新的抗人Tie-2抗体

摘要

本发明旨在提供一种抗人Tie2抗体，其通过结合到人Tie2并激活所述人Tie2而预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变和严重肢体缺血。本发明人对抗人Tie2抗体进行了研究，并由此提供了包含4个重链可变区和4个轻链可变区的抗人Tie2抗体。所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，所述轻链可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成。一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体包含4个抗原结合位点。

权利要求

1.一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其包含4个重链可变区和4个轻链可变区，其中所述重链可变区包含由SEQ ID NO：2的第31至35位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：2的第50至66位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：2的第99至

111位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3；

所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的第24至39位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：4的第55至61位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：4的第94至

102位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3；并且

一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或所述抗原结合片段包含4个抗原结合位点。

2.根据权利要求1所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其选自下列(1)或(2)：(1)一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其包含4个重链可变区和4个轻链可变区，其中所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，所述轻链可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成，并且一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或抗原结合片段包含4个抗原结合位点；或者(2)一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其为已经历在重链可变区的N端处焦谷氨酰化的翻译后修饰的(1)的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。

3.根据权利要求1所述的抗人Tie2抗体，其中

所述抗体包含两条重链和四条轻链；

每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：2的第31至35位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：2的第

50至66位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：2的第99至111位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3，并且一个所述结构的羧基端(C端)通过连接物连接到另一个结构的氨基端(N端)；并且每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的第24至39位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：4的第55至61位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：4的第94至102位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3。

4.根据权利要求3所述的抗人Tie2抗体，其选自下列(1)或(2)：(1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条重链和四条轻链，其中

每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，并且一个所述结构的C端通过连接物连接到另一个结构的N端；并且每条轻链包含由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区，和轻链恒定区；或者(2)一种抗人Tie2抗体，其为已经历在重链可变区的N端处焦谷氨酰化的翻译后修饰的(1)的抗人Tie2抗体。

5.根据权利要求4所述的抗人Tie2抗体，其选自下列(1)或(2)：(1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链；或者(2)一种抗人Tie2抗体，其包含两条重链和四条轻链，所述重链为SEQ ID NO:2的第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸和/或SEQ ID NO:2的第679位氨基酸的赖氨酸被缺失的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列构成，并且所述轻链由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列构成。

6.根据权利要求5所述的抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

7.根据权利要求5所述的抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

8.一种多核苷酸，其选自下列(a)和(b)：

(a)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列；以及(b)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。

9.一种多核苷酸，其选自下列(a)和(b)：

(a)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列；以及(b)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列。

10.一种表达载体，其包含：

(i)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列，和(ii)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。

11.一种表达载体，其包含：

(i)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列，和(ii)一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列。

12.一种用表达载体转化的宿主细胞，其选自下列(a)和(b)：

(a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含：含有编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及(b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

13.一种用表达载体转化的宿主细胞，其选自下列(a)和(b)：

(a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及(b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

14.一种生产抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养选自下列(a)至(c)的宿主细胞以表达四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段：(a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含：含有编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

(b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及(c)两种宿主细胞，一种宿主细胞用包含含有编码根据权利要求2(1)所述的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化，另一种宿主细胞用包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化。

15.一种生产抗人Tie2抗体的方法，所述方法包括培养选自下列(a)至(c)的宿主细胞以表达抗人Tie2抗体：(a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

(b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及(c)两种宿主细胞，一种宿主细胞用包含含有编码根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化，另一种宿主细胞用包含含有编码所述抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化。

16.一种药物组合物，其包含根据权利要求6所述的抗人Tie2抗体和/或根据权利要求7所述的抗人Tie2抗体，和可药用赋形剂。

17.权利要求5所述的抗人Tie2抗体在制造用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血的药物组合物中的应用。

说明书

新的抗人Tie-2抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及新的抗人Tie-2抗体。

背景技术

[0002] 具有Ig和EGF同源结构域2的酪氨酸激酶(Tie2)是一种受体型酪氨酸激酶。已知Tie2主要在血管内皮细胞中表达。作为配体，已知的是作为多聚体类型的分泌糖蛋白的血管生成素-1(Ang-1)和血管生成素-2(Ang-2)。

[0003] Ang-1起到Tie2的激动剂的作用。已发现，当Tie2结合到Ang-1时，它通过形成多聚体被自身磷酸化并将信号发送到细胞内，由此促进血管内皮细胞的抗凋亡作用、通过血管的渗透抑制作用的血管稳定化作用、成熟和重塑(Cell,1996,Vol.87,pp.1171-1180；Genes Dev.,1994,Vol.8,pp.1897-1909；Science,1999,Vol.286,pp.2511-2514；和Nat.Struct.Biol.,2003,Vol.10,pp.38-44)。此外，还已知道，Ang-1通过经Tie2活化产生一氧化氮来发挥血管舒张和血流增强作用(Pharmacol.Res.,2014,Vol.80,pp.43-51)。此外，据信Ang-1通过经Tie2活化抑制血管内皮钙粘蛋白的内化而有助于血管的稳定化(Dev.Cell,2008,Vol.14,pp.25-36)。另一方面，据信Ang-2能够活化血管内皮细胞上的Tie2，但是与Ang-1相比它的活化据信是部分的(Mol.Cell Biol.,2009,Vol.29,pp.2011-
2022)。Ang-2以与Ang-1基本上相同的亲和性结合到Tie2的相同位点，作为结果，已提出从Ang-1对Tie2的活化被Ang-2的部分活化代替的观点来看，Ang-2起到内源Tie2拮抗剂的作用(Science,1997,Vol.277,pp.55-60)。

[0004] 已报道在由血管脆弱引起的疾病中血液中Ang-2的浓度升高，而血管脆弱被认为是诸如糖尿病、糖尿病性视网膜病变、脓毒症和急性肾衰竭的疾病的病因之一(Atherosclerosis,2005,Vol.180,pp.113-118；Br.J.Ophthalmol.,2004,Vol.88,pp.1543-1546；Critical Care,2009,Vol.13,p.207；和Intensive Care Med.,2010,Vol.36,pp.462-470)。

[0005] 对于与糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的相关性而言，已报道在患者的血浆或玻璃体液中Ang-2的浓度升高(Br.J.Ophthalmol.,2004,Vol.88,pp.1543-1546；和Br.J.Ophthalmol.,2005,Vol.89,pp.480-483)。此外，在患有糖尿病性视网膜病变的患者的视网膜血管中，也已知道作为主要的Ang-1生产细胞的周细胞的丧失(Cell,1996,Vol.87,pp.1161-1169)，是特征性病变之一(《视网膜》(Retina)，2013，第五版，pp.925-939)。已知糖尿病性黄斑水肿包括黄斑区增厚作为其病症之一，但也已报道在由于玻璃体移除手术而造成眼内Ang-1浓度提高的患者中，黄斑区的增厚减小(Br.J.Ophthalmol.,
2005,Vol.89,pp.480-483)。此外，从在视网膜血管中周细胞丧失的视网膜水肿小鼠模型中观察到视网膜水肿和视网膜出血，并且疾病的发作受到Ang-1的玻璃体内给药的抑制(J.Clin.Invest.,2002,Vol.110,pp.1619-1628)，以及在使用具有糖尿病性视网膜病变的小鼠模型的试验中，视网膜中的血管内皮细胞障碍受到含有编码Ang-1基因的腺病毒给药的抑制(Am.J.Pathol.,2002,Vol.160,pp.1683-1693)的观点来看，已建议Ang-1具有改善所述病症的作用。同时，已报道在视网膜中具有Ang-2特异性过表达的遗传修饰小鼠中，视网膜细胞的损伤增加(Acta.Diabetol.2010,Vol.47,pp.59-64)。

[0006] 已报道，对于严重肢体缺血来说，在患有外周动脉疾病的患者中血浆中的Ang-2量增加，并且在患有严重肢体缺血的患者中，在缺血的肢体肌肉或皮肤组织中表达的Ang-2的量高(J.Am.Coll.Cardial.,2008,Vol.52,pp.387-393；和Int.Angiol.,2011,Vol.30,pp.25-34)。此外，在使用具有后肢缺血的大鼠模型的试验中，通过给药含有编码Ang-1的基因的病毒载体，促进了缺血肢体中的血流恢复和抗凋亡效应(Angiogenesis,2009,Vol.12,pp.243-249)。从已报道在作为具有2型糖尿病的动物模型的db/db小鼠的冠状动脉结扎模型中，通过给药含有编码Ang-1的基因的病毒增加了梗塞区域的边界区中被平滑肌细胞覆盖的成熟血管(Diabetes,2008,Vol.57,pp.3335-3343)的观点来看，通过Tie2信号的活化可以预期到促进不稳定的新血管成熟的效果。

[0007] 作为对人Tie2显示出激动作用的抗体，已报道了一种鼠类单克隆抗体15B8(专利文献1)。已报道在人血管内皮细胞HUVEC中，15B8结合到人Tie2以诱导抗凋亡作用(专利文献1)。

[0008] 相关技术

[0009] 专利文献

[0010] [专利文献1]WO 2000/018804

发明内容

[0011] 本发明待解决的问题

[0012] 本发明的目的是提供一种抗人Tie2抗体，其通过结合到人Tie2以活化所述人Tie2，用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血。

[0013] 解决问题的手段

[0014] 本发明人在抗人Tie2抗体的制备中重复地进行了大量创造性的研究，作为结果，他们发现制备了一种四价抗人Tie2抗体，其包含由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区和由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区(实施例1至8)，并且因此所述抗人Tie2抗体结合到人Tie2(实施例12)，在表达人Tie2的BaF3细胞中诱导抗凋亡作用(实施例9和11)，并在具有血管通透性增高的大鼠模型中抑制血管通透性增高(实施例10和13)。作为结果，他们提供了这种抗人Tie2抗体，由此完成了本发明。

[0015] 也就是说，本发明可以包括下列发明作为在医学或工业上适用的材料或方法。

[0016] [1]一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其包含4个重链可变区和4个轻链可变区，其中

[0017] 所述重链可变区包含由SEQ ID NO：2的第31至35位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：2的第50至66位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：2的第99至111位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3；

[0018] 所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的第24至39位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：4的第55至61位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：4的第94至102位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3；并且

[0019] 一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或抗原结合片段包含4个抗原结合位点。

[0020] [2][1]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其选自下列(1)或(2)：

[0021] (1)一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其包含4个重链可变区和4个轻链可变区，其中

[0022] 所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，[0023] 所述轻链可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成，并且[0024] 一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或抗原结合片段包含4个抗原结合位点；以及

[0025] (2)一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其是源自于(1)的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段。

[0026] [3][1]的抗人Tie2抗体，其中

[0027] 所述抗体包含两条重链和四条轻链；

[0028] 每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：2的第31至35位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：2的第50至66位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：2的第99至111位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3，并且一个所述结构的羧基端(C端)通过连接物连接到另一个结构的氨基端(N端)；并且

[0029] 每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的第24至39位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：4的第55至61位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：4的第94至102位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3。

[0030] [4][3]的抗人Tie2抗体，其选自下列(1)或(2)：

[0031] (1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条重链和四条轻链，其中

[0032] 每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，并且一个所述结构的C端通过连接物连接到另一个结构的N端；并且

[0033] 每条轻链包含由SEQ ID NO：4的1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区，和轻链恒定区；以及

[0034] (2)一种抗人Tie2抗体，其是源自于(1)的抗人Tie2抗体的翻译后修饰的抗体。

[0035] [5][4]的抗人Tie2抗体，其中

[0036] 所述抗人Tie2抗体包含两条重链和四条轻链；

[0037] 每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，并且一个所述结构的C端通过连接物连接到另一个结构的N端；并且

[0038] 每条轻链包含由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区，和轻链恒定区。

[0039] [6]一种抗人Tie2抗体，其是源自于[5]的抗人Tie2抗体的翻译后修饰的抗体。

[0040] [7][6]的抗人Tie2抗体，其中所述翻译后修饰是所述重链可变区的N端处的焦谷氨酰化和/或所述重链的C端处赖氨酸的缺失。

[0041] [8][3]至[7]任一项的抗人Tie2抗体，其包含作为人Igγ1恒定区或人Igγ4恒定区的重链恒定区。

[0042] [9][8]的抗人Tie2抗体，其中所述人Igγ1恒定区是具有氨基酸变异L234A、L235A和P331S的人Igγ1恒定区或具有氨基酸变异L234A、L235A、P331S和I253A的人Igγ1恒定区。

