一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法

摘要

本发明涉及一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，包括如下步骤：步骤一、子实体残渣的处理，步骤二、桑黄残渣的超细粉碎以及步骤三、桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的提取，其中所述步骤一中采用的原料为子实体水提胞内多糖的残渣，所述步骤三采用水提醇沉工艺；所述制备方法还包括对桑黄子实体细胞壁活性粗多糖进行进一步纯化的步骤；本发明还涉及一种采用上述制备方法所得的桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的应用。与现有技术相比，本发明所述的制备方法采用桑黄子实体提取后的残渣为原料，实现了废弃物循环再利用；且本发明制备的活性粗多糖为稳定的大分子多糖，且其含量较高，具有很好的免疫活性。

权利要求

1.一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、子实体残渣的处理：将子实体水提胞内多糖的残渣用中药粉碎机粉碎，过筛；

加水常温浸泡后沸水反复提取，弃去水提液，以除去水溶性胞内多糖，将反复水提取后的桑黄残渣烘干，备用；

步骤二、桑黄残渣的超细粉碎：采用超微粉碎震动磨机将步骤一所得的桑黄残渣粉碎，过筛；

步骤三、桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的提取：将步骤二超微粉碎后的桑黄残渣中加入10-15倍重量的水，常温浸泡30-60min，加蒸馏水沸水浴提取1-3h，滤渣重复提取2-3次，合并提取液；在旋转蒸发仪上减压浓缩所述提取液至物料比为1:1.2-1.5，制备浓缩液；取浓缩液，8000-12000×g离心去除15-30min不溶性杂质，留取离心液；在离心液中加乙醇沉淀20h以上，分离沉淀物，使用与乙醇沉淀浓度相同的酒精对沉淀物进行反复洗涤，然后使用水溶解沉淀物，用8000-10000分子量透析袋透析2-4d，去除沉淀物中的小分子物质，最后对去除小分子物质的沉淀物进行冷冻干燥，以获得桑黄子实体细胞壁活性粗多糖；

其中，所述乙醇沉淀采用的酒精浓度为20％，制得的活性粗多糖的分子量为2500-

3500kDa；所述桑黄子实体细胞壁活性粗多糖主要为大分子葡聚糖；

其中，所述步骤二中超微粉碎震动磨机的操作时间为10～20min，操作温度为-10℃。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括对桑黄子实体细胞壁活性粗多糖进行进一步纯化的步骤。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中过筛的目数为20目，所述步骤二中过筛的目数为200目。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的含量在50％以上。

5.一种根据权利要求1所述的制备方法制备的桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的应用，其特征在于，所述应用为桑黄子实体细胞壁活性粗多糖在制备用于提高人或动物体的免疫力的制剂中的应用。

说明书

一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及食用菌加工领域，具体涉及一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法。

背景技术

[0002] 鲍氏针层孔菌(Phellinus baumii Pilat)，俗称桑黄，是一种多年生、黄褐色的珍贵的药用真菌，有“森林黄金”之美称。桑黄具有抗肿瘤、提高免疫、延缓衰老、护肝、镇痛等作用，已在功能食品和临床上得到广泛应用。

[0003] 作为珍稀药用真菌，桑黄的主要活性成分是多糖，目前国内外对桑黄多糖的研究和利用主要集中在水溶性胞内多糖及其抗癌效果，相关的制备工艺已有很多报道。但目前常规水提子实体胞内多糖的提取得率非常低，大概在1％-2％左右，大量的多糖还残留在子实体细胞壁中。水提胞内多糖后的桑黄残渣量非常可观，含有丰富的细胞壁多糖，这部分多糖通常没有继续提取利用而被丢弃，具有很大的研究价值，因此提取桑黄子实体细胞壁活性多糖是很好的发展方向；另一方面，目前国内外桑黄多糖的产品主要是常规水提醇沉得到的子实体胞内多糖，且多糖含量不高，仅为30％左右，分子量主要集中在几十万到一百万之间。

