茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP及其应用

摘要

本发明提供茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP及其在制备转基因植物中的应用。本发明以茶树DNA为模板，用Genome Walking方法克隆得到茶树TCS基因启动子序列，然后利用Gateway技术构建重组植物表达载体pKGWFS7‑TCSP，采用农杆菌介导的烟草遗传转化，以表达GUS基因的方式进行启动子活性功能验证。本发明首次从茶树中克隆出特异性咖啡碱合成酶基因启动子TCSP，并验证了其活性，对于揭示茶树咖啡碱合成的机理，生物调控茶树咖啡碱的含量具有重要意义。

权利要求

1.茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述启动子TCSP的表达盒。

3.含有权利要求1所述启动子TCSP的载体。

4.含有权利要求2所述表达盒或权利要求3所述载体的工程菌。

5.权利要求1所述启动子TCSP在调控下游基因表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，下游基因包括GUS。

7.权利要求1所述启动子TCSP在制备转基因植物中的应用，其中所述植物包括烟草。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用Gateway技术将启动子TCSP依次构建到入门载体和目的载体上，然后通过农杆菌介导的遗传转化法制备转基因植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于。所述入门载体和目的载体分别为pDONR221和pKGWFS7。

10.用于扩增权利要求1所述启动子TCSP的特异性PCR引物对，其特征在于，包括GTP1:

5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCAAAAACATAATCAAAACCAAAAC-3′和GTP2:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGATACAAATCAAACAAACACAAA-3′。

说明书

茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP及其应用。

背景技术

[0002] 咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是一种含氮化合物，茶树中的生物碱以嘌呤碱为主体，而咖啡碱又是构成嘌呤碱的主体，因此咖啡碱在茶树次生代谢中起到举足轻重的作用。咖啡碱不仅在植物体内能够保护植物免受自然环境的伤害，促进植物的生长，同时也是一种普遍，有一定药用价值的物质。适量的摄入咖啡碱可以健胃消食、利尿、降低高血压、提高记忆力、抗癌、降低II型糖尿病风险等；但过量的摄入会引起失眠、焦虑、骨质疏松和胎儿畸形等。因此，如何调控茶树中咖啡碱的合成对于茶树资源的高效利用有着重大意义。

[0003] 启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，绝大多数基因在调控表达上与其调控元件相关，而且呈现出空间性和时间性的特点。目前，植物基因工程研究的主要内容是基因的表达和调控，但外源基因表达量不足是不能理想获得转基因植物的重要原因。启动子在决定基因表达方面起着关键作用，因此研究植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP及其应用。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明根据GenBank中收录的茶树咖啡碱合成酶基因序列(AB031280.1)，设计引物，采用Genome Walking方法克隆出茶树咖啡碱合成酶基因启动子序列，扩增片段长度为1357bp，并命名为TCSP。本发明的茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP，其核苷酸序列为：

[0006] i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

[0007] ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

[0008] iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

[0009] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

[0010] 利用PlantCARE启动子在线分析其功能元件，分析结果见表1。

[0011] 表1茶树咖啡碱合成酶基因启动子顺式作用元件的生物功能学分析

[0012]

[0013]

[0014]

[0015] 本发明还提供含有茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP的表达盒。

[0016] 本发明还提供含有茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP的载体。

[0017] 本发明还提供含有上述表达盒或载体的工程菌、转基因细胞系。

[0018] 本发明还提供茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP在调控下游基因表达中的应用。

[0019] 其中，所述下游基因包括GUS等。

[0020] 本发明还提供茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP在制备转基因植物中的应用。

[0021] 其中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。优选地，所述植物包括烟草等。

[0022] 前述应用是利用Gateway技术将启动子TCSP依次构建到入门载体和目的载体上，然后通过农杆菌介导的遗传转化法制备转基因植物。

[0023] 优选地，所述入门载体和目的载体分别为pDONR221和pKGWFS7。

[0024] 本发明进一步提供用于扩增茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP的特异性PCR引物对，包括GTP1:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCAAAAACATAATCAAAACCAAAAC-3′和GTP2:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGATACAAATCAAACAAACACAAA-3′。

[0025] 本发明首次从茶树中克隆得到一种特异性咖啡碱合成酶基因启动子，并将其构建到植物表达载体中，在转基因植物中验证了该启动子的活性，对于揭示茶树咖啡碱合成的机理，生物调控茶树咖啡碱的含量具有重要意义。

附图说明

[0026] 图1为本发明实施例1中茶树基因组DNA检测结果；其中，M：DNA分子量标准，1-2：茶树基因组DNA。

[0027] 图2为本发明实施例1中茶树咖啡碱合成酶启动子GTP1和GTP2特异性引物PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准，1-2：PCR产物。