[0043] [10][8]的抗人Tie2抗体，其中所述人Igγ4恒定区是具有氨基酸变异S228P和L235E的人Igγ4恒定区。

[0044] [11][3]至[7]任一项的抗人Tie2抗体，其包含作为人Igκ恒定区的轻链恒定区。

[0045] [12][3]至[7]任一项的抗人Tie2抗体，其包含作为人Igγ1恒定区或人Igγ4恒定区的重链恒定区和作为人Igκ恒定区的轻链恒定区。

[0046] [13][12]的抗人Tie2抗体，其中所述人Igγ1恒定区是具有氨基酸变异L234A、L235A和P331S的人Igγ1恒定区或具有氨基酸变异L234A、L235A、P331S和I253A的人Igγ1恒定区。

[0047] [14][12]的抗人Tie2抗体，其中所述人Igγ4恒定区是具有氨基酸变异S228P和L235E的人Igγ4恒定区。

[0048] [15][3]至[7]任一项的抗人Tie2抗体，其中所述连接物是包含5至70个氨基酸的肽连接物。

[0049] [16][15]的抗人Tie2抗体，其中所述连接物包含铰链区或其一部分的氨基酸序列。

[0050] [17][16]的抗人Tie2抗体，其中所述连接物包含由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

[0051] [18][4]的抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0052] [19][4]的抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0053] [20][4]的抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0054] [21]一种抗人Tie2抗体，其是源自于[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的翻译后修饰的抗体。

[0055] [22][21]的抗人Tie2抗体，其中所述翻译后修饰是所述重链可变区的N端处的焦谷氨酰化和/或所述重链的C端处赖氨酸的缺失。

[0056] [23][21]的抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0057] [24]一种四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其与[18]或[23]的抗人Tie2抗体结合相同的人Tie2表位。

[0058] [25][24]的四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其中所述人Tie2表位是含有登录号NP_000450.2的第192、195和197位氨基酸的氨基酸的人Tie2表位。

[0059] [26]一种多核苷酸，其包含编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列。

[0060] [27]一种多核苷酸，其包含编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列。

[0061] [28]一种多核苷酸，其包含编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列。

[0062] [29]一种多核苷酸，其包含编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列。

[0063] [30]一种表达载体，其包含[26]和/或[27]的多核苷酸。

[0064] [31]一种表达载体，其包含[28]和/或[29]的多核苷酸。

[0065] [32]一种用[30]的表达载体转化的宿主细胞，其选自下列(a)至(d)：

[0066] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

[0067] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

[0068] (c)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及

[0069] (d)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

[0070] [33]一种用[31]的表达载体转化的宿主细胞，其选自下列(a)至(d)：

[0071] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

[0072] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

[0073] (c)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；以及

[0074] (d)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

[0075] [34]一种生产抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养选自下列(a)至(c)的宿主细胞以表达四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段：

[0076] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

[0077] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及[0078] (c)两种宿主细胞，一种宿主细胞用包含含有编码[2]的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化，另一种宿主细胞用包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化。

[0079] [35]一种生产抗人Tie2抗体的方法，所述方法包括培养选自下列(a)至(c)的宿主细胞以表达抗人Tie2抗体：

[0080] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

[0081] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及

[0082] (c)两种宿主细胞，一种宿主细胞用包含含有编码[18]至[20]任一项的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化，另一种宿主细胞用包含含有编码所述抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化。

[0083] [36]一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其通过[34]的方法生产。

[0084] [37]一种抗人Tie2抗体，其通过[35]的方法生产。

[0085] [38]一种药物组合物，其包含[1]至[23]、[36]和[37]任一项的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段和可药用赋形剂。

[0086] [39]一种药物组合物，其包含[5]的抗人Tie2抗体、[6]的抗人Tie2抗体和可药用赋形剂。

[0087] [40]一种药物组合物，其包含[18]的抗人Tie2抗体、[23]的抗人Tie2抗体和可药用赋形剂。

[0088] [41][38]至[40]任一项的药物组合物，其是用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血的药物组合物。

[0089] [42]一种用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血的方法，所述方法包括给药治疗有效量的[1]至[23]、[36]和[37]任一项的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。

[0090] [43][1]至[23]、[36]和[37]任一项的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血。

[0091] [44][1]至[23]、[36]和[37]任一项的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造药物组合物以预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血。

[0092] 所述抗人Tie-2抗体或其抗原结合片段包括所述抗体与另一种肽或蛋白质的融合物，以及具有结合于它的修饰剂的修饰。

[0093] 本发明的效果

[0094] 本发明的抗人Tie2抗体可用作药剂，通过结合到人Tie2以活化所述人Tie2来预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血。

[0095] 附图简述

[0096] 图1示出了本发明的四价抗人Tie2抗体的格式的实例。

[0097] 图2示出了在具有血管通透性的大鼠模型中全人2-16A2和TIE-1-Igγ1-WT的血管通透性抑制作用。纵轴指示伊文思蓝染料的泄漏量(****：相对于介质组p<0.0001)。

[0098] 图3示出了在具有血管通透性的大鼠模型中TIE-1-Igγ1-LALA的血管通透性抑制作用。纵轴指示伊文思蓝染料的泄漏量(****：相对于介质组p<0.0001)。

[0099] 图4示出了在视网膜血管中具有周细胞丧失的小鼠模型中TIE-1-Igγ1-LALA的视网膜水肿抑制作用。纵轴指示视网膜神经纤维层和视网膜神经节细胞层之和(##：相对于对照组p<0.005，*：相对于介质组p<0.05)。

[0100] 图5示出了在具有后肢缺血的小鼠模型中TIE-1-Igγ1-LALA的血流改善作用。纵轴指示血流量(*：相对于对照组p<0.05，**：相对于对照组p<0.01)。

[0101] 图6示出了作为TIE-1-Igγ1-LALA的表位分析的表面等离子体共振现象的结果的代表性实例。纵轴指示结合响应性(共振单位：RU)，横轴指示时间(秒)。

[0102] 图7示出了作为TIE-1-Igγ1-LALA的表位分析的的ELISA的结果。纵轴指示发光强度，横轴指示TIE-1-Igγ1-LALA的浓度(ng/mL)。

[0103] 执行本发明的实施方式

[0104] 在后文中将详细描述本发明。

[0105] 在抗体中存在5种类别，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在每种所述类别中，抗体分子的基本结构由分子量为50000至70000的重链和分子量为20000至30000的轻链共同组成。重链通常由包含约440个氨基酸的多肽链构成，每种类别具有不同的结构，并且被称为Igγ、Igμ、Igα、Igδ和Igε，分别对应于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。此外，在IgG中存在4个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且分别对应于它们的重链被称为Igγ1、Igγ2、Igγ3和Igγ4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知存在两种类型即L型和K型，并且被称为Igλ和Igκ。在抗体分子的基本结构的肽组态中，两条同源的重链和两条同源的轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键结合，并且其分子量为150000至190000。两种轻链可以与任何重链配对。

[0106] 对于链内S-S键来说，在重链中存在4个S-S键(在Igμ和Igε中5个)，在轻链中存在两个；每100至110个氨基酸残基形成一个环，这种立体结构在不同环之间是相似的，并被称为结构单元或结构域。位于重链和轻链两者中氨基端侧(N端侧)的结构域，其氨基酸序列即使在样品来自于同一种动物的同一类别(亚类)的情形中也不是恒定的，被称为可变区，并且相应的结构域被称为重链可变区和轻链可变区。所述可变区的羧基端侧(C端侧)的氨基酸序列在每种类型或亚类中是几乎恒定的，并被称为恒定区。

[0107] 抗体的抗原结合位点由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)构成，并且结合特异性取决于这个位点的氨基酸序列。另一方面，生物活性例如与补体和各种不同细胞的结合反映出每一类Ig之间恒定区结构的差异。应该理解，轻链和重链的可变区的可变性主要限制到两种链中存在的三个小的超变区，并且这些区被称为互补性决定区(CDR：从N端侧起CDR1、CDR2和CDR3)。可变区的其余部分被称为构架区(FR)并且相对恒定。

[0108] 对于恒定区而言，重链恒定区由三个区构成，其从可变区一侧起依次被称为CH1区、CH2区和CH3区。轻链恒定区由一个区构成。在CH1区与CH2区之间存在被称为铰链区的肽序列。铰链区对由重链可变区和CH1区构成的结构的迁移率有贡献。

[0109] 此外，包含抗体的VH和VL的各种不同种类的抗原结合片段具有抗原结合活性。例如，单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab’和F(ab’)2是典型的抗原结合片段的实例。Fab是单价抗原结合片段，其由轻链和包含VH、CH1区的重链片段和一部分铰链区构成。Fab’是单价抗原结合片段，其由轻链和包含VH、CH1区的重链片段和一部分铰链区构成，并且构成重链间S-S键的半胱氨酸残基被包含在所述一部分铰链区中。F(ab’)2是具有二聚体结构的二价抗原结合片段，其中两个Fab’片段通过铰链区中的重链间S-S键彼此相连。scFv是单价抗原结合片段，其由用连接物肽相连的VH和VL构成。

[0110] 具有两个或更多个抗原结合位点的抗体被称为多价抗体。其中，具有4个抗原结合位点的抗体被称为四价抗体。对于四价抗体来说，已报道了各种不同的格式(结构)(Nat.Rev.Immunol.2010,Vol.10,pp.301-316；J.Immunol.,2003,Vol.170,pp.4854-4861；Mol.Immunol.,2000,Vol.37,pp.1067-1077；Biochem.J.,2007,Vol.406,pp.237-246；和J.Immunol.Methods,2003,Vol.279,pp.219-232)。例如，已经报道了其中将二价抗体的重链可变区和轻链可变区的N端通过连接物各自连接到重链可变区和轻链可变区的C端的四价抗体；包含两条重链和四条轻链的四价抗体，其中每条重链包含两个由重链可变区和CH1区构成的结构；其中将scFv的C端逐一键合到四聚体链亲和素的每个链亲和素的四价抗体；
其中将scFv的C端逐一键合到四聚体p53的每个p53的四价抗体；以及其中将CH3区的N端通过连接物连接到二聚体scFv的C端的四价抗体。

[0111] <本发明的抗人Tie2抗体>

[0112] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包括具有下列特征的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。

[0113] 一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其包含4个重链可变区和4个轻链可变区，其中

[0114] 所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，[0115] 所述轻链可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成，并且[0116] 一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或其抗原结合片段包含4个抗原结合位点。

[0117] 对本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段没有特别限制，只要它是四价抗体即可，并且可以将在例如下列文献中描述的各种不同格式的四价抗体用于本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段：Nat.Rev.Immunol.2010,Vol.10,pp.301-316；J.Immunol.,2003,Vol.170,pp.4854-4861；Mol.Immunol.,2000,Vol.37,pp.1067-1077；Biochem.J.,2007,Vol.406,pp.237-246；J.Immunol.Methods,2003,Vol.279,pp.219-232；等等。

[0118] 优选地，本发明的抗人Tie2抗体包含两条重链和四条轻链，

[0119] 每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，并且一个所述结构的C端通过连接物连接到另一个结构的N端；并且

[0120] 每条轻链包含由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区，和轻链恒定区。

[0121] 在后文中，采取所述格式的四价抗体被称为串联抗体，其实例示出在图1中。

[0122] 在本发明的抗人Tie2抗体是串联抗体的情况下，可以选择任何亚类中的恒定区(例如作为重链恒定区的Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4的恒定区，以及作为轻链恒定区的Igλ或Igκ的恒定区)作为所述恒定区。所述重链恒定区(包括CH1区、CH2区和CH3区)优选为人Igγ1恒定区或人Igγ4恒定区。所述轻链恒定区优选为人Igκ恒定区。

[0123] 在使用人Igγ1恒定区作为本发明的抗人Tie2抗体的重链恒定区的情况下，人Igγ1恒定区的CH1区、CH2区和CH3区的实例包含由SEQ ID NO：8的第350至447位氨基酸的氨基酸序列构成的CH1区、由SEQ ID NO：8的第463至572位氨基酸的氨基酸序列构成的CH2区和由SEQ ID NO：8的第573至679位氨基酸的氨基酸序列构成的CH3区。