[0004] 中国专利CN103319618A公开了一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法，其包括步骤：培养菌丝体、菌丝体多糖的提取，其制备的多糖含量较低，具体为16～38％。

[0005] 因此，对子实体细胞壁中分子量在两百万以上的大分子多糖进行挖掘，有助于珍稀药用真菌资源的进一步开发利用。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，该制备方法简单，制备所得的活性粗多糖含量较高，分子量较大。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一方面，本发明提供一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，包括如下步骤：

[0009] 步骤一、子实体残渣的处理：将子实体水提胞内多糖的残渣用中药粉碎机粉碎，过筛。加水常温浸泡后沸水反复提取，弃去水提液，以除去水溶性胞内多糖。将反复水提取后的桑黄残渣烘干，备用。

[0010] 步骤二、桑黄残渣的超细粉碎：采用超微粉碎震动磨机将步骤一所得的桑黄残渣粉碎，过筛。

[0011] 步骤三、桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的提取：将步骤二超微粉碎后的桑黄残渣中加入水，常温浸泡，加蒸馏水沸水浴提取，滤渣重复提取，合并提取液；在旋转蒸发仪上减压浓缩提取液至物料比为1:1.2-1.5，制备浓缩液；取浓缩液离心去除不溶性杂质，留取离心液；在离心液中加乙醇沉淀，分离沉淀物，使用与乙醇沉淀浓度相同的酒精对沉淀物进行反复洗涤，然后使用水溶解沉淀物，用透析袋进行透析去除沉淀物中的小分子物质，最后对去除小分子物质的沉淀物进行冷冻干燥，以获得桑黄子实体细胞壁活性粗多糖。

[0012] 为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

[0013] 优选地，本发明所述的桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法还包括对桑黄子实体细胞壁活性粗多糖进行进一步纯化的步骤。

[0014] 优选地，所述步骤一中过筛的目数为20目，所述步骤二中过筛的目数为200目。

[0015] 优选地，所述步骤二中超微粉碎震动磨机的操作温度为-10℃，操作时间为10～20min，优选15min。

[0016] 优选地，所述步骤三的具体操作参数如下：将步骤二超微粉碎后的桑黄残渣中加入10-15倍重量的水，常温浸泡30-60min，加蒸馏水沸水浴提取1-3h，滤渣重复提取2-3次，合并提取液；在旋转蒸发仪上减压浓缩提取液至物料比为1:1.2-1.5，制备浓缩液；取浓缩液，8000-12000×g离心15-30min去除不溶性杂质，留取离心液；在离心液中加乙醇沉淀20h以上，分离沉淀物，使用与乙醇沉淀浓度相同的酒精对沉淀物进行反复洗涤，然后使用水溶解沉淀物，用8000-10000分子量透析袋透析2-4d，去除沉淀物中的小分子物质，最后对去除小分子物质的沉淀物进行冷冻干燥，以获得桑黄子实体细胞壁活性粗多糖。

[0017] 优选地，所述乙醇沉淀采用的乙醇浓度为20％-80％，更优选乙醇浓度为20-60％，进一步优选乙醇浓度为20-25％。

[0018] 优选地，所述冷冻干燥的桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的含量在50％以上，更优选含量在65％以上，进一步优选含量在75％以上。

[0019] 优选地，所述桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的分子量为40k Da-3500k Da，更优选地在2000k Da以上。

[0020] 另一方面，本发明还提供一种含有所述桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的应用，所述桑黄子实体细胞壁活性粗多糖用于提高人或动物体的免疫力。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0022] 本发明所述的制备方法采用桑黄子实体提取后的残渣为原料，实现了废弃物循环再利用，有效节约了制备成本；本发明所述的制备方法工艺简单，增设超微粉碎步骤，使得残渣的粒度分布均匀，比表面积增大，在进行提取步骤时残渣与水的接触面积增大，有效提高了粗多糖的提取率；采用本发明所述的制备方法，其能获得稳定的大分子桑黄子实体细胞壁活性粗多糖，且活性粗多糖的含量较高，具有优良的免疫活性。

