一种降低植物组培培养基表面污染的方法

摘要

本发明公开了一种降低植物组织培养的培养基表面微生物污染的方法，属农林领域的植物组织培养技术。包括采用天然热可逆凝胶，凝胶与水混合加热成溶胶，灌注到已经高压灭菌的固体培养基表面，冷却形成一薄凝胶层，由于凝胶层不添加营养成分，附着在凝胶层表面的微生物无法繁殖，从而有效防止培养基表面的微生物污染。采用天然凝胶制备的凝胶层透气良好，不影响插入培养基内的植物组织呼吸代谢，环境友好，价格低廉，该方法操作简便，便于推广应用。

权利要求

1.一种降低植物组培培养基表面污染的方法，其特征在于：采用天然热可逆凝胶，与水加热得到溶胶，灌注到附加活性炭的固体培养基表面，厚度0.1-1cm,冷却形成一薄凝胶层，平放，自然冷却凝固；

所述的热可逆凝胶为琼脂、黄原胶、卡拉胶、结冷胶、LM型果胶或魔芋胶的一种或几种复配，其中琼脂用量0.2％-1.5％，黄原胶用量0.2-0.7％，卡拉胶用量0.2-0.7％，结冷胶用量0.1％-0.4％，LM型果胶用量0.1-1.0％，魔芋胶用量0.1％-0.7％；

所述的固体培养基附加活性炭量为0.05-0.5％，高压灭菌后平放，自然冷却凝固。

2.如权利要求1所述的降低植物组培培养基表面污染的方法，其特征在于：所述以热可逆凝胶制备溶胶时的促胶凝方法，卡拉胶附加0.003-0.06％的氯化钾或硝酸钾；结冷胶附加0.02-0.04％的氯化钙或硝酸钙；LM型果胶附加0.01-0.03％的氯化钙或硝酸钙；魔芋胶调pH至大于8。

3.如权利要求1所述的降低植物组培培养基表面污染的方法，其特征在于：用于灌注的溶胶因自然冷却凝滞时，加热溶化，继续灌注到固体培养基。

说明书

一种降低植物组培培养基表面污染的方法

技术领域

[0001] 本发明属农林领域的植物组织培养技术，具体涉及降低植物组织培养的培养基表面微生物污染的方法。

背景技术

[0002] 植物组织培养技术在种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。微生物污染(外植体自身污染和培养基污染)导致组培苗生长缓慢，甚至死亡，污染是影响组织培养成功和规模化生产苗木的主要因素。

[0003] 在组培的外植体诱导阶段，微生物污染主要原因往往是外植灭菌消毒不彻底所致。但在继代培养和生根培养中的污染，给组培苗生产带来的损失更大，这两阶段的污染主要由两方面原因造成，一是植物材料内部带菌(简称内生菌)引起污染，但最常见的是不确定的环境微生物所致的培养基表面污染，其原因有(1)搬运、晃动培养瓶基(瓶)，瓶内空间微生物沉降到培养基表面造成污染。(2)培养瓶虽经高压灭菌，但经过长期选择出现一些抗高压高温的细菌芽孢子，残留于瓶内壁及瓶盖内面上，当培养基高压灭菌后瓶内壁聚集冷凝水，会连带这些芽孢流到培养基表面而造成培养基污染。(3)在瓶内长期培养的芽苗等繁殖体表面往往附着较多微生物，当芽苗转接到新鲜培养基时，附着的微生物被抖落到培养基表面，也造成培养基污染。

[0004] 目前，降低培养基污染的常规方法有：严格按照技术规程进行接种操作，接种室定期灭菌消毒，定期更换清洗超净台空气过滤网，注意培养室整洁卫生及温湿度调控等，如专利申请号：2 0 0 4 1 0 0 5 3 5 1 6.9。非常规方法是在培养基添加抗菌剂，如申请号：201410015541.1在培养基添加茶多酚，申请号：01310184747.2在培养基添加洋葱、螃蟹壳粉，申请号：201610140530.5在培养基添加羧化壳聚糖、抗生素、恶霉灵、乌洛托品、霜霉威盐酸盐。申请号：201010142886.5应用乙蒜素、链·土霉素、氨基寡糖素水剂、ClO2、过氧乙酸、次氯酸钠或三氯异氰尿酸。采用添加抗菌剂的技术关键是能有效抑制培养基微生物污染，且对瓶内植物培养物生长发育没有明显负作用，由于不同植物生长发育对抗菌剂的敏感性不同，上述专利介绍的抗菌剂是否普遍适用于其他植物还不得而知，所以，在培养基添加抗菌剂的污染防控方法并没普遍应用。