[0124] 在使用人Igγ1恒定区作为本发明的抗人Tie2抗体的重链恒定区的情况下，也可以使用具有导入的氨基酸变异例如L234A(根据EU索引例如Kabat，第234氨基酸位置处的亮氨酸被丙氨酸替代)、L235A(根据EU索引例如Kabat，第235氨基酸位置处的亮氨酸被丙氨酸替代)和P331S(根据EU索引例如Kabat，第331氨基酸位置处的脯氨酸被丝氨酸替代)的人Igγ1恒定区，以便降低所述抗体的抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性活性(Mol.Immunol.,1992,Vol.29,No.5,pp.633-639)。此外，从药物动力学的观点来看，也可以使用已导入氨基酸变异例如I253A(根据EU索引例如Kabat，第253氨基酸位置处的异亮氨酸被丙氨酸替代)的人Igγ1恒定区，以便获得在血液中的快速丧失(J.Immunol.,1997,Vol.158,pp.2211-2217)。在本说明书中使用的关于抗体恒定区中引入氨基酸变异的残基编号是根据EU索引(Kabat等，1991，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences  of Proteins of Immunological Interest)，第五版，United States Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda)。

[0125] 在使用人Igγ1恒定区作为本发明的抗人Tie2抗体的重链恒定区的情况下，所述人Igγ1恒定区优选为具有氨基酸变异L234A、L235A和P331S或L234A、L235A、P331S和I253A的人Igγ1恒定区。所述具有氨基酸变异L234A、L235A和P331S的人Igγ1恒定区的CH1区、CH2区和CH3区的实例，包含由SEQ ID NO：2的第350至447位氨基酸的氨基酸序列构成的CH1区、由SEQ ID NO：2的第463至572位氨基酸的氨基酸序列构成的CH2区和由SEQ ID NO：2的第573至679位氨基酸的氨基酸序列构成的CH3区。所述具有氨基酸变异L234A、L235A、P331S和I253A的人Igγ1恒定区的CH1区、CH2区和CH3区的实例，包含由SEQ ID NO：6的第350至447位氨基酸的氨基酸序列构成的CH1区、由SEQ ID NO：6的第463至572位氨基酸的氨基酸序列构成的CH2区和由SEQ ID NO：6的第573至679位氨基酸的氨基酸序列构成的CH3区.[0126] 在使用人Igγ4恒定区作为本发明的抗人Tie2抗体的重链恒定区的情况下，也可以使用具有导入的氨基酸变异例如S228P(根据EU索引例如Kabat，第228氨基酸位置处的丝氨酸被脯氨酸替代)和L235E(根据EU索引例如Kabat，第235氨基酸位置处的亮氨酸被谷氨酸替代)的人Igγ4恒定区，以便抑制Fab臂交换(Drug Metab.Dispos.,2010,Vol.38,No.1,pp.84-91)。

[0127] 在使用人Igγ4恒定区作为本发明的抗人Tie2抗体的重链恒定区的情况下，所述人Igγ4恒定区优选为具有氨基酸变异S228P和L235E的人Igγ4恒定区。所述具有氨基酸变异S228P和L235E的人Igγ4恒定区的CH1区、CH2区和CH3区的实例，包含由SEQ ID NO：10的第350至447位氨基酸的氨基酸序列构成的CH1区、由SEQ ID NO：10的第460至569位氨基酸的氨基酸序列构成的CH2区和由SEQ ID NO：10的第570至676位氨基酸的氨基酸序列构成的CH3区.

[0128] 所述人Igκ恒定区的实例包括由SEQ ID NO：4的第114至219位氨基酸的氨基酸序列构成的人Igκ恒定区。

[0129] 优选地，在本发明的抗人Tie2抗体是串联抗体的情况下，所述重链恒定区是人Igγ1恒定区或人Igγ4恒定区，并且所述轻链恒定区是人Igκ恒定区。在所述重链恒定区是人Igγ1恒定区的情况下，所述人Igγ1恒定区优选为具有氨基酸变异L234A、L235A和P331S的人Igγ1恒定区或具有氨基酸变异L234A、L235A、P331S和I253A的人Igγ1恒定区。在所述重链恒定区是人Igγ4恒定区的情况下，所述人Igγ4恒定区优选为具有氨基酸变异S228P和L235E的人Igγ4恒定区。

[0130] 在本发明的抗人Tie2抗体是串联抗体的情况下，作为连接由重链可变区和CH1区构成的结构的连接物，可以使用任何肽(肽连接物)，只要所述抗体具有这种功能即可。所述肽连接物的长度和氨基酸序列可以由本领域技术人员适合地选择。所述肽连接物优选具有5至70个氨基酸的长度。所述肽连接物优选包含铰链区或其一部分的氨基酸序列。铰链区意味着存在于抗体的CH1区与CH2区之间的区，并且所使用的铰链区的实例包括IgG1或IgG3的铰链区。铰链区的一部分意味着具有铰链区中的至少5个连续氨基酸的区，并且优选地意味着具有从铰链区的N端起至少5个连续氨基酸的区。铰链区的一部分的实例包括在IgG1的铰链区的情况下具有从N端起5个连续氨基酸(由SEQ ID NO：13的第1至5位氨基酸的氨基酸序列构成)的区，和在IgG3的铰链区的情况下具有从N端起12个连续氨基酸(由SEQ ID NO：14的第1至12位氨基酸的氨基酸序列构成)的区。在一种实施方式中，所述连接物包含具有从铰链区的N端起至少5个连续氨基酸的区的氨基酸序列，并在所述连接物的C端处包含氨基酸序列GlySer。这种连接物的实例包括由SEQ ID NO：13至20任一者所示的氨基酸序列构成的肽连接物，并且所述连接物优选地由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列构成。

[0131] 在一种实施方式中，本发明的抗人Tie2抗体是具有下列特征i)至iv)任一项的抗人Tie2抗体。

[0132] i)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0133] ii)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0134] iii)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0135] iv)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0136] 已知当抗体在细胞中表达时，所述抗体在翻译后被修饰。所述翻译后修饰的实例包括用羧肽酶切开重链C端处的赖氨酸，通过焦谷氨酰化将重链和轻链的N端处的谷氨酰胺或谷氨酸修饰成焦谷氨酸，糖基化，氧化，脱酰胺化和糖化，并且已知在各种不同抗体中发生这些翻译后修饰(Journal of Pharmaceutical Sciences,2008,Vol.97,p.2426-2447)。

[0137] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包括已经历翻译后修饰的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。本发明的已经历过翻译后修饰的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的实例，包括在重链可变区的N端处已经历焦谷氨酰化和/或在重链的C端处缺失赖氨酸的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。在本领域中，已知这种由N端处的焦谷氨酰化和C端处赖氨酸的缺失造成的翻译后修饰对抗体的活性没有任何影响(Analytical Biochemistry,2006,Vol.348,p.24-39)。

[0138] 在一种实施方式中，本发明的抗人Tie2抗体是具有下列特征(1)至(4)任一项的抗人Tie2抗体。

[0139] (1)包含两条重链和四条轻链的抗人Tie2抗体，所述重链由SEQ ID NO：2的第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸和/或SEQ ID NO：2的第679位氨基酸的赖氨酸被缺失的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成，并且所述轻链由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成。

[0140] (2)包含两条重链和四条轻链的抗人Tie2抗体，所述重链由SEQ ID NO：6的第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸和/或SEQ ID NO：6的第679位氨基酸的赖氨酸被缺失的SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列构成，并且所述轻链由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成。

[0141] (3)包含两条重链和四条轻链的抗人Tie2抗体，所述重链由SEQ ID NO：8的第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸和/或SEQ ID NO：8的第679位氨基酸的赖氨酸被缺失的SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列构成，并且所述轻链由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成。

[0142] (4)包含两条重链和四条轻链的抗人Tie2抗体，所述重链由SEQ ID NO：10的第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸和/或SEQ ID NO：10的第676位氨基酸的赖氨酸被缺失的SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成，并且所述轻链由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成。

[0143] 在一种实施方式中，本发明的抗人Tie2抗体是具有下列特征的抗人Tie2抗体。

[0144] 包含两条重链和四条轻链的抗人Tie2抗体，所述重链由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成，并且所述轻链由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成。

[0145] 本发明还包括具有下列特征的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。

[0146] 一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其包含4个重链可变区和4个轻链可变区，[0147] 其中所述重链可变区包含由SEQ ID NO：2的第31至35位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：2的第50至66位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：2的第99至111位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3，

[0148] 所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的第24至39位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：4的第55至61位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：4的第94至102位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3；并且

[0149] 一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或其抗原结合片段包含4个抗原结合位点。

[0150] 此外，本发明还包括具有下列特征的抗人Tie2抗体。

[0151] 一种抗人Tie2抗体，其包含两条重链和四条轻链，其中

[0152] 每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：2的第31至35位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：2的第50至66位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：2的第99至111位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3，并且一个所述结构的羧基端通过连接物连接到另一个结构的氨基端，并且

[0153] 每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的第24至39位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR1、由SEQ ID NO：4的第55至61位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR2和由SEQ ID NO：4的第94至102位氨基酸的氨基酸序列构成的CDR3。

[0154] 本发明的抗人Tie2抗体是结合于人Tie2的抗体。所述抗体是否结合于人Tie2(登录号NP_000450.2)，可以使用已知的结合活性测量方法来验证。结合活性测量方法的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)方法等。在使用ELISA的情况下，在示例性方法中，将通过人Tie2与人Fc的融合形成的蛋白固定在ELISA板上，并向其添加试验抗体以进行反应。将第二抗体例如生物素标记的抗IgG抗体与生成物反应，洗涤，然后与结合有酶例如碱性磷酸酶的链亲和素反应。在清洗后，可以通过使用活性检测试剂(例如在碱性磷酸酶的情况下，化学发光超灵敏AP微孔和/或膜底物(450nm)(BioFX，APU4-0100-01)等)进行活性测量，来验证所述试验抗体是否结合于人Tie2。作为评估活性的一种具体的方法，可以使用例如与在后文中所描述的实施例12中描述的方法相同的方法。

[0155] 本发明的抗人Tie2抗体还包括除了结合人Tie2之外还结合源自于其他动物的Tie2(例如猴Tie2)的抗体，只要它是结合人Tie2的抗体即可。

[0156] 优选地，本发明的抗人Tie2抗体结合人Tie2，并且此外对表达人Tie2的细胞具有抗凋亡活性。作为评估抗体是否对表达人Tie2的细胞具有抗凋亡活性的特异性方法，可以使用与在后文中所描述的实施例4中描述的方法相同的方法。

[0157] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包括四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其与包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体，或与包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体结合相同的人Tie2表位。在这里，表位是指被抗体识别的抗原位点。

[0158] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包括一种四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其结合于包含人Tie2(登录号NP_000450.2)的第192、195和197位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位。

[0159] 此外，本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包含一种四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其结合于包含人Tie2(登录号NP_000450.2)的第192、195和197位氨基酸的表位。

[0160] 所述与包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体，或与包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体结合相同的人Tie2表位的四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，可以通过使用已知用于确定表位的方法来获取。用于确定表位的方法的实例包括氢/氘交换质谱术、X-射线晶体结构分析、ELISA和使用人Tie2的氨基酸置换突变体、人Tie2的部分肽等的表面等离子体共振现象等。

[0161] 通过使用如上所述用于确定表位的公知方法，可以检查试验抗体是否与所述包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体，或与所述包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体结合相同的人Tie2表位。在使用氢/氘交换质谱术的情况下，将在不存在试验抗体的情况下具有氘置换的人Tie2和在存在试验抗体的情况下具有氘置换的人Tie2各自分解成肽，并测量每种肽分子的量以计算氘置换的比率。试验抗体的人Tie2表位，可以从在存在或不存在试验抗体的情况下人Tie2的氘置换比率的差异来确定。在使用ELISA的情况下，制备人Tie2的点突变体。将所述突变的人Tie2固定，并向其添加试验抗体以经历反应。在反应后，与第二抗体例如生物素标记的抗人κ轻链抗体反应并清洗。随后，将碱性磷酸酶标记的亲和素(Thermo Fisher Scientific,21324)与其进行反应并清洗。此外，可以通过使用化学发光超灵敏AP微孔和/或膜底物(450nm)等进行活性测量，来鉴定所述试验抗体是否结合于所述突变的人Tie2。通过评估与各种不同类型的突变人Tie2的结合活性，可以确定试验抗体的表位。在试验抗体的表位包含所述包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体或所述包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体的表位中的至少一个氨基酸的情况下，可以确定所述试验抗体与所述包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体，或与所述包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体结合相同的人Tie2表位。

[0162] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，可以由本领域技术人员在本说明书中所公开的本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区的序列信息的基础上，使用本领域中已知的方法容易地制备。对本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段没有特别限制，但是可以按照例如在后文中描述的<生产本发明的抗人Tie2抗体的方法和通过所述方法生产的抗人Tie2抗体>中描述的方法来生产。

[0163] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段可以按照常规方法根据需要进一步纯化并配制。它可用于预防或治疗与血管相关的疾病例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、脓毒症、急性肝障碍、急性肾障碍、急性肺障碍、系统性炎性反应综合征、外周动脉阻塞疾病或严重肢体缺血。