[0028] 图3为本发明实施例2中携带有重组载体pKGWFS7-TCSP的农杆菌PCR鉴定结果；其中，M：DNA分子量标准，1-3：带有重组载体pKGWFS7-TCSP的农杆菌(假阳性克隆)，4-10：带有重组载体pKGWFS7-TCSP的农杆菌(阳性克隆)。

[0029] 图4为本发明入门载体pDONR221的质粒图谱。

[0030] 图5为本发明目的载体pKGWFS7的质粒图谱。

[0031] 图6为本发明实施例2中转基因烟草叶片茶树咖啡碱合成酶基因启动子调控GUS基因表达的结果；其中，A：阴性对照(野生型烟草)；B：阳性对照(pKGWFS7空载体)；C：重组载体pKGWFS7-TCSP。

具体实施方式

[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0033] 实施例1茶树中咖啡碱合成酶基因启动子TCSP的克隆

[0034] 1.1提取基因组总DNA(Biomiga试剂盒)

[0035] (1)称取约0.2g舒茶早茶树嫩叶于预冷的研钵中，加适量的液氮研磨至粉末状。

[0036] (2)将粉末转移至2ml的离心管中，立即加入900μl Buffer P1和10μlβ-巯基乙醇，瞬时涡旋后置于65℃水浴锅中，水浴10min，期间颠倒混匀3-4次。(在水浴前加入5μl RNaseA)

[0037] (3)加入140μl Buffer P2，旋涡震荡混匀。在13000rpm下离心10min。

[0038] (4)小心吸取上清移至新的2ml离心管中，避免吸起沉淀，加入0.5倍体积的P3混匀后，加入混合液0.5倍体积的无水乙醇，充分颠倒混匀。

[0039] (5)将一个DNA吸附柱插入2ml收集管，将样品液加入吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。

[0040] (6)加入650μlDNA Wash Buffer(已加入乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。

[0041] (7)加入450μl DNA Wash Buffer漂洗，离心后倒掉废液将吸附柱重新插入收集管中。

[0042] (8)13000rpm开盖离心1min。

[0043] (9)将DNA吸附柱插入1.5ml离心管中，向吸附柱中加入100-150μl Elution Buffer(65℃预热)。室温静置2min，13000rpm离心1min。重复挂柱。

[0044] (10)电泳检测DNA的完整性：取1-2μl样品DNA点样，用1％的琼脂糖凝胶快速电泳30-40min，检测DNA完整性。使用核算定量仪检测样品DNA是否有污染，浓度404ng/μl，D260/
280(1.8-2.0)，D260/230(1.8-2.0)。将样品放入-20℃保存。茶树基因组DNA检测结果见图
1。

[0045] 1.2基因组DNA酶切及纯化

[0046] (1)基因组DNA酶切

[0047] 选用Stu I,Pvu II,EcoR V,Dra I四种限制性内切酶，分别对茶树基因组DNA进行酶切，酶切反应体系为：

[0048]

[0049] 上下轻轻颠倒均匀，37℃水浴2h后，慢速涡旋5-10s，37℃酶切过夜。

[0050] 酶切结束后，每个反应体系中取5μl在1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，若电泳呈均匀的涂抹状表示酶切完全。

[0051] (2)酶切产物的纯化

[0052] 1)在每个反应体系中加入等体积酚，慢速涡旋5-10s后，短暂离心使水相和有机相分离。

[0053] 2)用移液器将上层水相转移至一新1.5ml的离心管中，弃有机相。

[0054] 3)然后在每个离心管中加入等体积的氯仿，慢速涡旋5-10s后，短暂离心使水相和有机相分离。

[0055] 4)用移液器将上层水相转移至一新的1.5ml离心管中，弃有机相。

[0056] 5)在每个离心管中加入2倍体积预冷的95％乙醇，1/10体积的3M乙酸钠(pH4.5)，20g糖原，慢速涡旋5-10s后，15000rpm，离心10min.

[0057] 6)将上层液体慢慢倒出，加入预冷的80％乙醇100μl洗涤沉淀。

[0058] 7)15000rpm，离心5min，缓慢倒出上清后，室温干燥沉淀。

[0059] 8)用20μl TE(10mM Tris，0.1mM EDTA，pH7.5)溶解沉淀。

[0060] 9)慢速涡旋5-10s后，各取1μl在1％的琼脂糖凝胶上样检测纯化后的DNA质量。

[0061] 1.3接头与酶切产物的连接

[0062] 反应体系需要建立4个连接反应，即茶树基因组DNA酶切产物分别与试剂盒所提供的接头相连接。具体操作步骤如下：

[0063] (1)从每个离心管中，各取4μl经过限制性内切酶Stu I，Pvu II，EcoR V，Dra I酶切和纯化的DNA分别到新的0.5ml的离心管中，然后依次加入：