发明内容

[0005] 本申请的主要目的在于提供一种降低植物组培培养基污染的方法，采用天然热可逆水凝胶，具有与植物组织相容性好，环境友好，价格低廉的优点，凝胶与水混合加热融化，灌注到已经高压灭菌的固体培养基表面，冷却形成一薄凝胶层，该凝胶层透气良好，不影响插入培养基内的植物组织(根)细胞呼吸代谢，此外,在配制培养基时添加吸附剂活性炭，以避免或减轻培养基营养成分渗透到凝胶层。采用该技术方法降低培养基污染原理为：凝胶层在物理上阻隔培养基与瓶内空气的直接接触，由于凝胶层不添加营养成分，掉落在凝胶层表面的微生物无法繁殖，从而有效防止培养基表面的微生物污染。

[0006] 本发明提供的技术方案如下：

[0007] 一种降低植物组培培养基表面污染的方法，采用天然热可逆水凝胶，与水混合或直接投入温水，加热制备成水溶胶，高压灭菌，冷凝前在无菌环境灌注到含0.05-0.5活性炭的固体培养基(该培养基高压灭菌后平放凝固)，铺满培养基表面成0.1-1cm厚的溶胶层，冷却形成一薄凝胶层，然后常规接种。

[0008] 所述水凝胶原料为琼脂、卡拉胶、结冷胶、果胶、魔芋胶、黄原胶等热可逆水凝胶，一种单独使用或几种复配。其水溶胶制备方法分别为：琼脂用量0.2％-1.5％，与水煮成溶胶，黄原胶用量0.2-0.7％，与水煮成溶胶；卡拉胶、结冷胶、果胶、魔芋胶加入胶凝促进剂及水加热成溶胶，卡拉胶用量0.2-0.7％，胶凝促进剂为氯化钾或硝酸钾，终浓度0.003-0.06％；结冷胶用量0.1％-0.4％，胶凝促进剂为氯化钙或硝酸钙，终浓度为0.02-0.04％；
LM型果胶用量0.1-1.0％，胶凝促进剂为氯化钙或硝酸钙，终浓度0.01-0.03％；魔芋胶用量
0.1-0.7％，加碱液调pH大于8。

[0009] 如用于灌注的溶胶因自然冷却凝滞，可加热溶化，继续灌注培养基。

[0010] 本项技术在培养基表面制备凝胶层，对培养基起到阻隔保护作用，有效防止瓶内环境微生物所致的培养基污染。该方法成本低廉、操作简易，对植物生长没有毒副作用，且对所培养植物没有专一性，解决了培养基表面污染这一行业共性问题，具推广普及可行性。

具体实施方式

[0011] 实施例一

[0012] 1.常规方法制备培养基(对照)，配方为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+3％蔗糖，调pH5.8，培养基容器为反复使用过的玻璃瓶，常规高压消毒，冷却后可看见瓶内壁聚集冷凝水。

[0013] 2.处理组培养基配方同对照，即MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+3％蔗糖，附加0.1％活性炭，调pH5.8，培养基容器同对照(即为反复使用过的玻璃瓶)，高压消毒后放在平整桌面，自然冷却，可看见瓶内壁聚集冷凝水。0.8％的琼脂与水煮沸，装瓶高压灭菌成溶胶，用于制备凝胶层。

[0014] 3.在超净台吸取未冷凝琼脂溶胶,灌注到培养基表面成约0.2cm厚的溶胶层，培养瓶加盖，平放，自然冷却凝固。

[0015] 4.常规方法制备的培养基(对照)，由于瓶内壁冷凝水重力作用流到培养基表面，7天后在积水处长满细菌菌落，处理组培养基瓶内壁冷凝水虽然流到凝胶层表面，并没发现微生物污染，说明本申请技术能有效抑制培养基污染。

[0016] 实施例二

[0017] 1.常规方法制备培养基(对照)，配方为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+3％蔗糖+0.8％琼脂，调pH5.8，高压消毒。

[0018] 2.处理组培养基配方同对照，即MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+3％蔗糖+0.8％琼脂，附加0.2％活性炭，调pH5.8，高压消毒后放在平整桌面，自然冷却。制备凝胶层所用凝胶为0.3％卡拉胶加0.3％黄原胶，胶凝促进剂为0.05％的氯化钾，混合加水煮沸至完全融化，装瓶高压灭菌成溶胶。

[0019] 3.在超净台吸取未冷凝的溶胶,灌注到培养基表面成0.3cm厚的溶胶层，培养瓶加盖，平放，自然冷却凝固。

[0020] 4.接种长期继代的老化铁皮石斛瓶苗，叶片带菌，对照为常规方法制备的培养基，培养1个月，培养基表面污染率40％，采用本申请技术的培养基，培养1个月，培养基表面没有污染。对照组未被污染铁皮石斛苗长势(高度、叶数、颜色)与处理组没显著差异，说明本申请技术能有效抑制培养基污染。