[0164] <本发明的多核苷酸>

[0165] 本发明的多核苷酸包括包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

[0166] 在一种实施方式中，所述包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，是包含编码由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸。

[0167] 所述包含编码由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列所示的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含SEQ ID NO：1的第1至366位碱基的碱基序列的多核苷酸。

[0168] 在优选实施方式中，所述包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，是包含编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸、包含编码由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸、包含编码由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸或包含编码由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸.[0169] 所述包含编码由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含由SEQ ID NO：1所示的碱基序列的多核苷酸。所述包含编码由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含由SEQ ID NO：5所示的碱基序列的多核苷酸。所述包含编码由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含由SEQ ID NO：7所示的碱基序列的多核苷酸。所述包含编码由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含由SEQ ID NO：9所示的碱基序列的多核苷酸。

[0170] 在一种实施方式中，所述包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸，是包含编码由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

[0171] 所述包含编码由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列所示的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含SEQ ID NO：3的第1至339位碱基的碱基序列的多核苷酸。

[0172] 在优选实施方式中，所述包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸，是包含编码由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸。

[0173] 所述包含编码由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸的实例，包括包含由SEQ ID NO：3所示的碱基序列的多核苷酸。

[0174] 本发明的多核苷酸可以由本领域技术人员在碱基序列的基础上，使用本领域已知方法容易地制备。例如，本发明的多核苷酸可以使用本领域中已知的基因合成方法来合成。作为基因合成方法，可以使用本领域技术人员已知的各种不同方法，例如在WO90/07861中描述的抗体基因合成方法。此外，一旦获得本发明的多核苷酸之后，可以通过将变异导入到所述多核苷酸的预定位点中，来获得本发明的其他多核苷酸。作为这种导入变异的方法，可以使用本领域技术人员已知的各种不同方法，例如定点诱变方法(《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，1987，John Wiley&Sons Section 8.1-
8.5)。

[0175] <本发明的表达载体>

[0176] 本发明的表达载体包括包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和/或包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。各种不同格式的四价抗体及其生产方法在本领域中是公知的，并且本发明的表达载体可以由本领域技术人员根据这些生产方法或待表达的四价抗体的格式容易地建立。

[0177] 本发明的表达载体的优选实例包括包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、以及包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。

[0178] 对用于表达本发明的多核苷酸的表达载体没有特别限制，只要包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和/或包含编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸可以在真核细胞(例如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母)和/或原核细胞(例如大肠埃希氏杆菌)的各种不同宿主细胞中表达，并且由它们编码的多肽可以生产即可。所述表达载体的实例包括质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒、仙台病毒或反转录病毒)等。优选地，可以使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。此外，抗体基因可以通过使用事先包含人Ig恒定区基因的表达载体例如AG-γ1或AG-κ来表达(例如参见WO94/20632)。

[0179] 本发明的表达载体可以包含与本发明的多核苷酸可操作连接的启动子。用于使用动物细胞表达本发明的多核苷酸的启动子的实例包括病毒衍生的启动子例如CMV、RSV或SV40、肌动蛋白启动子、EF(延伸因子)1α启动子和热休克启动子。用于通过细菌(例如大肠埃希氏杆菌)表达的启动子的实例包括trp启动子、lac启动子、λPL启动子和tac启动子。此外，用于通过酵母表达的启动子的实例包括GAL1启动子、GAL10启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子。

[0180] 在使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子和终止密码子。在这种情况下，本发明的表达载体可以包含增强子序列、编码本发明的抗体或重链可变区或轻链可变区的基因的5’侧和3’侧上的非翻译区、分泌信号序列、剪接接头、聚腺苷化位点或可复制单元。当使用大肠埃希氏杆菌作为宿主细胞时，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制单元。在这种情况下，本发明的表达载体可以包含选择标记(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因或二氢叶酸还原酶基因)，其一般根据需要使用。

[0181] <本发明的转化的宿主细胞>

[0182] 本发明的转化的宿主细胞包括用本发明的表达载体转化的宿主细胞，其选自下列(a)至(d)：

[0183] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

[0184] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

[0185] (c)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及

[0186] (d)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。

[0187] 在一种实施方式中，本发明的转化的宿主细胞是用本发明的表达载体转化的宿主细胞，其选自下列(a)至(d)：

[0188] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

[0189] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

[0190] (c)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸；以及

[0191] (d)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

[0192] 本发明的转化的宿主细胞的优选实例包括用包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞，以及用以下两个表达载体转化的宿主细胞，其中一个表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸。

[0193] 对所述转化的宿主细胞没有特别限制，只要所述宿主细胞适合于所使用的表达载体、被所述表达载体转化并且可以表达所述抗体即可。转化的宿主细胞的实例包括在本发明的领域中通常使用的各种不同细胞，例如天然细胞或人工建立的细胞(例如动物细胞(例如CHO-K1SV细胞)，昆虫细胞(例如Sf9)，细菌(例如大肠埃希氏杆菌)，酵母(例如酵母菌或毕赤酵母)等)。优选地，可以使用培养的细胞例如CHO细胞(CHO-K1SV细胞、CHO-DG 44细胞等)、293细胞或NS0细胞。

[0194] 对转化所述宿主细胞的方法没有特别限制，但可以使用例如磷酸钙方法或电穿孔方法。

[0195] <生产本发明的抗人Tie2抗体的方法和通过所述方法生产的抗人Tie2抗体>[0196] 用于生产本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的方法的实例包括一种生产抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养选自下列(a)至(c)的宿主细胞以表达四价抗人Tie2抗体或其抗原结合片段：

[0197] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；

[0198] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸；以及[0199] (c)两种宿主细胞，一种宿主细胞用包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化，另一种宿主细胞用包含含有编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化。

[0200] 在一种实施方式中，用于生产本发明的抗人Tie2抗体的方法的实例包括一种用于生产抗人Tie2抗体的方法，所述方法包括培养选自下列(a)至(c)的宿主细胞以表达抗人Tie2抗体：

[0201] (a)一种用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；

[0202] (b)一种用以下两个表达载体转化的宿主细胞：一个表达载体包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸，另一个表达载体包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸；以及

[0203] (c)两种宿主细胞，一种宿主细胞用包含含有编码本发明的抗人Tie2抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化，另一种宿主细胞用包含含有编码所述抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化。

[0204] 对用于生产本发明的抗人Tie2抗体的方法没有特别限制，只要它包含培养本发明的转化的宿主细胞以表达所述抗人Tie2抗体的步骤即可。在所述方法中使用的优选的宿主细胞的实例包括如上所述的本发明的优选的转化的宿主细胞。

[0205] 所述转化的宿主细胞可以通过已知方法来培养。适当地选择培养条件例如温度、培养基的pH和培养时间。在所述宿主细胞是动物细胞的情况下，培养基的实例包括增补有约5％至20％的胎牛血清的MEM培养基(Science,1959,Vol.130,No.3373,p.432 to 7)、DMEM培养基(Virology,1959,Vol.8,p.396)和RPMI1640培养基(J.Am.Mde.Assoc.,1967,Vol.199,p.519)、199培养基(Exp.Biol.Med.,1950,Vol.73,p.1 to 8)。所述培养基的pH优选地约为6至8，并且培养通常在约30℃至40℃下进行约15小时至72小时，同时如有必要，通入空气并搅拌。在所述宿主细胞是昆虫细胞的情况下，作为培养基，可以使用例如增补有胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,Vol.82,p.8404)。所述培养基的pH优选为约5至8，并且培养通常在约20℃至40℃下进行约15小时至100小时，同时如有必要，通入空气并搅拌。在所述宿主细胞是大肠埃希氏杆菌或酵母的情况下，作为培养基，例如增补有营养源的液体培养基是适合的。优选地，所述营养培养基含有所述转化的宿主细胞生长所必需的碳源、无机氮源或有机氮源。所述碳源的实例包括葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉和蔗糖，所述无机氮源或有机氮源的实例包括铵盐、硝酸盐、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、大豆粉和马铃薯提取物。如果需要，可以包含其他营养物(例如无机盐(如氯化钙、磷酸二氢钠和氯化镁)、维生素)和抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素和卡那霉素)。所述培养基的pH优选为约5至8。在所述宿主细胞是大肠埃希氏杆菌的情况下，培养基的优选实例包括LB培养基和M9培养基(Mol.Clo.,Cold Spring Harbor Laboratory,Vol.3,A2.2)。培养通常在约14℃至39℃下进行约3小时至24小时，同时如有必要，通入空气并搅拌。在所述宿主细胞是酵母的情况下，作为培养基，可以使用例如Burkholder最低培养基(Proc.Natl.Acad,Sci,USA,1980,Vol.77,p.4505)。培养通常在约20℃至35℃下进行约14小时至144小时，同时如有必要，通入空气并搅拌。通过以上述方式进行培养，可以表达本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。

[0206] 所述生产本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的方法除了培养本发明的转化的宿主细胞以表达所述抗人Tie2抗体或其抗原结合片段之外，还可以包括从所述转化的宿主细胞回收、优选地分离或纯化所述抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。分离或纯化方法的实例包括利用溶解度的方法例如盐析和溶剂沉淀方法，利用分子量差异的方法例如透析、超滤和凝胶过滤，利用电荷的方法例如离子交换层析和羟基磷灰石层析，利用特定亲和性的方法例如亲和层析，利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱，以及利用等电点差异的方法例如等电聚焦电泳。优选地，积累在培养上清液中的抗体可以通过各种不同的层析例如使用蛋白A柱或蛋白G柱的柱层析来纯化。

[0207] 本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段还包括通过所述生产本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的方法生产的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。

[0208] <本发明的药物组合物>

[0209] 本发明的药物组合物包括包含本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段和可药用赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以通过通常使用的方法，使用本领域中常用的赋形剂即用于药物的赋形剂或用于药物的载体来制备。所述药物组合物的剂型的实例包括肠胃外药物例如注射药物和滴注药物，并且这些药物可以通过静脉内给药、皮下给药、眼内给药等来给药。在药物制备中，符合所述剂型的赋形剂、载体和添加剂可以在制药学上可接受的范围内使用。

[0210] 本发明的药物组合物可以包含多种本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段。例如，本发明包括包含不经历翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段以及源自于所述抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

[0211] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的药物组合物包括如下所述的药物组合物。

[0212] 一种药物组合物，其包含一种抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包含4个重链可变区和4个轻链可变区，所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，所述轻链可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成，一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或其抗原结合片段包含4个抗原结合位点；以及源自于所述抗体或其抗原结合片段的翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段。

[0213] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体的药物组合物包括如下所述的药物组合物。

[0214] 一种药物组合物，其包含：一种抗人Tie2抗体，所述抗体是抗人Tie2抗体和通过所述抗体的翻译后修饰形成的抗体，其包含两条重链和四条轻链，其中每条重链包含两个由重链可变区以及CH1区构成的结构、CH2区和CH3区，所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，并且一个所述结构的C端通过连接物连接到另一个结构的N端，并且每条轻链包含由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区，和轻链恒定区，并且所述抗体包含四个抗原结合位点；以及源自于所述抗体的翻译后修饰的抗体。

[0215] 本发明的药物组合物还包括一种药物组合物，其包含其中重链C端的赖氨酸被缺失的抗体、N端具有翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段、其中重链C端的赖氨酸被缺失并且对N端做出翻译后修饰的抗体、和/或在重链的C端中具有赖氨酸并且N端没有翻译后修饰的抗体。

[0216] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体的药物组合物包括一种药物组合物，其包含选自下列(1)至(4)的至少两种抗人Tie2抗体。

[0217] (1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0218] (2)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0219] (3)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0220] (4)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0221] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体的药物组合物包括一种药物组合物，其包含选自下列(1)至(4)的至少两种抗人Tie2抗体。

[0222] (1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：6的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0223] (2)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：6的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0224] (3)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：6的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0225] (4)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0226] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体的药物组合物包括一种药物组合物，其包含选自下列(1)至(4)的至少两种抗人Tie2抗体。

[0227] (1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：8的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0228] (2)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：8的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0229] (3)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：8的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0230] (4)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0231] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体的药物组合物包括一种药物组合物，其包含选自下列(1)至(4)的至少两种抗人Tie2抗体。

[0232] (1)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：10的第1至675位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0233] (2)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：10的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0234] (3)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：10的第1至675位氨基酸的氨基酸序列构成并且其中第1位氨基酸的谷氨酸被修饰成焦谷氨酸的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0235] (4)一种抗人Tie2抗体，其包含两条由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链。