附图说明

[0023] 图1是根据本发明一实施例制备的桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的液相色谱图，其乙醇沉淀采用的乙醇浓度为20％。

具体实施方式

[0024] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

[0025] 实施例1

[0026] 本实施例为一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，其步骤如下：

[0027] 步骤一、子实体残渣的处理：将子实体水提胞内多糖的残渣用中药粉碎机粉碎，过20目筛。再加15倍的水提取，100℃提取3h，弃去水提液。反复此步骤9-10遍，以除去水溶性胞内多糖。将反复水提取后的桑黄残渣烘干，备用。

[0028] 步骤二、桑黄残渣的超细粉碎：采用超微粉碎震动磨机-10℃下将步骤一所得残渣粉碎15min，过200目筛。采用此步骤可将物料粉碎至数微米，其能使残渣的粒度分布均匀，比表面积增大，在进行提取步骤时残渣与水的接触面积增大，以利于大分子的细胞壁多糖的溶出，有效提高了粗多糖的提取率。

[0029] 步骤三、细胞壁多糖的提取：将步骤二超微粉碎后的残渣中加入15倍重量的水，常温浸泡60min，加蒸馏水沸水浴提取3h，滤渣重复提取2-3次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压提取液浓缩至物料比1:1.2，制备浓缩液；取浓缩液，10000×g离心30min去除不溶性杂质，留取离心液；取三份离心液分别加无水乙醇至酒精终浓度为20％、50％、70％，静止沉淀24h，然后采用10000×g离心20min分别分离出沉淀物；然后分别用对应酒精终浓度(即
20％、50％、70％)的乙醇分别反复洗涤对应的沉淀物，最后分别用去离子水洗对应的沉淀物，在水浴锅上进行乙醇的挥发，用8000分子量透析袋(MD34，截留分子量8000)分别透析
3d，去除小分子物质，采用冷冻干燥仪进行冷冻干燥分别得到桑黄细胞壁粗多糖。

[0030] 步骤四、总糖含量的测定：用硫酸-苯酚测定多糖含量，20％、50％、70％不同浓度的酒精醇沉制备的粗多糖中多糖含量分别为86.12％，53.18％，57.83％。

[0031] 实施例2

[0032] 本实施例为另一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，其步骤一、步骤二与实施例1相同，步骤三和步骤四如下：

[0033] 步骤三、细胞壁多糖的提取：将步骤二超微粉碎后的残渣中加入10倍重量的水，常温浸泡30min，加蒸馏水沸水浴提取1h，滤渣重复提取2-3次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压提取液浓缩至物料比1:1.5，制备浓缩液；取浓缩液，12000×g离心15min去除不溶性杂质，留取离心液；取离心液加无水乙醇至酒精终浓度为40％，静止沉淀30h，然后采用12000×g离心15min分离出沉淀物；然后用对应酒精终浓度(即40％)的乙醇反复洗涤沉淀物，最后用去离子水洗沉淀物，在水浴锅上进行乙醇的挥发，用10000分子量透析袋透析4d，去除小分子物质，采用冷冻干燥仪进行冷冻干燥分别得到桑黄细胞壁粗多糖。

[0034] 步骤四、总糖含量的测定：用硫酸-苯酚测定多糖含量，40％浓度的酒精醇沉制备的粗多糖中多糖含量为70.75％。

[0035] 实施例3

[0036] 本实施例为另一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，其步骤一、步骤二与实施例1相同，步骤三和步骤四如下：

