高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法

摘要

本发明公开了一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：合成依次由里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn‑LVK基因序列和里氏木霉甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；将表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；将重组表达质粒和pAN7‑1载体轻轻混匀，共转里氏木霉原生质体，经筛选得到高产热稳定性木聚糖酶xyn‑LVK的里氏木霉基因工程菌。本发明中木聚糖酶xyn‑LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn‑LVK在毕赤酵母中的表达相比，木聚糖酶xyn‑LVK的产量提升约40%。

权利要求

1.一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉 cbh1 信号肽序列、木聚 糖酶 xyn-LVK 基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；

（2）利用 PCR 技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶 EcoRI，XbaI 将所述表达框序列克隆至 pUC19 中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：上游引物： CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC，其中，下划线为 EcoRI酶切位点；下游引 物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG，其中，下划线为 XbaI 酶切位点；

（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DH5a，阳性转化子进行 DNA 测序， 测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；

（4）抽提所述重组表达质粒，将所述重组表达质粒和 pAN7-1 载体混匀，共转里氏木霉原 生质体，涂布于含抗生素的 PDA 固体平板上，进行培养；

（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的 PDA 固体平板上长孢子；

（6）用无菌水制备孢子悬液，取孢子接种于基本培养基中培养 48 小时后转接到产酶培养

基中培养 196 小时；取菌液离心，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性 的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶 xyn-LVK 的里氏木霉基因工程菌； 其中，所述木聚糖酶 xyn-LVK 的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示，所述木聚糖酶基因 xyn-LVK 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉 cbh1 信号肽序列、木聚 糖酶 xyn-LVK 基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；

（2）利用 PCR 技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶 EcoRI ，XbaI 将所述表 达框序列克隆至 pUC19 中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：上游引物： CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC，其中，下划线为 EcoRI 酶切位点；下游引 物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG，其中，下划线为 XbaI 酶切位点；

（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，阳性转化子进行 DNA 测序， 测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；

（4）抽提所述重组表达质粒，将 10 微克的所述重组表达质粒和 10 微克的 pAN7-1 载体混 匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于 5 个含抗生素的 PDA 固体平板上，28℃培养两天，待 平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的 PDA 固体平板上，28℃培养五天；

（5）将长出的转化子接种于不含抗生素的 PDA 固体平板上长孢子；

（6）用无菌水制备孢子悬液，取 105 个孢子接种于 30ml 的基本培养基中，28℃，250 r/min 培养 48 小时后取 1.5ml 菌液后转接到 30ml 的产酶培养基中，28℃，250 r/min 培养 196 小 时；取菌液，12,000×g 离心 5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶 xyn-LVK 的里氏木霉基因工程菌。

说明书

高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法。

背景技术

[0002] 丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）的表达系统是用于同源和异源基因重组表达的重要工具，在许多方面优于原核表达系统和酵母表达系统。一方面，大肠杆菌表达系统在表达异源蛋白时易形成包涵体，并且表达的酶活性比较低及缺乏糖基化修饰等。另一方面，酵母表达系统存在着过度糖基化和蛋白折叠问题，会影响所表达酶的活性。相比较而言，里氏木霉是表达同源和异源蛋白的理想宿主。首先，里氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如高甘露糖型和N-糖基化等。其次，里氏木霉易于培养，而且培养成本低，培养体积即使达到230m3，里氏木霉的发酵性质保持良好而且不容易受到污染。里氏木霉还被认为是安全的产品生产者，因为它在酶产品生产所需的环境条件下没有致病性和不会产生真菌毒素和抗生素。由于里氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对里氏木霉的遗传改造，为同源或异源蛋白的高效生产提供了一条行之有效的途径。