[0236] 在一种实施方式中，本发明的包含抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的药物组合物还包括如下所述的药物组合物。

[0237] 一种药物组合物，其包含：包含两条由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体；包含两条由SEQ ID NO：2的第1至678位氨基酸的氨基酸序列构成的重链和四条由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人Tie2抗体；以及可药用赋形剂。

[0238] 在配方中添加的本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段的量随着症状程度和患者年龄、待使用的制剂的剂型、抗体的结合滴度等而变，例如，可以使用约0.001mg/kg至100mg/kg的添加量。

[0239] 本发明的药物组合物可作为药剂用于预防或治疗与血管相关的疾病例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、脓毒症、急性肝障碍、急性肾障碍、急性肺障碍、系统性炎性反应综合征、外周动脉阻塞性疾病或严重肢体缺血。

[0240] 本发明包括用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血的药物组合物，其包含本发明的抗人Tie2抗体。此外，本发明包括用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血的方法，所述方法包括给药有效量的本发明的抗人Tie2抗体。此外，本发明包括用于预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血的本发明的抗人Tie2抗体。另外，本发明包括本发明的抗人Tie2抗体的用途，其用于制备药物组合物以预防或治疗糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变或严重肢体缺血。

[0241] <融合抗体和修饰抗体>

[0242] 使用本领域中已知的方法，本领域的任何技术人员可以制备将抗体或其抗原结合片段与另一个肽或蛋白质融合的融合抗体，并且也可以制备结合有修饰剂的修饰抗体。本发明的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包括采取这种融合或修饰形式的抗体及其抗原结合片段。例如，所述抗人Tie2抗体或其抗原结合片段包括与另一个肽或蛋白质融合的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段和结合有修饰剂的抗人Tie2抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含4个重链可变区和4个轻链可变区，其中所述重链可变区由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，所述轻链可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成，一个所述重链可变区和一个所述轻链可变区组成一个抗原结合位点，并且所述抗体或其抗原结合片段包含4个抗原结合位点。对用于所述融合体中的所述另一个肽或蛋白没有特别限制，只要本发明的抗体或其抗原结合片段作为融合体对人Tie2具有结合活性即可，其实例包括人血清白蛋白、各种标签肽、人造螺旋基序肽、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、各种不同毒素和能够促进多聚体化的其他肽或蛋白质。对用于所述修饰中的修饰剂没有特别限制，只要本发明的抗体或其抗原结合片段作为修饰抗体对人Tie2具有结合活性即可，其实例包括聚乙二醇、糖链、磷酯类、脂质体和低分子量化合物。

[0243] 本发明已被描述，并且为更好的理解而参考的具体实施例将被提供，但是它们仅仅是实例，并且本发明不限于此。实施例

[0244] 对于使用可商购试剂盒或试剂的部分来说，除非另有具体指明，否则实验按照所描述的流程来进行。为方便起见，以mol/L为单位的浓度用M表示。例如，1M氧化钠水溶液意味着1mol/L的氧化钠水溶液。

[0245] (实施例1：生产抗人Tie2抗体的杂交瘤的制备)

[0246] 使用“VelocImmune”(VelocImmune抗体技术：Regeneron公司.(美国专利号6596541))-人单克隆抗体开发技术-小鼠来制备抗体。将重组人Tie2-Fc嵌合蛋白(R&D，
313-TI-100)与用于引起免疫反应的佐剂一起注射到VelocImmune小鼠中，以便进行免疫接种。按照通常方法，提取被免疫接种小鼠的淋巴结，收集淋巴细胞并与小鼠来源的骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC：CRL-1581)进行细胞融合，由此制备杂交瘤。将所述杂交瘤单克隆化，并将每个克隆培养在作为无血清培养基的CD杂交瘤培养基(Invitrogen)中。使用蛋白G柱(GE Healthcare)从得到的培养上清液纯化抗体。所述使用VelocImmune技术获得的抗体是具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(也被称为嵌合抗体)。

[0247] (实施例2：细胞ELISA测定法)

[0248] 为了测量所述抗体的抗原结合活性，使用表达人Tie2的CHO细胞、表达猴Tie2的CHO细胞、表达大鼠Tie2的CHO细胞和表达小鼠Tie2的CHO细胞，通过细胞ELISA测定法各自评估所述抗体与人Tie2、猴Tie2、大鼠Tie2和小鼠Tie2的结合。

[0249] (实施例3：使用修饰的Ang-1评估竞争活性)

[0250] 为了评 估所述 抗体的A ng-2 竞争活性 ，评估了 修饰的 Ang- 1(Proc.Natl.Acad.Sci.,2004,Vol.101,pp.5547-5552，也被称为COMP-Ang1)与Tie2的结合的抑制。COMP-Ang1是一种修饰的Ang-1，其中不参与结合到Tie2的位点被修饰，并且从COMP-Ang1与Tie2的结合能力得以维持(Proc.Natl.Acad.Sci.2004,Vol.101,pp.5547-
5552)，并且Ang-1和Ang-2以相同的亲和力水平结合到Tie2的相同位点(Science,1997,Vol.277,pp.55-60)的观点来看，它对抗Ang-2的竞争作用可以通过评估对抗COMP-Ang1的竞争作用来评估。

[0251] 将COMP-Ang1的表达载体导入到HEK293细胞中。从所述HEK293细胞的培养上清液纯化COMP-Ang1并进行生物素标记。将所述生物素标记的COMP-Ang1与在实施例1中获得的纯化的抗体混合，并将所述混合物添加到固定化有重组人Tie2-Fc嵌合蛋白的板。为了检测由此结合的生物素标记的COMP-Ang1，使用链亲和素标记的HRP。向其添加TMB显色剂(Dako,S1599)并静置。此外，随后向其添加2M硫酸以终止反应，并测量在450nm处的吸收。通过这种方式，评估了所述抗体对抗COMP-Ang1的竞争作用。

[0252] (实施例4：使用表达人Tie2的BaF3细胞评估抗凋亡活性)

[0253] 稳定表达人Tie2的小鼠原B细胞株BaF3细胞(在后文中也被称为表达人Tie2的BaF3细胞)，按照在Immunity,1998,Vol.9,pp.677-686中描述的方法，通过电穿孔将含有由SEQ ID NO：21所示的人Tie2基因的质粒导入到所述细胞中来制备。随后，使用同一细胞来评估抗体的抗凋亡活性。

[0254] 将表达人Tie2的BaF3细胞以2×105个细胞/mL悬浮在增补有0.05％胎牛血清白蛋白的RPMI1640培养基(Life Technologies)中，并以每孔80μL的量分配在96孔板中用于悬浮细胞(住友电木株式会社,MS-8096R)。随后，向其添加20μL在实施例1中获得的纯化的抗体或Ang-1。在设置到37℃的CO2温育箱中培养72小时后，将50μL细胞悬液转移到白色96孔板(Nunc,236108)。按照细胞内ATP定量试剂CellTiter Glo发光细胞存活率试剂盒(Promega)，通过向细胞悬液添加50μL用随附的缓冲液稀释的底物溶液，测量细胞的存活率，由此评估抗凋亡活性。

[0255] 从实施例2至4的结果，发现了对人Tie2、猴Tie2、大鼠Tie2和小鼠Tie2具有结合活性，具有COMP-Ang1竞争活性并对人Tie2具有抗凋亡活性的多个抗体。包含将在后文中描述的被命名为2-16的抗人Tie2抗体的纯化的抗体溶液，表现出与实施例4中的Ang-1基本上相同的抗凋亡活性，但包含小鼠抗人Tie2抗体15B8(专利文献1)的纯化的抗体溶液仅表现出Ang-1的最大活性的约60％。

[0256] (实施例5：使用尺寸排阻层析和电泳分析纯化的抗体溶液)

[0257] 将在上面的实施例2至4中鉴定的纯化的抗体溶液通过尺寸排阻层析进行分析。作为结果，从相应的纯化的抗体溶液检测到3个级分。作为通过电泳分析相应级分溶液的结果，发现相应的级分分别包括所述抗体的单体、二聚体、三聚体或更高价的多聚体。

[0258] 接下来，通过实施例4中示出的方法评估相应级分溶液的抗凋亡活性。作为结果，在包含二聚体的级分和包含三聚体或更高价多聚体的级分中，识别到强烈的抗凋亡活性。另一方面，在包含来自于相应抗体的单体的级分中，基本上不能识别到抗凋亡活性。也通过尺寸排阻层析对15B8进行了如上所述的分析，并且作为结果，检测到显示出二聚体或更高价多聚体的级分，但是基本上未检测到包含单体的级分。

[0259] 从上述结果发现，在实施例2至4中鉴定的任何抗体中，包含形成为二聚体或更高阶多聚体的抗体的级分涉及强烈的抗凋亡活性。已建议，具有四价或更高价的抗体通过Tie2活化具有强的抗凋亡活性，因为二聚体是四价抗体。

[0260] (实施例6：通过交联抗体评估抗凋亡活性)

[0261] 从实施例5中的调查，认为将抗人Tie2抗体的价数调整到4或更高，对于通过Tie2诱导抗凋亡活性来说是重要的。因此，评估了通过与抗小鼠IgG抗体进行交联而多聚体化的抗人Tie2抗体的抗凋亡活性。作为细胞，使用表达人Tie2的BaF3细胞和内源性表达人Tie2的人血管内皮细胞HUVEC。

[0262] 将表达人Tie2的BaF3细胞和HUVEC分别培养在RPMI1640培养基和EBM-2无血清培养基(Lonza)中，已向所述培养基添加了包含在实施例2至4中鉴定到的抗人Tie2抗体的抗体溶液。向其添加抗小鼠IgG抗体以交联所述抗体。通过使用CellTiter Glo发光细胞存活率测定法，测量细胞的存活率。通过计算存活率，对抗凋亡活性进行评估。

[0263] 作为结果，发现被命名为2-16的抗人Tie2抗体(嵌合抗体)的交联的抗体对人Tie2具有强烈的抗凋亡活性。

[0264] (实施例7：二价抗人Tie2抗体的测序)

[0265] 从生产抗人Tie2抗体2-16的杂交瘤克隆编码抗体的重链和轻链的基因，并进行测序。

[0266] 在对抗体测序后，将2-16的轻链和重链的构架区(FR)用另一个人抗体的FR替换，以便提高抗体的物理性质和稳定性，由此制备了改造的抗人Tie2抗体2-16A2的可变区。

[0267] 将编码信号序列的基因(Protein Engineering,1987,Vol.1,No.6,pp.499-505)和人Igγ1恒定区基因(由SEQ ID NO：11的第367至1356位碱基的碱基序列构成)分别连接到2-16A2的重链可变区基因的5’侧和3’侧，并将所述重链基因插入到GS载体pEE6.4中。另外，将编码信号序列的基因(Protein Engineering,1987,Vol.1,No.6,pp.499-505)和人κ链的恒定区基因(由SEQ ID NO：3的第340至657位碱基的碱基序列构成)分别连接到轻链可变区基因的5’侧和3’侧。将该轻链基因插入到GS载体pEE12.4中。使用测序仪分析制备的抗体的重链基因序列和轻链基因序列。

[0268] 完全的人抗体2-16A2(完全的人2-16A2)的重链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：11和12示出。此外，所述抗体的轻链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：3和4示出。SEQ ID NO：12所示的重链的可变区由SEQ ID NO：12的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成，SEQ ID NO：4所示的轻链的可变区由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成。

[0269] 通过使用如上所述的已各自插入完全的人2-16A2的重链和轻链的基因的GS载体，通过使用两种方法即瞬时表达和稳定表达来进行所述抗体的表达。对于瞬时表达来说，使用转染试剂盒293Fectin(Invitrogen)，将在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中培养的FreeStyle 293细胞(Invitrogen)以约1,000,000个细胞/mL的密度用如上所述的重链和轻链的两种表达载体转染，并培养5天。或者，使用转染试剂盒ExpiFectamine 293转染试剂盒(Invitrogen)，将在Expi 293表达培养基(Invitrogen)中培养的Expi 293细胞(Invitrogen)以约3,000,000个细胞/mL的密度用如上所述的重链和轻链的两种表达载体转染，并培养7天。或者，使用电穿孔方法，将在CD-CHO培养基(Invitrogen)中培养的CHO-K1SV细胞(Lonza)以约10,000,000个细胞/mL的密度用如上所述的重链和轻链的两种表达载体转染，并培养7天。使用蛋白A柱或蛋白G柱(GE HealthCare)从每种培养上清液纯化所述完全的人抗体。对于稳定表达来说，将如上所述的已各自插入有抗体的重链和轻链基因的GS载体用限制性酶NotI和PvuI消化，并使用作为用于连接的试剂盒的Ligation-Convenience试剂盒(NIPPONGENE)或连接试剂Ligation high Ver.2(TOYOBO)进行连接，由此构建其中插入有重链和轻链两个基因的GS载体。通过将所述表达载体转染到CHO-K1SV细胞中来表达所述抗体。通过蛋白A柱、蛋白G柱或MabSelect SuRe(GE Healthcare,17-5438-02)从培养上清液纯化所述完全的人抗体。