[0064] BD Genomewalker Adaptor(25μM)  1.9μl

[0065] 10×Ligation Buffer            1.6μl

[0066] T4DNA Ligase(6Units/μl)        0.5μl

[0067] (2)16℃，连接过夜。

[0068] (3)70℃，5min，以终止反应。

[0069] (4)在每个管中，加入72μl TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)，慢速旋涡10-15s后,短暂离心后，分别得到DNA library-Stu I,DNA library-Pvu II,DNA library-EcoR V,DNA library-Dra I，置于-20℃冰箱待用。

[0070] 1.4特异性引物GSP1与GSP2的设计与合成

[0071] 在进行PCR扩增之前，要对咖啡碱合成酶(TCS)基因的已知cDNA序列进行分析和引物设计。在引物设计过程中，要保证特异性引物GSP1与巢式引物GSP2不能重叠，且所设计的特异性引物应尽可能的接近已知序列的5′端。同时，所设计的基因特异性引物应当有25-30个核苷酸长度，GC含量在40-60％之间，推荐的退火温度为67℃，并且基因特异性引物GSP1、GSP2分别与试剂盒(BD Genomewalker Universal Kit,Clontech,USA)提供的接头引物AP1、AP2配对良好。

[0072] 在保证以上原则的基础上，使用DNAStar和Primer Premier 5软件对Genbank上已经登录的茶树咖啡碱合成酶cDNA序列(AB031280.1)设计基因特异性引物GSP1和GSP2，并交由上海生工合成。引物序列分别为：

[0073] GSP1:5′-CACAACCCAAGTCCGCTGCGTTAAGA-3′

[0074] GSP2:5′-AACAACACTTCGTTCACCTTCCCCGC-3′

[0075] AP1:5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′

[0076] AP2:5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′

[0077] 1.5巢式PCR进行一次扩增

[0078] (1)标记四个PCR管，依据下面的加样量混合样品：

[0079]

[0080] 涡旋混匀，并短暂离心后，再加入模板，即各取2μl的DNA library-Stu I,DNA library-Pvu II,DNA library-EcoR V,DNA library-Dra I于上述PCR管中，短暂离心，使溶液集于管底。

[0081] (2)将四个混合体系置于PCR热循环仪中，使用下面的两步法进行PCR扩增。98℃预变性3min，按94℃30s，67℃30s，72℃95s，循环30次，再72℃15min，使用1.2％的琼脂糖凝胶上样检测PCR产物。

[0082] 1.6巢式PCR进行二次扩增

[0083] (1)取四个0.5ml离心管，分别取1μl上述PCR产物与49μl ddH2O于离心管中混匀并短暂离心，分别得到四个经稀释的PCR产物作为巢式PCR模板。

[0084] (2)标记四个PCR管，依据下面的加样量混合样品：

[0085]

[0086] 混合后，涡旋混匀，并短暂离心后，各取48μl混合液于四个PCR管中，再分别加入2μl上述经稀释的巢式PCR模板于上述PCR管中，短暂离心，使溶液集于管底。

[0087] (3)将四个混合体系置于PCR热循环仪中，使用下面的两步法进行PCR扩增。98℃预变性3min；94℃30s，67℃30s，72℃95s，循环30次；72℃15min，使用1.2％的琼脂糖凝胶上样检测PCR产物。

[0088] (4)将电泳结束后的特异性条带切胶，回收并进行连接，转化后送样至上海生工进行测序。

[0089] 1.7目的基因的连接转化

[0090] 取PCR纯化产物6.5μl，PMD18-T 0.5μl，SolutionⅠ混合均匀，放入16℃水浴过夜后放在冰上；将混合液加入25μl感受态中中，混匀，冰浴30min，每隔10min轻弹一次；42℃热激45s，立刻置于冰上3min。加入500μl LB液体培养基，200rmp 37℃，1h。取50-100μl均匀涂于含有AMP的固体LB上，放入37℃，过夜培养。

[0091] 1.8菌落PCR与阳性检测

[0092] 挑菌划线，培养5-6h，再挑菌进行菌落PCR。菌落PCR体系：rTaq mix 25μl，上下游引物各1μl，用牙签挑单菌落加入PCR管中混匀，加入ddH2O至50μl，离心混匀，混合液等量分装于四个PCR管中，短暂离心，使溶液集于管底。PCR程序：95℃3min预变性；98℃10s，67℃30s，72℃95s，循环30次；72℃15min。对PCR产物进行电泳检测并送到上海生工进行测序，选择搭接序列正确的单克隆。将含有目的基因的阳性菌落保菌并提质粒。将样品放入-20℃保存。