[0037] 步骤三、细胞壁多糖的提取：将步骤二超微粉碎后的残渣中加入12倍重量的水，常温浸泡45min，加蒸馏水沸水浴提取2h，滤渣重复提取2-3次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压提取液浓缩至物料比1:1.3，制备浓缩液；取浓缩液，8000×g离心30min去除不溶性杂质，留取离心液；取离心液加无水乙醇至酒精终浓度为60％，静止沉淀22h，然后采用8000×g离心30min分离出沉淀物；然后用对应酒精终浓度(即60％)的乙醇反复洗涤沉淀物，最后用去离子水洗沉淀物，在水浴锅上进行乙醇的挥发，用9000分子量透析袋透析2d，去除小分子物质，采用冷冻干燥仪进行冷冻干燥分别得到桑黄细胞壁粗多糖。

[0038] 步骤四、总糖含量的测定：用硫酸-苯酚测定多糖含量，60％浓度的酒精醇沉制备的粗多糖中多糖含量为65.53％。

[0039] 实施例4

[0040] 本实施例为另一种桑黄子实体细胞壁活性粗多糖的制备方法，其步骤一、步骤二与实施例1相同，步骤三和步骤四如下：

[0041] 步骤三、细胞壁多糖的提取：将步骤二超微粉碎后的残渣中加入15倍重量的水，常温浸泡60min，加蒸馏水沸水浴提取3h，滤渣重复提取2-3次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压提取液浓缩至物料比1:1.5，制备浓缩液；取浓缩液，10000×g离心30min去除不溶性杂质，留取离心液；取离心液加无水乙醇至酒精终浓度为25％，静止沉淀24h，然后采用8000×g离心30min分离出沉淀物；然后用对应酒精终浓度(即25％)的乙醇反复洗涤沉淀物，最后用去离子水洗沉淀物，在水浴锅上进行乙醇的挥发，用10000分子量透析袋透析3d，去除小分子物质，采用冷冻干燥仪进行冷冻干燥分别得到桑黄细胞壁粗多糖。

[0042] 步骤四、总糖含量的测定：用硫酸-苯酚测定多糖含量，25％浓度的酒精醇沉制备的粗多糖中多糖含量为75.82％。

[0043] 实施例5

[0044] 采用HPSEC-MALLS-RI联用测定细胞壁多糖的分子量，本实施例采用实施例1中制备的桑黄细胞壁粗多糖作为样品，其乙醇沉淀采用的乙醇浓度分别为20％、50％、70％。

[0045] 样品前处理：称取2mg样品，溶解于1mL流动相中，配制成浓度2mg/mL的溶液。用12000×g离心10min后取上清液，经0.25μm的水相微孔膜过滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析。

[0046] 分析柱选TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝胶色谱柱串联后分析，流动相为含0.05mol/L的NaH2PO4和0.15mol/L的NaNO3溶液(pH＝7，0.02％叠氮钠)，流速为0.5mL/min，色谱柱温用柱温箱恒定在35℃；激光检测器光源波长选用623.8nm。多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。

[0047] 使用Astra(version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量。20％、50％、70％不同浓度的酒精醇沉制备得到的粗多糖中分子量段分别集中在2500-3500kDa，300-600kDa，40-80kDa之间。如图1所示，20％的酒精醇沉制备得到细胞壁粗多糖主峰分子量为Mw＝3159kDa，其为超微粉碎过程中溶出的大分子的细胞壁多糖。

[0048] 实施例6

[0049] 对桑黄细胞壁多糖体外免疫活性的研究，本实施例采用实施例1中制备的桑黄细胞壁粗多糖，其乙醇沉淀采用的乙醇浓度分别为20％、50％、70％。

[0050] 测定细胞壁粗多糖的免疫活性，主要进行体外刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO量的试验。

