPGPC图；

[0021] 图2是单糖标准品谱图；

[0022] 图3是样品单糖组成图；

[0023] 图4是样品1H NMR谱图；

[0024] 图5是样品13C NMR谱图；

[0025] 图6是样品HSQC谱图。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例和相关附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0027] 实施例1：通过以下步骤分离提纯齿瓣石斛均一多糖：将齿瓣石斛在水中煎煮，并进行固液分离，得到水提液；在水提液中加入乙醇醇沉使体系内乙醇浓度为70％，静置过夜，得到粗多糖；将粗多糖复溶于水，使多糖完全溶解于水中，加酒精至50％进行乙醇醇沉，得到沉淀物，将该沉淀物去除，继续加酒精至体系酒精70％，得到90％以上纯度的50-70％醇沉粗多糖片段；将粗多糖片段复溶于水，用superdex-200进行纯化，用硫酸苯酚法跟踪监测收集，收集对称峰33-45管，采用旋转蒸发仪浓缩50分钟，透析，冷冻干燥，得到凝胶柱分离纯化过的均一多糖。

[0028] 实施例2：通过以下步骤分离提纯齿瓣石斛均一多糖：将齿瓣石斛在水中煎煮，并进行固液分离，得到水提液；在水提液中加入乙醇醇沉使体系内乙醇浓度为80％，静置过夜，得到粗多糖；将粗多糖复溶于水，使多糖完全溶解于水中，加酒精至50％进行乙醇醇沉，得到沉淀物，将该沉淀物去除，继续加酒精至体系酒精70％，得到90％以上纯度的50-70％醇沉粗多糖片段；将粗多糖片段复溶于水，用superdex-200进行纯化，用硫酸苯酚法跟踪监测收集，收集对称峰35-42管，采用旋转蒸发仪浓缩50分钟，透析，冷冻干燥，得到凝胶柱分离纯化过的均一多糖。

[0029] 实施例3：通过以下步骤对所得均一多糖进行结构解析：

[0030] 分子量测定：用HPGPC分析仪器、高效液相色谱仪(美国A gilent1100series)、蒸发光散射检测器ELSD测定，将样品配制成2mg/ml，进样量10ul。图1是所得样品的HPGPC图。以不同相对分子质量的葡聚糖(Mw1270，5220，11600，48600，80900，147600，273000，
409800)作为标准品，做出标准曲线，测定多糖的纯度及相对分子质量，最终得到均一多糖
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分子量为1.94×10Da。

[0031] 单糖组成测定：将均一多糖甲基化衍生，利用气相色谱-质谱联用仪与单糖标准品对照，其中单糖标准品谱图见图2，样品单糖组成图见图3，通过两图对照，得甘露糖:葡萄糖(摩尔比)为：0.77:0.23。

[0032] 均一多糖甲基化衍生的具体工艺为：将多糖2mg用1ml的2M三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干，加入2ml甲醇，蒸干，反复2次。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，加入甲醇3ml，反复3次，旋蒸至粉末，110度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化。100℃反应1h，冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容至10mL待GC-MS分析。

[0033] 核磁分析：推断出糖苷键→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值应为：1.46:1.74:1.00。结合图4-6，具体的核磁谱图结构分析如下：

[0034] 根据图5的碳谱信号，石斛多糖的异头碳信号峰为δ101.3，通过dept135图谱，可以确定C6的信号峰为δ61.7。C2，C3，C4，C5的化学位移分布在δ70～80ppm区域内。δ77.76信号峰应归属于C4，由于O-在C4发生取代而导致向低场迁移。因此，可以推测出石斛多糖的链接方式可能为1,4-Man。

[0035] 另外，在δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信号峰，应归属于乙酸根的甲基和羰基信号。因此可以推断，在石斛多糖的多糖结构中，C2，C3对应的羟基可能由乙酸根取代。

[0036] 由单糖组成结果可知，石斛多糖由甘露糖和葡萄糖组成(摩尔比为77:23)，由于葡萄糖占有的比例比较少，而在碳谱上很难观察到葡萄糖糖苷键的信号，而在图6的HSQC图谱中，可以勉强看到一些信号，葡萄糖糖苷的异头碳信号峰应分布在101.2/4.7，而C4信号峰应为79.1/4.07，其它C6的化学位分布着61-62.3ppm，C2，C3，C5的化学位移应分布在70-77ppm之间。因此，可以推断石斛多糖存在→4)-Glc-(1→糖苷键。

[0037] 采用bruker Topspin3.0软件，对碳谱的δ99-103，δ20.3-21.0和δ172.9-173.9有信号峰进行积分，可以得到三个峰信号的积分比值为：1.02:1.12:3.22，由于δ99-103为异头峰区域，积分值应为→4)-man-(1→，→4)-2-o-acetyl-man-(1→和→4)-Glc-(1→糖苷键的总和，而δ20.3-21.0和δ172.9-173.9为→4)-2-o-acetyl-man-(1→糖苷键的特殊信号峰，且比值(1.02:1.12:)接近于1:1，而甘露糖和葡萄糖的比例为0.77:0.23，因此可以推断出糖苷键→4)-man-(1→，→4)-Glc-(1→和→4)-2-o-acetyl-man-(1→的比值应为：1.46:0.74:1.00。