[0093] 1.9茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP的扩增

[0094] 根据克隆得到的启动子序列设计特异性引物GTP1和GTP2，验证空载体的引物为EGFP-C和EGFP-N：

[0095] GTP1:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCAAAAACATAATCAAAACCAAAAC-3′,[0096] GTP2:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGATACAAATCAAACAAACACAAA-3′[0097] EGFP-C:5′-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3′

[0098] EGFP-N:5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3′

[0099] PCR扩增

[0100] (1)标记一个PCR管，依据下面的加样量混合样品：

[0101]

[0102] 涡旋混匀，并短暂离心后，混合液等量分装于四个PCR管中短暂离心，使溶液集于管底。

[0103] (2)将四个混合体系置于PCR热循环仪中，按照以下程序进行PCR扩增。98℃预变性3min；94℃30s，73.5℃30s，72℃95s，循环30次；72℃15min，使用1.2％的琼脂糖凝胶上样检测PCR产物。检测结果见图2。

[0104] PCR扩增产物的长度为1357bp，将其命名为茶树咖啡碱合成酶基因启动子TCSP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。用PlantCARE启动子在线分析其功能元件，分析结果见表1。

[0105] 实施例2烟草转基因植株的构建及启动子活性的验证

[0106] 使用Gateway技术将启动子序列导入植物表达载体(pKGWFS7)中，构建重组植物表达载体，命名为pKGWFS7-TCSP，并采用农杆菌介导的烟草遗传转化法，通过表达GUS基因的方式进行启动子活性的功能验证。

[0107] 2.1载体构建及鉴定

[0108] (1)BP反应

[0109]

[0110] 体系置于25℃下温育过夜，反应后，加2μl 2μg/μl的Proteinase K在37℃下处理10min，再将BP反应产物(入门载体)转入50μl大肠杆菌Trans1-T1中，在含Kan的LB板上筛选，检测获得阳性单菌落后提取质粒并放入-20℃保存。

[0111] (2)LR反应

[0112]

[0113]

[0114] 体系置于25℃下温育过夜，反应后，加2μl 2μg/μl的Proteinase K在37℃下处理10min，再将反应产物转入50μl大肠杆菌Trans1-T1中在含Spec的LB板上筛选，检测获得阳性单菌落后提取质粒并放入-20℃保存。将构建得到的重组植物表达载体命名为pKGWFS7-TCSP。

[0115] 2.2将载体pKGWFS7-TCSP用电击法导入农杆菌

[0116] 取5μl的重组载体和空载(pKGWFS7)质粒加入50μl的EHA105农杆菌感受态中，混匀后冰浴30min，使用移液枪将混合液移至电击杯中，用电转仪在A9r模式下电击两次后，转移到1.5ml的离心管中，加入1ml LB，放入28℃摇床中200rpm，3h。2000rpm离心后，将900μl上清小心吸出，留100μl将离心管底部菌体充分打匀后，均匀涂在含有rif和Spec的LB平板上，28℃培育2-3天。挑单克隆菌划线，培养1-2天，再挑菌进行菌落PCR。将阳性单菌落进行摇菌并保存于-80℃。

[0117] 携带有载体pKGWFS7-TCSP的农杆菌PCR鉴定结果见图3。载体pDONR221和pKGWFS7的质粒图谱分别见图4和图5。

[0118] 2.3农杆菌注射渗透法转化烟草，烟草叶片GUS基因瞬时表达

[0119] (1)带有转化载体质粒的农杆菌和带有空载体的对照菌株在含50mg/L的LB平板上划线复苏，挑取单菌落在含相同抗生素的LB液体培养基中摇菌过夜，菌液浓度达到OD600值为0.8-1.2。

[0120] (2)菌液分别经6000rpm离心10min弃去LB培养基，菌体悬浮于1/2MS中，并添加乙酰丁香酮(As)至终浓度200μmol/L，悬浮液的浓度调整到OD600值为0.6-0.8左右，室温静置活化2h。

[0121] (3)用一次性注射器分别吸取菌液，在烟草叶片上将注射器压在叶片上部，以手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内菌液压送并渗透到叶片组织中，将整个叶片注射菌液。

[0122] (4)经注射的烟草植株在25℃，暗处理下培养2-3d。

[0123] (5)剪取注射叶片进行GUS组织化学染色检测，叶片材料使用直径为15mm的打孔器进行打孔，并置于GUS染色液中，染色16h。

[0124] (6)分别用70％、80％、90％无水乙醇脱色至叶绿素完全除去，观察对比有无GUS表达染色现象，记录并拍照，结果见图6。

[0125] 从图6可以看出，(A)阴性对照(野生型烟草)叶片上并没有呈现蓝色或蓝色斑点，而(B)阳性对照(含有pKGWFS7空载体)叶片上的圆圈部分以及实验组(C，含重组载体)整个叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色，表明该启动子基因具有活性。

[0126] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。