[0003] 木聚糖酶在许多工业中被广泛应用，如饲料行业、造纸行业和食品行业。然而，在这些应用中，往往需要酶具有良好的耐热性，宽广的pH和较高的比活。所以，人们不断去寻找新的具有优良性能的可用木聚糖酶，并通过随机突变或者理性设计方法来提高它的性能。其中，来源于瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）的木聚糖酶催化结构域xyn-CD，通过易错PCR将其随机突变得到的重组木聚糖酶Xyn-CDBFV拥有较高的酶活、较宽的pH和良好的耐热性。因此，重组木聚糖酶Xyn-CDBFV在工业产品中具有广泛的应用前景。目前，Cheng, Y.S等详细解析了该蛋白的结构，并结合实验提出了该蛋白的耐热因素。（Cheng，Y.S. et al.（2014）Structural Analysis of a Glycoside Hydrolase Family 11 Xylanase from Neocallimastix patriciarum: Insights into the Molecular Basis of a Thermophilic Enzyme. J. Biol. Chem. ）。Xyn-CDBFV具有11家族木聚糖酶典型的β-jelly-roll折叠结构，但是Xyn-CDBFV具有延伸出来的N端结构域（N-terminal region，NTR），这在11家族木聚糖酶结构中是罕见的。NTR是依靠堆积相互作用、氢键和一个二硫键稳定的附着在Xyn-CDBFV的催化中心，而不是做为一个灵活的片段自由的悬挂在外面。Cheng，Y.S等的研究表明：仅删除由11个氨基酸组成的NTR后，Xyn-CDBFV突变株的酶活在55℃和75℃分别降为原来的61.5%和19.5%；仅删除由NTR和催化中心形成的二硫键后，Xyn-CDBFV突变株的酶活在55℃和75℃分别降为原来的86.8%和23.3%。由此可见，NTR在该酶热稳定性中有着重要作用，尤其是NTR和催化中心形成的二硫键更是起着关键作用，在二硫键的作用下，NTR像个夹子一样夹住催化中心，使它在高温下能稳定。

[0004] 中国专利CN 102757947公开了一种热稳定性改良的木聚糖酶Xyn-CDBFV-m及其基因，其中，对木聚糖酶Xyn-CDBFV的改良之一是将33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分别替换为半胱氨酸，并称其是在木聚糖酶Xyn-CDBFV的N端引入二硫键。但随着Cheng，Y.S等解析了木聚糖酶Xyn-CDBFV蛋白的晶体结构，发现其NTR仅由11个氨基酸组成，因此，对于中国专利CN 102757947中公开的的N端引入二硫键提高木聚糖酶Xyn-CDBFV的热稳定性的结果值得怀疑，因为33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸并非位于木聚糖酶Xyn-CDBFV的N端结构域。

[0005] 目前，众多学者进行里氏木霉中表达木聚糖酶的研究，但对于将木聚糖酶xyn-CDBFV进行了改造后得到的木聚糖酶在里氏木霉中表达以提升表达产量的研究还未见报道。

发明内容

[0006] 本发明提供一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，将改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn-LVK在毕赤酵母中的表达相比，产量显著得升，木聚糖酶xyn-LVK的产量提升约40%。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种高产热稳定性木聚糖酶的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：

[0008] （1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；

[0009] （2）将所述表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；

[0010] （3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；

[0011] （4）抽提所述重组表达质粒，将所述重组表达质粒和pAN7-1载体混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于含抗生素的PDA固体平板上，进行培养；

[0012] （5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子；

[0013] （6）用无菌水制备孢子悬液，取孢子接种于基本培养基中培养48小时后转接到产酶培养基中培养196小时；取菌液离心，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌；