[0270] (实施例8：四价抗人Tie2抗体的制备)

[0271] 制备四价抗人Tie2抗体。在本实施例中制备的四价抗体包括两条重链和四条轻链。每条重链包含两个由重链可变区和CH1区构成的结构，并且还包含CH2区和CH3区，其中一个由重链可变区和CH1区构成的结构的C端通过连接物连接到另一个结构的N端。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。本四价抗体的格式示出在图1中。

[0272] 制备了编码四价抗人Tie2抗体重链的基因，在所述重链中将由完全的人2-16A2的重链可变区和CH1区构成的结构(由SEQ ID NO：12的第1至220位氨基酸的氨基酸序列构成)的C端，通过由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列构成的连接物连接到完全的人2-16A2重链的N端。将编码信号序列的基因(Protein Engineering,1987,Vol.1,No.6,pp.499-505)连接到制备的重链基因的5’侧，并插入到GS载体pEE6.4中。将上述重链载体和其中插入有在实施例7中制备的完全的人抗体2-16A2的轻链基因的GS载体pEE12.4组合，使用与实施例7中描述的相同的抗体表达和纯化方法来制备四价抗人Tie2抗体。所述四价抗人Tie2抗体被称为TIE-1-Igγ1-WT。

[0273] 制备了编码四价抗人Tie2抗体重链的基因，所述重链的TIE-1-Igγ1-WT的重链恒定区已被人Igγ4恒定区(由SEQ ID NO：10的第123至220位氨基酸的氨基酸序列构成，并由SEQ ID NO：10的第350至676位氨基酸的氨基酸序列构成)置换，并具有氨基酸突变S228P和L235E。将编码信号肽的基因(Protein Engineering,1987,Vol.1,No.6,pp.499-505)连接到制备的重链基因的5’侧，并插入到GS载体pEE6.4中。将上述重链载体和其中插入有在实施例7中制备的完全的人2-16A2的轻链基因的GS载体pEE12.4组合，使用与实施例7中描述的相同的抗体表达和纯化方法来制备四价抗人Tie2抗体。所述具有IgG4的四价抗人Tie2抗体被称为TIE-1-Igγ4-PE。

[0274] TIE-1-Igγ1-WT的重链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：7和8示出。TIE-1-Igγ4-PE的重链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：9和10示出。所述两种抗体的轻链与完全的人抗体2-16A2的轻链相同，所述抗体的轻链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：3和4示出。

[0275] 通过使用相同的方法，制备了其中已向TIE-1-Igγ1-WT的重链的恒定区导入氨基酸变异L234A、L235A和P331S的四价抗人Tie2抗体(被称为TIE-1-Igγ1-LALA)和其中已向TIE-1-Igγ1-WT的重链的恒定区导入氨基酸变异L234A、L235A、P331S和I253A的四价抗人Tie2抗体(被称为TIE-1-Igγ1-I253A)。

[0276] TIE-1-Igγ1-LALA的重链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：1和2示出。TIE-1-Igγ1-I253A的重链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：5和6示出。所述两种抗体的轻链与完全的人2-16A2的轻链相同，所述抗体的轻链的碱基序列和由所述碱基序列编码的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：3和4示出。

[0277] 由SEQ ID NO：2、6、8和10示出的四种四价抗人Tie2抗体的重链的可变区是共同的，并由SEQ ID NO：2的第1至122位氨基酸的氨基酸序列构成。所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3各自由SEQ ID NO：2的第31至35、50至66和99至111位氨基酸的氨基酸序列构成。

[0278] 由SEQ ID NO：4示出的四种四价抗人Tie2抗体的轻链的可变区各自由SEQ ID NO：4的第1至113位氨基酸的氨基酸序列构成。所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：4的第24至39、55至61和94至102位氨基酸的氨基酸序列构成。

[0279] 作为纯化的TIE-1-Igγ1-LALA的氨基酸修饰分析的结果，发现在大多数纯化的抗体中，发生了在重链的C端处赖氨酸的缺失。

[0280] 此外，通过使用相同的方法，制备了四价抗人Tie2抗体(总共11种)，其中相对于TIE-1-Igγ1-WT和TIE-1-Igγ4-PE，连接物(由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列构成)已被其他连接物(四种相对于TIE-1-Igγ1-WT由SEQ ID NO：17至20所示的氨基酸序列构成的连接物，和七种相对于TIE-1-Igγ4-PE由SEQ ID NO：14至20所示的氨基酸序列构成的连接物)置换。调查了长度为7个氨基酸的连接物(由SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列构成的连接物)至长度为64个氨基酸的连接物(由SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列构成的连接物)。

[0281] 作为对TIE-1-Igγ1-WT、TIE-1-Igγ4-PE和11种其中连接物已被置换的抗体进行调查的结果，发现按照实施例4的方法，所有抗人Tie2抗体具有基本上相同的抗凋亡活性。

[0282] (实施例9：二价抗人Tie2抗体和四价抗人Tie2抗体的抗凋亡作用的评估)[0283] 从实施例5的结果，已建议四价或更高价抗体通过人Tie2活化具有强烈的抗凋亡活性。因此，通过测量对表达人Tie2的BaF3细胞的抗凋亡作用作为指标，将二价抗人Tie2抗体的效能与四价抗人Tie2抗体的效能进行比较。

[0284] 按照实施例4的方法，使用表达人Tie2的BaF3细胞，评估了作为二价抗体的完全的人2-16A2和作为四价抗体的TIE-1-Igγ1-WT的抗凋亡作用。将作为试验抗体的完全的人2-16A2和TIE-1-Igγ1-WT通过MabSelect SuRe进行纯化并通过尺寸排阻层析分级成单体级分，由此分别获得99.98％和99.74％的单体纯度。将相应的抗体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以约3倍的共同比率通过7步稀释到5ng/mL至5000ng/mL，并以每孔20μL的量添加。作为对照，分别制备代替试验抗体已添加PBS或用PBS稀释的Ang-1(R&D，923-AN-025/CF，终浓度为
1ng/m至1000ng/mL，以约3倍的共同比率通过7步稀释)的孔。为了计算在每个试验抗体浓度下的抗凋亡活性，将代替试验抗体添加PBS的孔的实测值设定到0％，并将代替试验抗体分别添加浓度为300ng/mL和1000ng/mL的Ang-1的孔的实测值的平均值设定到100％。通过使用Sigmoid-Emax模型非线性回归分析来分析计算的抗凋亡活性，来计算试验抗体的EC50值。

[0285] 表1：二价抗人Tie2抗体和四价抗人Tie2抗体的抗凋亡活性

[0286] [表1]

[0287]  EC50值 抗凋亡活性的最大活性
TIE-1-Igγ1-WT 7.10ng/mL 104％
完全的人2-16A2 37.6ng/mL 22％

[0288] 作为结果，已发现作为四价抗体的TIE-1-Igγ1-WT具有强烈抗凋亡作用。从上述结果发现，四价抗体与二价抗体相比具有优越的抗凋亡活性。

[0289] (实施例10：在大鼠中二价抗人Tie2抗体和四价抗人Tie2抗体的血管通透性抑制作用的评估)

[0290] 芥子油诱导的血管通透性模型是一种对已被广泛用作血浆渗漏评估系统的Miles测定法(J.Physiol.,1952,Vol.118,pp.228-257)做出改良的模型，并且已报道在这种模型中Ang-1抑制血管通透性增高(Nature Medicine,2000,Vol.6,pp.460-463)。因此，为了比较二价抗人Tie2抗体与四价抗人Tie2抗体的血管通透性抑制作用，使用这种模型评估了完全的人2-16A2和TIE-1-Igγ1-WT。

[0291] 将用PBS稀释的完全的人2-16A2或TIE-1-Igγ1-WT皮下给药到SD大鼠(雄性，4-5周龄，日本Charles River Laboratories公司)。处理组如下设置。

[0292] [处理组(每组6只大鼠)]

[0293] 介质组：

[0294] 代替抗体给药PBS的组

[0295] 完全的人2-16A2给药组：

[0296] 给药完全的人2-16A2(0.3mg/kg)的组

[0297] TIE-1-Igγ1-WT给药组：

[0298] 给药TIE-1-Igγ1-WT(0.3mg/kg)的组

[0299] 在抗体给药后48小时，静脉内给药溶解在生理盐水中的伊文思蓝染料(45mg/kg，Sigma-Aldrich Corporation,E2129)，立即将用矿物油(Sigma-Aldrich Corporation,M8410)稀释的5％异硫氰酸烯丙酯(也被称为芥子油，Nacalai Tesque公司,01415-92)施加到一只耳上，同时将矿物油施加到对侧耳上，量为20μL。30分钟后，对两只耳取样、称重，然后浸泡在1mL甲酰胺中，并在70℃下温育过夜，以提取耳组织中的伊文思蓝染料。从提取物的吸收值(测量波长为620nm，对照波长为740nm)确定伊文思蓝染料浓度，以计算提取物中伊文思蓝染料的量。随后，通过用伊文思蓝染料的量除以耳的重量，计算每单位重量的耳的染料泄漏量。计算通过从同一个体中其上施加有芥子油的耳的伊文思蓝染料的泄漏量中减去其上施加有矿物油的耳的伊文思蓝染料的泄漏量而获得的量，作为每个个体的伊文思蓝染料的最终泄漏量。将所述伊文思蓝染料的泄漏量用作血管通透性的指标。结果示出在图2中。

[0300] 确定每个组的平均值和标准误差。使用Student t-检验来确定介质组与每个给药抗体的组之间的显著差异。p<0.05的情况意在指示存在显著差异。

[0301] 如图2中所示，与介质组相比，作为二价抗体的完全的人2-16A2不抑制染料泄漏，而作为四价抗体的TIE-1-Igγ1-WT显著抑制染料泄漏。已发现，作为四价抗体的TIE-1-Igγ1-WT抑制血管通透性增高。从上述结果发现，与二价抗体相比，四价抗体具有优越的血管通透性增高抑制作用。

[0302] 从实施例9和10的结果发现，四价抗Tie2抗体强烈诱导通过Tie2的作用。

[0303] (实施例11：四价抗人Tie2抗体的抗凋亡作用的评估(2))

[0304] 对于TIE-1-Igγ1-LALA和TIE-1-Igγ1-I253A来说，按照实施例9的方法，在表达人Tie2的BaF3细胞上评估了所述抗体的抗凋亡活性。在与实施例9中相同的浓度范围内，进行每种四价抗人Tie2抗体的评估。就此而言，当将已添加每种100ng/mL、300ng/mL和1000ng/mL Ang-1的孔的实测值的平均值取为100％时，评估每种抗体的EC50值和抗凋亡活性的最大活性。

[0305] 表2：每种四价抗人Tie2抗体的抗凋亡活性

[0306] [表2]

[0307]  EC50值 抗凋亡活性的最大活性
TIE-1-Igγ1-LALA 3.65ng/mL 88％
TIE-1-Igγ1-I253A 5.06ng/mL 94％

[0308] 作为结果，已发现TIE-1-Igγ1-LALA和TIE-1-Igγ1-I253A两者表现出与Ang-1基本上等同的抗凋亡活性。

[0309] (参比例1：15B8的抗凋亡作用的评估)

[0310] 对于15B8来说，按照实施例9的方法，在表达人Tie2的BaF3细胞上评估了抗凋亡活性。在与实施例9中相同的抗体浓度范围内，进行15B8(专利文献1)的评估。以与用于Ang-1相同的方式，进行Ang-2(R&D,623-AN-025)的评估。就此而言，当将已添加1000ng/mL Ang-1的孔的实测值的平均值取为100％时，评估EC50值和抗凋亡活性的最大活性。

[0311] 表3：15B8的抗凋亡活性

[0312] [表3]

[0313]   EC50值 抗凋亡活性的最大活性15B8 26.6ng/mL 64％
Ang-2 39.3ng/mL 67％

[0314] 作为结果，已发现15B8的抗凋亡活性约为Ang-1的64％，并具有与Ang-2基本上等同的抗凋亡活性。

[0315] 当与实施例11的结果相结合时，发现TIE-1-Igγ1-LALA表现出与Ang-1基本上等同的抗凋亡活性，而15B8表现出与Ang-2基本上等同的部分抗凋亡活性。