[0051] NO在体内很容易被氧化，并且形成亚硝酸盐，Griess法测定培养上清液中亚硝酸盐的浓度，可以间接反映巨噬细胞NO释放量。

[0052] 具体操作步骤：取出超低温冰箱冻存的细胞，1000rpm离心3min，去除冻存液，收集细胞，平均分配到装有DMEM完全培养基的小培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，定期换液，待细胞覆盖培养瓶瓶底80～90％时，用37℃加热的0.25％胰酶溶液消化，消化液于1000rpm离心3min，收集细胞，用无色1640完全培养基将细胞稀释至5×105个/mL,计算好所需孔数，向96孔细胞培养板中每孔加入180μL细胞稀释液，然后加入20μL待测样品，每个样品浓度设置3个复孔，以LPS(10μg/mL)为阳性对照，PBS为阴性对照，将96孔板置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养48h，然后吸取每孔上清液100μL，加入50μL Griess试剂，放置10min，543nm测定吸光度值。

[0053] 结果表明，100ug/ml的酒精终浓度为20％、50％、70％醇沉得到桑黄子实体细胞壁粗多糖刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO量分别为46.05％、30.16％、45.16％。最终选取20％的酒精终浓度进行醇沉，获得的粗多糖活性较好，接近阳性对照LPS的释放量50.14％，且分子量大。

[0054] 实施例7

[0055] 对桑黄细胞壁多糖单糖组成成分的分析，本实施例采用实施例1中制备的桑黄细胞壁粗多糖，其乙醇沉淀采用的乙醇浓度分别为20％、50％、70％。

[0056] 样品前处理：取桑黄细胞壁粗多糖样品，用万分之一天平准确称取2mg左右于具塞试管中，按照(3mL：2mg)的比例加入2mol/L的TFA，110℃水解4h，冷却，用旋蒸仪低温减压蒸干水解液，接着加入3mL甲醇，减压蒸干，重复操作4-5次，以除去残留的三氟乙酸，将水解产物用去离子水清洗定容至50mL，上样量为20μL，以单糖标准品Gal，Glu，Ara，Fuc，Rha，Man，Xyl，Fru，Rib，GluA和GalA为对照，用高效阴离子色谱(HPAEC)测定单糖的组成和摩尔比。

[0057] 结果表明，桑黄子实体细胞壁粗多糖的主要单糖组成成分为葡萄糖、岩藻糖和葡萄糖醛酸，且单糖组分摩尔比为19.70：2.52：1.00，由上可知桑黄子实体细胞壁粗多糖主要为大分子葡聚糖。

[0058] 对比例1

[0059] 中国专利CN103319618A公开了一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法，其通过桑黄菌丝体的培养，然后进行水提取+乙醇沉淀的方法制备多糖，多糖种类包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，其最终检测的多糖含量为16.10％～37.83％。

[0060] 对比例2

[0061] 中国专利CN105542030A公开了一种从桑黄子实体中提取水溶性β葡聚糖的方法，其通过碱液提取+乙醇沉淀的方法制备桑黄粗多糖，并通过酸水解+水复溶的方法提取桑黄β水溶性多糖，其最终检测的多糖含量为50％以上，具体为58％-65％，平均分子量为2000-200000道尔顿(即20-200k Da)。

[0062] 实施例1与对比例1、对比例2的多糖含量、平均分子量及多糖类型对比如下表所示：

[0063]

[0064] 通过上述对比可知，本发明所制备的桑黄粗多糖含量明显高于对比例1，其高值86％远高于对比例2的65％；本发明所制备的桑黄粗多糖分子量也相对高于对比例1和对比例2，三者制备的多糖类型也不相同。

[0065] 由上述实施例和对比例可知，本发明所述的制备方法采用桑黄子实体提取后的残渣为原料，实现了废弃物循环再利用；本发明所述的制备方法对子实体细胞壁中分子量在两百万以上的大分子多糖进行挖掘，有助于珍稀药用真菌资源的进一步开发利用，其所得的多糖含量在50％以上且可高达75％以上，其制备的多糖分子量在40-3500k Da之间，主要为稳定的大分子葡聚糖。

[0066] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。