[0014] 其中，所述木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0015] 木聚糖酶xyn-CDBFV的改造如下：通过Disulfide by Design软件对xyn-CDBFV上的二硫键进行了在线分析预测。经分析，存在26个可以形成二硫键的潜在位点。它们分别是：4位/172位；7位/217位；7位/218位；11位/45位；28位/65位；29位/42位；50位/60位；55位/58位；57位/204位；61位/198位；70位/74位；83位/172位；83位/218位；91位/208位；95位/117位；95位/118位；97位/115位；100位/200位；102位/195位；129位/145位；131位/143位；141位/164位；176位/179位；184位/189位；199位/219位；205位/208位。其中，NTR和催化中心之间除了已形成的4位/172位二硫键外，还有7位/217位和11位/45位可以设计形成二硫键。结合预测结果，理性的在NTR和催化中心之间设计引入7位/217位和11位/45位二硫键，这样在木聚糖酶xyn-LVK中，NTR和催化中心之间将有三个二硫键，它们使NTR这个“夹子”更稳固的夹住催化中心，使木聚糖酶xyn-LVK在高温下更加稳定。木聚糖酶xyn-CDBFV通过改造后得到木聚糖酶xyn-LVK，木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0016] 所述SEQ ID NO.1的序列如下：

[0017] QSFCSSCSHSCQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYScGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFcYAKVYIGD。

[0018] 所述SEQ ID NO.2的序列如下：

[0019] CAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAA。

[0020] 所述的里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的序列如SEQ ID NO.3所示，为：

[0021] GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAA。

[0022] 所述的里氏木霉cbh1信号肽序列如SEQ ID NO.4所示，为：

[0023] ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT。

[0024] 所述的里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子如SEQ ID NO.5所示，为：

[0025] GTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。

[0026] 具体地，所述高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：

[0027] （1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；

[0028] （2）利用PCR技术扩增所述表达框序列，然后利用限制性内切酶EcoRI ，Xba 将所述表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；表达载体构建引物序列如下：

[0029] 上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下划线为EcoRI切位点），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下划线为，Xba 酶切位点）；

[0030] （3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；

[0031] （4）抽提所述重组表达质粒，将10微克的所述重组表达质粒和10 微克的pAN7-1载体混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于5个含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养两天，待平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养五天；

[0032] （5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子；

[0033] （6）用无菌水制备孢子悬液，取105个孢子接种于30ml的基本培养基中，28℃，250 r/min培养48小时后取1.5ml菌液后转接到30ml的产酶培养基中，28℃，250 r/min培养196小时；取菌液，12,000×g 离心 5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌；

[0034] 本发明的有益效果是：将改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在里氏木霉中表达后，与木聚糖酶xyn-LVK在毕赤酵母中的表达相比，产量显著提升，木聚糖酶xyn-LVK的产量提升约40%。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：

[0036] 本发明中，木聚糖酶的酶活检测方法参照《GB/T23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》。

[0037] 实施例：高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制备[0038] 一、实验条件

[0039] （1） 菌株与载体

[0040] 大肠杆菌E. coli Top10购自Invitrogen公司，里氏木霉QM9414购自美国模式菌种收藏中心（ATCC），pUC19、pMD19-T simple vector购自TaKaRa。质粒pAN7-1（带有真菌筛选标记潮霉素抗性基因hph和大肠杆菌筛选标记氨苄青霉素抗性基因Ap）。

[0041] （2）酶类及其他生化试剂

[0042] 各种DNA工具酶，DNA Marker，DNA胶回收纯化试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit）、DNA纯化试剂盒（Fragment Purification Kit Ver. 2.0）购自TaKaRa。T4 DNA连接酶购自Fermetas公司。其它生化试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

[0043] （3）培养基

[0044] LB培养基：用于培养大肠杆菌，含1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠；用NaOH调pH值至7.0；加1.5%（w/v）琼脂粉（固体培养基）。

[0045] 里氏木霉液体基本培养基：含100 mL/L Mandels营养液浓缩液，1.0 mL/L Mandels微量元素浓缩液，18 g/L无水葡萄糖，1.0 g/L蛋白胨，50 mL/L pH 4.5的1 mol/L的柠檬酸缓冲液，1.0-2.0 g/L吐温80。

[0046] Mandels 营养盐浓缩液配制：(NH4)2SO4：14 g/L，尿素：3 g/L，KH2PO4：20 g/L，CaCl2·2H2O：4 g/L（或CaCl2：3 g/L），MgSO4·7H2O：3 g/L，加水至1000 mL。