[0316] (实施例12：TIE-1-Igγ1-LALA对Tie2的结合活性的评估)

[0317] 对于TIE-1-Igγ1-LALA来说，评估了对每个物种的Tie2蛋白的结合活性。在PBS中制备1μg/mL的重组人Tie2-Fc嵌合蛋白(R&D,313-TI-100)、重组猴Tie2-Fc嵌合蛋白(Sino Biological公司,90292-C02H)、重组大鼠Tie2-Fc嵌合蛋白(R&D,3874-T2-100)或重组小鼠Tie2-Fc嵌合蛋白(R&D,762-T2-100)，以每孔20μL的量添加到白色Maxisorp 384孔板(Nunc,460372)，并在4℃下温育过夜以进行固定。第二天，除去固定化溶液，并以每孔50μL的量向其添加含有20％Blocking One(Nacalai Tesque公司,03953-95)的Tris缓冲盐水(TBS)-0.05％Tween(Wako,310-7375)(在后文中被称为TBS-T溶液)，在室温留置1小时。将作为试验抗体的TIE-1-Igγ1-LALA用含有5％Blocking One的TBS-T溶液以3倍的共同比率通过8步稀释到0.03ng/mL至100ng/mL，并以每孔20μL的量添加。作为对照，制备代替试验抗体添加有TBS-T溶液的孔。将得到的板在室温温育1.5小时，然后用TBS-T溶液清洗。作为第二抗体，以每孔20μL的量向其添加已用含有5％Blocking One的TBS-T溶液稀释到0.1μg/mL的生物素标记的抗人κ轻链抗体(免疫生物研究所,17249)。将得到的板在室温温育1小时，然后用TBS-T溶液清洗，并以每孔20μL的量向其添加已用含有5％Blocking One的TBS-T溶液稀释到0.1μg/mL的碱性磷酸酶标记的链亲和素(Thermo Fisher Scientific公司,21324)。将得到的板在室温温育1小时，然后用TBS-T溶液清洗，并以20μL的量添加作为底物的已用含有1mM MgCl2的20mM TBS(pH 9.8)稀释5倍的化学发光超灵敏AP微孔和/或膜底物(450nm)(BioFX,APU4-0100-01)。将得到的板在室温温育30分钟，然后通过EnVisionTM多标记物计数器(PerkinElmer公司)测量其化学发光。通过使用Sigmoid-Emax模型非线性回归分析计算的结合活性，来计算试验抗体的EC50值。

[0318] 表4：TIE-1-Igγ1-LALA的结合活性

[0319] [表4]

[0320]

[0321] 作为结果，已发现TIE-1-Igγ1-LALA对人Tie2、猴Tie2、大鼠Tie2和小鼠Tie2具有基本上同样高的结合活性。

[0322] (参比例2：15B8对Tie2的结合活性的评估)

[0323] 按照实施例12的方法，评估了15B8对每个物种的Tie2蛋白的结合活性。就此而言，使用HRP标记的抗小鼠κ轻链抗体(SouthernBiotech,1050-05)作为第二抗体、TMB显色剂作为底物和ARVO多标记物读板器(PerkinElmer公司)作为测量装置，测量在450nm处的吸收值。此外，以约3倍的共同比率将15B8抗体浓度调整为从1000ng/mL至0.3ng/mL(通过8步稀释)，作为试验抗体。通过使用Sigmoid-Emax模型非线性回归分析计算的结合活性，来计算试验抗体的EC50值(表5)。

[0324] 表5：15B8的结合活性

[0325] [表5]

[0326]

[0327] 作为结果，观察到15B8对人Tie2和猴Tie2具有结合活性，但发现15B8对大鼠Tie2和小鼠Tie2具有低的结合活性。

[0328] 从实施例12的结果观察到TIE-1-Igγ1-LALA对人Tie2、猴Tie2、大鼠Tie2和小鼠Tie2具有高的结合活性，在其中没有物种差异。另一方面，观察到15B8在结合活性中具有物种差异。从上述结果，提示TIE-1-Igγ1-LALA的人Tie2表位不同于15B8的表位。

[0329] (实施例13：大鼠中TIE-1-Igγ1-LALA的血管通透性抑制作用的评估)

[0330] 按照实施例10的方法，评估在大鼠中TIE-1-Igγ1-LALA的血管通透性抑制作用。就此而言，使用TIE-1-Igγ1-LALA作为试验抗体，并将抗体剂量调整为0.1mg/kg和0.3mg/kg。结果示出在图3中。

[0331] 确定每个组的平均值和标准误差。使用Dunnett多重比较检验来确定介质组与给药抗体的每个组之间的显著差异。p<0.05的情况意在指示存在显著差异。

[0332] 如图3中所示，与介质组相比，TIE-1-Igγ1-LALA显著抑制染料泄漏。从上述结果发现，TIE-1-Igγ1-LALA抑制血管通透性增高。

[0333] (实施例14：在具有周细胞丧失的小鼠中的视网膜水肿抑制作用)

[0334] 在患有糖尿病性视网膜病变的患者的视网膜血管中，周细胞的丧失是特征性病变之一(《视网膜》(Retina)，2013，第五版，pp.925-939)。尽管具有链脲霉素诱导的糖尿病的大鼠模型被广泛用于糖尿病性视网膜病变研究，但在下列方面所述模型的有用性存在限制：直至观察到周细胞的丧失要花费几个月的时间段，没有观察到据认为由周细胞的丧失引起视网膜微动脉瘤，周细胞与内皮细胞的比率与人的不同(《视网膜》(Retina)，2013，第五版，pp.925-939)，并且没有观察到明显的视网膜水肿(Diabetes Metab.J.,2013,Vol.37,pp.217-224)。另一方面，在通过给药抗PDGF受体β(PDGFRβ)抗体而使视网膜血管具有周细胞丧失的小鼠中，观察到与在糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿中看到的相似的病变，例如视网膜血管的扩张、视网膜水肿和出血，表明由于周细胞的丧失，血管被弱化，如同糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿，尽管没有观察到高血糖(J.Clin.Invest.,2002,Vol.110,pp.1619-1628)。因此，使用具有显示出周细胞丧失这种患有糖尿病性视网膜病变的患者中特征性的病变的病症的模型评估对视网膜水肿的抑制作用，可用于评估对糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的有效性。

[0335] 使用在J.Clin.Invest.,2002,Vol.110,pp.1619-1628中报道的方法并进行了略微修改，来制备由周细胞的丧失引起的视网膜水肿。也就是说，将用PBS稀释的抗PDGFRβ单克隆抗体1B3(WO 2008/130704)以25mg/kg的量皮下给药到出生后第二天的C57BL/6J小鼠(日本Charles River Laboratories公司)，以在视网膜血管中诱导周细胞的丧失。

[0336] [处理组]

[0337] 对照组：17只小鼠

[0338] 未给药抗PDGFRβ抗体并且给药PBS的组

[0339] 介质组：24只小鼠

[0340] 给药抗PDGFRβ抗体并且代替TIE-1-Igγ1-LALA给药PBS的组

[0341] TIE-1-Igγ1-LALA组(0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg)：分别为23只小鼠、21只小鼠和21只小鼠

[0342] 给药抗PDGFRβ抗体并且给药每种剂量的TIE-1-Igγ1-LALA的组

[0343] 在给药抗PDGFRβ抗体之前90分钟，将用PBS稀释的TIE-1-Igγ1-LALA以0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg皮下给药。在抗体给药后1周，评估视网膜水肿。具体来说，摘取眼球并用含有1％戊二醛和2.5％甲醛的溶液固定，然后制备石蜡包埋的切片移植物。使用虚拟载片扫描仪(NanoZoomer XR,Hamamatsu Photonics K.K.)对苏木精-曙红染色的样本进行扫描，以转变图像数据。在该模型中，报道了视网膜神经纤维层(NFL)中的视网膜水肿(J.Clin.Invest.,2002,Vol.110,pp.1619-1628)，因此通过使用NPD view 2(Hamamatsu Photonics公司)测量NFL和相邻的视网膜神经节细胞层的面积来进行视网膜水肿的定量。
结果示出在图4中。

[0344] 确定每个组的平均值和标准误差。使用Dunnett多重比较检验作为用于确定介质组与给药TIE-1-Igγ1-LALA的每个组之间的显著差异的测定法。使用Student t-检验作为用于确定对照组与介质组之间的显著差异的测定法。p<0.05的情况意在指示在每种情况下存在显著差异。

[0345] 如图4中所示，发现与介质组相比，TIE-1-Igγ1-LALA组(1mg/kg)显著抑制视网膜血管具有周细胞丧失的视网膜水肿。从TIE-1-Igγ1-LALA抑制由具有周细胞丧失的视网膜血管引起的视网膜水肿的观点来看，表明TIE-1-Igγ1-LALA对糖尿病性黄斑水肿和糖尿病性视网膜病变有效

[0346] (实施例15：在具有后肢缺血的小鼠中的缺血肢体血流改善作用)

[0347] 具有后肢缺血的模型是在后肢组织中对一侧后肢中血管进行结扎和切除引起的缺血的模型，并且也是用于评估缺血症状的改善的代表性模型(J.Vasc.Surg.,2012,Vol.56,pp.1669-1679)。

[0348] 在10周龄C57BL/6J小鼠(日本CLEA公司)中结扎左后肢上的股动脉和静脉的腹股沟区以及隐动脉和静脉。此外，在结扎其间的分支血管后，将结扎点之间的血管切除。手术在使用戊巴比妥钠(60mg/kg，东京化成工业)麻醉下进行。在血管切除后1周，使用激光多普勒灌注成像仪MoorLDI2(Moor Instruments公司)，在使用戊巴比妥的麻醉下测量后肢中的血流。在验证了待处理肢体中的血流减小之后，将处理组设置如下。

[0349] [处理组(每组10只小鼠)]

[0350] 对照组：

[0351] 代替抗体给药PBS的组

[0352] TIE-1-Igγ1-LALA组(1mg/kg)：

[0353] 给药TIE-1-Igγ1-LALA的组

[0354] 将用PBS稀释的TIE-1-Igγ1-LALA以1mg/kg的量皮下给药，并在抗体给药后1周测量正常肢体和缺血肢体的皮肤血流量。具体来说，将戊巴比妥钠(60mg/kg)腹膜内给药，然后置于加热板上，以便在麻醉剂给药后15分钟测量足部的皮肤血流。通过取足的底部部分作为目标区(ROI)测量的血流的结果，示出在图5中。

[0355] 确定每个组的平均值和标准误差。使用Student t-检验确定对照组与TIE-1-Igγ1-LALA组之间的显著差异。p<0.05的情况意在指明存在显著差异。

[0356] 如图5中所示，发现与对照组相比，TIE-1-Igγ1-LALA组显著提高正常肢体和缺血肢体的血流量。因此，表明了TIE-1-Igγ1-LALA对外周动脉疾病例如严重肢体缺血的有效性。

[0357] (实施例16：TIE-1-Igγ1-LALA的表位的评估：氢氘交换质谱术)

[0358] 为了鉴定TIE-1-Igγ1-LALA的识别表位，制备了实施例7中的完全的人2-16A2的Fab(在后文中被称为完全的人2-16A2-Fab)。由于完全的人2-16A2-Fab具有与TIE-1-Igγ1-LALA相同的可变区，因此这些抗体识别相同的表位。作为抗原，制备了由登录号NP_
000450.2的第1至452位氨基酸构成的人Tie2蛋白(在后文中被称为人Tie2(1-452))。所述氨基酸序列是在鉴定Ang-2的Tie2结合位点时使用的相同位点(Nat.Struct.Mol.Biol.,Vol.13,pp.524-532)。

[0359] 具体来说，通过将其中插入了编码由完全的人2-16A2的重链可变区和CH1区构成的结构(由SEQ ID NO：12的第1至221位氨基酸的氨基酸序列构成)的重链基因的GS载体pEE6.4和其中插入了完全的人2-16A2的轻链基因的GS载体pEE12.4相组合，并使用与实施例7中描述的用于抗体的表达方法和纯化方法相同的方法，制备了完全的人2-16A2-Fab。

[0360] 为了获得人Tie2(1-452)，首先，制备通过将人Fc(由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列构成)与作为连接物的凝血酶识别序列(由SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列构成)融合而获得的人Tie2(1-452)(在后文中被称为人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白)。具体来说，通过将编码人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白的基因插入到GS载体pEE12.4中，并使用与实施例7中描述的相同的表达方法和纯化方法，制备所述人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白。接下来，将制备的人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白与凝血酶(GE Healthcare,27-0846-01)在22℃温育16小时以切开Fc部分，并通过Benzamidine Sepharose 4Fast Flow(high sub)(GE Healthcare)和MabSelect SuRe除去凝血酶和人Fc，由此制备人Tie2(1-452).