[0047] Mandels 微量元素浓缩液配制：FeSO4·7H2O：5 g/L，ZnSO4·7H2O：1.7 g/L(或ZnCl2：0.7 g/L)，CoCl2·6H2O：3.7 g/L（或CoCl2：2 g/L），MnSO4·H2O：1.6 g/L（或MnCl2：1.67 g/L，或MnSO4·7H2O：2.6 g/L），加水至1000 mL。

[0048] 1mol/L柠檬酸缓冲液配制：柠檬酸：210 g，加NaOH(纯度96%)约78 g，加水750 mL，冷却后加水至1000 mL。

[0049] PDA固体培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，2 %葡萄糖，1.5 % Agar。20%土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 mL，煮沸30 min，用三层纱布过滤，加入葡萄糖后定容。筛选里氏木霉转化子时加入终浓度为100 g/mL的潮霉素。

[0050] 产酶培养基：50 g/L黄豆饼粉，70 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，100 ml/L Mandels营养盐浓缩液，1 ml/L Mandels微量元素浓缩液，50 mL/L pH 4.5的1 mol/L的柠檬酸缓冲液，0.5 g/L吐温80，加水到1000 ml。

[0051] 二、高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌的制备方法如下：

[0052] （1）合成依次由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、里氏木霉cbh1信号肽序列、木聚糖酶xyn-LVK基因序列和里氏木霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子组成的表达框序列；表达框序列如下：

[0053] GACGCAGAAGAAGGAAATCGCCCCGCCGGTTCCGTAAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCACAGCCTTGGCCCTGGGCCTAGCCTTGCGCCTTGTTTGATGCAATCGGCGACATGTCGAATGCTGTAATTTTTTTTGTTTAGGTTCCCCTTTTCCTTTTGTGTTAATAATAATTCTCGAAGGGCGCTGATTTTGAAATTTGTCGGTGAGAGCCAAACGGATATACAGGCGCGGCTGATGAATAATGATGAATCGAGCTGACTTGATGCTGTATGTACAATATTGACTGCGAGGACCATCAGGTGTTGTATGGATGGAATCATTCTGTAACCACCAAGGTGCATGCATCATAAGGTATTCTCCTCAGCTCACCAACAACGAACGATGGCCATGTTAGTAAAGGCACCGTGATGGCAAGATAGAACCACTATTGCATCTGCGCTTCCCACGCACAGTACGTCAATGTAACGTCAAAGCCGCCCTCCCGTAACCTCGCCCGTTGTTGCTCCCCCCGATTGCCTCAATCACATAGTACCTACCTATGCATTATGGCGCCTCAACCCACCCCCCCAGATTGAGAGCTACCTTACATCAATATGGCCAGCACCTCTTCGGCGATACATACTCGCCACCCCAGCCGGGGCGATTGTGTGTACTAGGTAGGCTCGTACTATACCAGCAGGAGAGGTGCTGCTTGGCAATCGTGCTCAGCTGTTAGGTTGTACTTGTATGGTACTTGTAAGGTGGTCATGCAGTTGCTAAGGTACCTAGGGAGGGATTCAACGAGCCCTGCTTCCAATGTCCATCTGGATAGGATGGCGGCTGGCGGGGCCGAAGCTGGGAACTCGCCAACAGTCATATGTAATAGCTCAAGTTGATGATACCGTTTTGCCAGGATTAGGATGCGAGAAGCAGCATGAATGTCGCTCATCCGATGCCGCATCACCGTTGTGTCAGAAACGACCAAGCTAAGCAACTAAGGTACCTTACCGTCCACTATCTCAGGTAACCAGGTACTACCAGCTACCCTACCTGCCGTGCCTACCTGCTTTAGTATTAATCTTTCCACCTCCCTCCTCAATCTTCTTTTCCCTCCTCTCCTCTTTTTTTTTTCTTCCTCCTCTTCTTCTCCATAACCATTCCTAACAACATCGACATTCTCTCCTAATCACCAGCCTCGCAAATCCTCAGGTTAGTATTACTACTACTACAATCATCACCACGATGCTCCGCCCGACGATGCGGCTTCTGTTCGCCTGCCCCTCCTCTCACTCGTGCCCTTGACGAGCTACCCCGCCAGACTCTCCTGCGTCACCAATTTTTTTCCCTATTTACCCCTCCTCCCTCTCTCCCTCTCGTTTCTTCCTAACAAACAACCACCACCAAAATCTCTTTGGAAGCTCACGACTCACGCAAGCTCAATTCGCAGATACAAAATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCACGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAAGTGCTGTGTTCCTCAGAATGGGCCCCAGAAGGGCGTCGAGCATTGTCTATGAATGCAAACAAAAATAGTAAATAAATAGTAATTCTGGCCATGACGAATAGAGCCAATCTGCTCCACTTGACTATCCTTGTGACTGTATCGTATGTCGAACCCTTGACTGCCCATTCAAACAATTGTAAAGGAATATGAGCTACAAGTTATGTCTCACGTTTGCGTGCGAGCCCGTTTGTACGTTATTTTGAGAAAGCGTTGCCATCACATGCTCACAGTCACTTGGCTTACGATCATGTTTGCGATCTTTCGGTAAGAATACACAGAGTAACGATTATACATCCATCGCTTTCTATGATTAGGTACTCAGACAACACATGGGAAACAAGATAACCATCGCATGCAAGGTCGATTCCAATCATGATCTGGACTGGGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTCGAGAGAAGGAATGGTAGGACCTCTCAGGCGTCCACCATCTGTGCTGCAAATCCAAGAAACCCCCCAAAAGCACCTACCTATCTACCTAGAGTAATCTGCACGAGAAAAGAAAAGGAGCAGAAGAAGAATGATCTCAAGAGGCCGTGAACGCAGAAACACACTCCTCCCAACTTTTCAAGTTTTGAACAAAAAAAGAAAGATGAGGACTAGAAGATGGAGTATTTCCTTCTTAGAGAGCTCTCGGTGAGGTGACCTGTCAGGGTTTACCTCAAACCGTCTGTGGTTCTATCCAATTAATCAAGTCCCTCTCCTCTCCTCTTCTCTCCTGTCCTTTCATAGAATCCCTTTTCCTTGTTGCTTGATCGAAGCGGGTTATCGACGCCACCAAAGTATTGTCTTGGTGACTTATCAAATCCCTTTGGTGATCAAACAGCCCCCGAGTGATCAGATCCGTAA。

[0054] （2）利用PCR技术扩增表达框序列，然后利用限制性内切酶EcoRI ，XbaI将表达框序列克隆至pUC19中，得到重组表达质粒；重组表达质粒构建引物序列如下：

[0055] 上游引物：CCGGAATTCGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC（下划线为EcoRI切位点），下游引物：GCTCTAGATTACGGATCTGATCACTCGGG（下划线为，XbaI酶切位点）。

[0056] （3）将重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组表达质粒。

[0057] （4）抽提重组表达质粒，将10微克的重组表达质粒和10微克的pAN7-1载体混匀，共转里氏木霉原生质体，涂布于5个含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养两天，待平板上长出菌丝，将菌丝转接到新的含抗生素的PDA固体平板上，28℃培养五天；

[0058] （5）将长出的转化子接种于不含抗生素的PDA固体平板上长孢子。

[0059] （6）将制得的孢子用无菌水制备孢子悬液，取105个孢子接种于30ml的基本培养基中，28℃，250 r/min培养48小时后取1.5ml菌液后转接到30ml的产酶培养基中，28℃，250 r/min培养196小时；取菌液，12,000×g 离心 5min，得上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子，即得到高产热稳定性木聚糖酶xyn-LVK的里氏木霉基因工程菌。

[0060] 三、里氏木霉基因工程菌在发酵罐水平的小试表达

[0061] 里氏木霉基因工程菌发酵用5.0L发酵罐进行实验，将上述获得的高木聚糖酶活性转化子进行发酵水平发酵试验，产酶培养基发酵罐装液量3.0L，接装液量5%～10%的摇瓶种子培养液。发酵条件：28℃，搅拌速度300～500rpm，通气量0.5～1vvm，pH4.5。随着发酵时间的延长，发酵上清液中木聚糖酶酶活力显著增加，发酵170h后木聚糖酶活性可达101260 U/mL，菌体湿重达323g/L。

[0062] 比较例：木聚糖酶xyn-LVK在毕赤酵母中的高效表达

[0063] 实验条件

[0064] （1）菌株与载体

[0065] 毕赤酵母 GS115、载体 pPIC9K 购自 Invitrogen 公司；大肠杆菌DH5α 菌株已在《刘静华，包英华，陈燕飞；大肠杆菌DH5α 感受态细胞转化率的改进，韶关学院学报，2008，29(03) ：87-90》文献中公开，大肠杆菌DH5α 菌株的感受态细胞可通过供应商天根生化科技( 北京) 有限公司购买，货号CB101-03。

[0066] （2）酶类及其他生化试剂

[0067] 内切酶、连接酶购自TaKaRa公司，其它都为国产试剂。

[0068] （3）培养基

[0069] 大肠杆菌培养基为LB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0）。酵母培养基为YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）。酵母筛选培养基为MD（2％葡萄糖，1.5%琼脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、MM（0.5%甲醇（体积分数），1.5%琼脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、RDB（1M山梨醇，2％葡萄糖，0.00004％生物素，1.34％YNB ，0.005%氨基酸）。酵母诱导培养基 BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％生物素、1％甘油（体积分数））和BMMY（除以0.5％甲醇（体积分数）代替甘油，其余成份相与 BMGY 相同）。

[0070] （4）表达载体的构建及其在酵母的表达

[0071] 以合成的木聚糖酶xyn-LVK基因为模板，设计合成了带有EcoRI和NotI限制性酶切位点的引物xyn-LVK-F 和 xyn-LVK-R，对xyn-LVK的成熟蛋白的编码区进行扩增，并利用EcoRI和NotI酶切PCR产物，连接进入表达载体 pPIC9K，使木聚糖酶xyn-LVK基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体 pPIC9K-xyn-LVK，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。约5微克的用限制性内切酶BglII进行线性化的重组表达质粒，电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷性的 RDB 平板，30℃培养2-3天，挑取在RDB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。

[0072] 酵母表达引物序列如下 ：

[0073] xyn-LVK-F：CCGGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCA（下划线为EcoRI酶切位点）[0074] xyn-LVK-R：ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCACCAATGTAAACCTTTGCGTA（下划线为NotI酶切位点）

[0075] （5）高木聚糖酶活性转化子的筛选

[0076] 用灭过菌的牙签从长有转化子的 RDB 平板上挑取单菌落， 按照编号先点到 MM 平板上，再点到相应编号的MD平板上。将点有转化子的MM、MD 平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从 MD 平板上挑取转化子接种于装有BMGY培养基的摇瓶中，30℃、250rpm摇床培养约48h；将摇瓶中培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，改用含有体积分数为0.5％的甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养；诱导培养48h后，取菌液，3,000×g 离心 5min， 取上清液用于酶活性检测，从中筛选出高木聚糖酶活性的转化子。

[0077] （6）高木聚糖酶活性转化子在发酵罐水平的小试表达

[0078] 高细胞密度发酵用5L发酵罐进行实验，按照Invirogen公司的毕赤酵母发酵过程指导（Pichia Fermentation Process Guidelines）操作。将上述获得的高木聚糖酶活性转化子进行发酵水平高密度发酵试验。随着甲醇诱导时间的延长，发酵上清液中木聚糖酶酶活力显著增加，诱导180h后木聚糖酶活性可达72325 U/mL，菌体湿重达413g/L。

[0079] 实施例与比较例相比，里氏木霉基因工程菌发酵产木聚糖酶xyn-LVK的产量显著提升，产量提升约40%。

[0080] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。