[0361] 出于鉴定表位位点的目的，使用NanoAQUITY UPLC HDX系统(Waters)进行氢/氘交换质谱术(在后文中被称为H/D交换质谱术，Anal.Bioanal.Chem.,2010,Vol.397,pp.967-979)。

[0362] 具体来说，使用含有120mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液(pH 6)制备完全的人2-16A2-Fab和人Tie2(1-452)混合液体(终浓度分别为50μM和25μM)，并在37℃温育过夜。作为对照，使用含有120mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液(pH 6)制备仅含有人Tie2(1-452)的溶液。随后，将所述溶液添加到使用重水(关东化学)制备的PBS缓冲溶液，并分别温育20秒、1分钟、10分钟、60分钟和120分钟，进行氘化。然后，在0℃下向其添加含有100mM二硫苏糖醇(Nacalai Tesque)和4M盐酸胍(和光纯药)的水性溶液(pH 2.5)，然后使用胃蛋白酶柱(Proszyme(注册商标)，固定化的胃蛋白酶柱套，Applied Biosystems)进行消化，并将消化的肽用捕获柱(ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm VanGuard Pre-Column,Waters)捕获。然后，使用C18柱(AQUITY UPLC BEH C18 1.7μm,Waters)通过反相色谱进行分离，并使用质谱仪(SynaptG2-Si,Waters)测量分子量。计算所有检测到的肽的同位素分布的质心值，并与已经历氘交换的仅仅人Tie2(1-452)的同位素分布的质心值进行比较，根据每个氘化时间长度计算氘化置换存在的变化量。

[0363] 作为H/D交换质谱术的结果，证实了登录号NP_000450.2的第27至37、29至37、29至38、43至60、82至100、98至107、111至124、116至125、116至129、119至129、189至198和190至
198位氨基酸的肽在抗体共存的情况下具有被抑制的氘化。将这些肽的冗余结构域进行排列，此外，添加不具有受抑制的氘化的肽的信息，并考虑到N-端侧的两个氨基酸容易经历逆向变化(Proteins,1993,Vol.17,75-86)，发现了5个具有受抑制的氘化置换的区域作为表位候选位点，即登录号NP_000450.2的第29至38、84至102、113至120、126至129和191至198位氨基酸。此外，作为H/D交换质谱术的结果，发现在TIE-1-Igγ1-LALA与由这5个氨基酸区段构成的区域相互作用或在发生由抗体结合引起的立体结构改变或别构效应的情况下，这些残基受到保护以免于氢/氘交换。

[0364] (实施例17：TIE-1-Igγ1-LALA的表位的评估：表面等离子体共振分析和ELISA)[0365] 从实施例16的H/D交换质谱术鉴定了TIE-1-Igγ1-LALA的人Tie2的候选表位。为了预测详细的表位部分，制备了人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白的氨基酸突变体，并使用表面等离子体共振分析(SPR分析)和ELISA评估结合活性。

[0366] 在H/D交换质谱术的结果以及Ang-1和Ang-2结合到Tie2的区域的报告(Nat.Struct.Mol.Biol.,2006,Vol.13,pp.524-532；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,Vol.110,7205-7210)的基础上，制备了23种氨基酸突变蛋白作为人Tie2(1-452)的氨基酸突变蛋白，在所述突变蛋白中人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白中人Tie2(1-452)的第1至4个氨基酸被丙氨酸(在一种情况下，谷氨酸)替换(表6)。通过与用于实施例16中制备的人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白相同的制备方法，制备各种不同突变体。

[0367] 表6：突变的人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白

[0368] [表6]

[0369]

[0370]

[0371] 进行SPR分析以便评估人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白对完全的人2-16A2-Fab的结合活性。

[0372] 对于SPR分析来说，使用Biacore T200(GE Healthcare)。将抗人IgG(Fc)抗体(人抗体捕获试剂盒，GE Healthcare)固定在CM5传感器芯片上。允许用HBS-EP(GE Healthcare)稀释的5μg/mL的人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白各自固定，并测量捕获量。随后，将完全的人2-16A2-Fab用HBS-EP稀释到50 nM，并测量其与人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白的结合量。此外，通过用结合量除以捕获量，计算单位固定化的抗原中抗体的结合量(在后文中被称为结合比率)。三个实验的算术平均值和取人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白的结合比率为100％时每种突变蛋白的结合比率的相对值，示出在表7中。此外，代表性的测量数据示出在图6中。在Biacore中进行结合量的相对比较的方法，描述在例如Analytical Biochemistry,2003,Vol.312,pp.113-124中。

[0373] 作为结果，发现与人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白相比，在人Tie2(1-452)g1-Fc、人Tie2(1-452)g2-Fc、人Tie2(1-452)g3-Fc、人Tie2(1-452)g4-Fc、人Tie2(1-452)g5-Fc、人Tie2(1-452)m3-Fc、人Tie2(1-452)A1-Fc、人Tie2(1-452)A2-Fc、人Tie2(1-452)A3-Fc和人Tie2(1-452)A4-Fc中完全的人2-16A2-Fab的结合降低。

[0374] 表7：SPR分析的结果

[0375] [表7]

[0376]  结合比率 相对值(％)
人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白 0.29 100
人Tie2(1-452)r1-Fc 0.29 102
人Tie2(1-452)r2-Fc 0.28 98
人Tie2(1-452)r3-Fc 0.34 119
人Tie2(1-452)r4-Fc 0.33 113
人Tie2(1-452)r5-Fc 0.29 99
人Tie2(1-452)r6-Fc 0.29 100
人Tie2(1-452)r7-Fc 0.30 106
人Tie2(1-452)g1-Fc 0.00 0
人Tie2(1-452)g2-Fc 0.03 9
人Tie2(1-452)g3-Fc 0.06 23
人Tie2(1-452)g4-Fc 0.02 7
人Tie2(1-452)g5-Fc 0.03 9
人Tie2(1-452)g6-Fc 0.38 131
人Tie2(1-452)m1-Fc 0.31 107
人Tie2(1-452)m3-Fc 0.04 12
人Tie2(1-452)y1-Fc 0.25 87
人Tie2(1-452)c1-Fc 0.54 189
人Tie2(1-452)A1-Fc 0.10 34
人Tie2(1-452)A2-Fc 0.08 29
人Tie2(1-452)A3-Fc 0.17 59
人Tie2(1-452)A4-Fc 0.13 44
人Tie2(1-452)A5-Fc 0.39 135
人Tie2(1-452)A6-Fc 0.31 109

[0377] 通过实施例12中的方法进行ELSA，以便评估TIE-1-Igγ1-LALA与人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白的结合活性。

[0378] 将人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白用PBS稀释到1μg/mL，以每孔20μL的量添加到白色Maxisorp 384孔板，并在4℃温浴过夜以进行固定。第二天，除去固定化溶液，将板用TBS-T溶液清洗，并添加50μL BlockerTM酪蛋白(Thermo Fisher Scientific公司,37532)在TBS中的溶液，温浴60分钟以进行阻断。将得到的板用TBS-T溶液清洗，并以每孔20μL的量向其添加用含有0.05％Tween 20(Nacalai Tesque公司,28353-85)的BlockerTM酪蛋白在TBS中的溶液通过8步稀释的从0.03ng/mL至100ng/mL的TIE-1-Igγ1-LALA。将得到的板在室温温浴90分钟，然后用TBS-T溶液清洗三次，并向其添加20μL已用含有0.05％Tween 20的BlockerTM酪蛋白在TBS中的溶液稀释到0.1μg/mL的生物素标记的抗人κ轻链抗体。将得到的板在室温温浴60分钟，然后用TBS-T溶液清洗三次，并向其添加20μL已用含有0.05％Tween 20的BlockerTM酪蛋白在TBS中的溶液稀释到0.1μg/mL的碱性磷酸酶标记的链亲和素。将得到的板在室温温浴60分钟，然后用TBS-T溶液清洗三次，并向其添加50μL已用含有1mM MgCl2的20mM TBS(pH 9.8)稀释5倍的化学发光超灵敏AP微孔和/或膜底物TM
(450nm)作为底物。将得到的板在遮光下在室温温浴40分钟，然后使用EnVision 多标记物计数器测量其发光强度。计算TIE-1-Igγ1-LALA针对人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白的EC50值。计算在取TIE-1-Igγ1-LALA结合到人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白的S形曲线的收敛值为100％时，作为最大浓度点的100ng/mL TIE-1-Igγ1-LALA针对人Tie2(1-
452)-Fc嵌合蛋白及其23种突变蛋白的发光强度的相对值(表8和表9)。此外，通过Sigmoid-Emax模型非线性回归分析，计算EC50值和收敛值。ELISA的结果示出在图7中。

[0379] 作为结果，已发现与人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白相比，TIE-1-Igγ1-LALA针对突变蛋白Tie2(1-452)g1-Fc、Tie2(1-452)g2-Fc和Tie2(1-452)g4-Fc具有显著降低的相对值。此外，已发现与人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白相比，TIE-1-Igγ1-LALA针对突变蛋白Tie2(1-452)g5-Fc具有降低的相对值和增加的EC50值。从这些结果发现，与人Tie2(1-452)-Fc嵌合蛋白不同，TIE-1-Igγ1-LALA对Tie2(1-452)g1-Fc、Tie2(1-452)g2-Fc、Tie2(1-452)g4-Fc和Tie2(1-452)g5-Fc具有降低的结合活性。由于TIE-1-Igγ1-LALA针对Tie2(1-452)A1-Fc具有降低的相对值和相似的EC50值，因此确定TIE-1-Igγ1-LALA与Tie2(1-452)A1-Fc的结合活性没有变化。

[0380] 表8：ELISA的结果

[0381] [表8]

[0382]

[0383] 表9：ELISA的结果

[0384] [表9]

[0385]

[0386] 从两个独立实验ELISA和SPR分析的结果，鉴定到Tie2(1-452)g1-Fc、Tie2(1-452)g2-Fc、Tie2(1-452)g4-Fc和Tie2(1-452)g5-Fc是在两个实验中与TIE-1-Igγ1-LALA或完全的人2-16A2-Fab的结合活性降低的突变蛋白。发现在4种突变蛋白中第192、194、195、197和198位氨基酸是TIE-1-Igγ1-LALA结合人Tie2的非常重要的表位候选者。在这里，具有氨基酸变异I194A、N197A和L198A的Tie2(1-452)g1-Fc的结合活性在ELISA测定法中降低，而相对于TIE-1-Igγ1-LALA具有氨基酸变异I194A的Tie2(1-452)g3-Fc的结合活性在ELISA测定法中不变。具有氨基酸变异L198A的Tie2(1-452)g6-Fc的结合活性不论是在ELISA测定法中还是在SPR分析中都不改变。这些结果表明，Tie2(1-452)g1-Fc中第197位氨基酸的突变是作为表位的最关键的氨基酸。最后，发现TIE-1-Igγ1-LALA结合到登录号NP_000450.2的作为表位的第192、195和197位氨基酸。

[0387] 工业实用性

[0388] 本发明的抗人Tie2抗体可用于预防或治疗各种不同的与血管相关的疾病。此外，本发明的多核苷酸、表达载体、转化的宿主细胞和生产抗体的方法可用于生产抗人Tie2抗体。

[0389] 序列表自由文本

[0390] 在下面的编号标题<223>的序列表中，对“人工序列”进行了描述。具体来说，序列表中由SEQ ID NO：1所示的碱基序列是TIE-1-Igγ1-LALA的重链的碱基序列，由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1编码的重链的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：3所示的碱基序列是TIE-1-Igγ1-LALA、TIE-1-Igγ1-I253A、TIE-1-Igγ1-WT、TIE-1-Igγ4-PE和完全的人2-16A2的轻链的碱基序列，由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：3编码的轻链的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：5所示的碱基序列是TIE-1-Igγ1-I253A的重链的碱基序列，由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：5编码的重链的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：7所示的碱基序列是TIE-1-Igγ1-WT的重链的碱基序列，由SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：7编码的重链的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：9所示的碱基序列是TIE-1-Igγ4-PE的重链的碱基序列，由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：9编码的重链的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：11所示的碱基序列是完全的人2-16A2的重链的碱基序列，由SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列是由SEQ ID NO：11编码的重链的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：13至20所示的氨基酸序列是连接物的氨基酸序列。序列表中由SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列是凝血酶识别位点。