多西他赛包合物、多西他赛包合物的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种多西他赛包合物，所述多西他赛包合物由摩尔比为10:0.8～1.2的叶酸‑环糊精偶联物和叶酸‑多西他赛偶联物制得；所述叶酸‑环糊精偶联物由摩尔比为1:1～3的叶酸和环糊精制得；所述叶酸‑多西他赛偶联物由摩尔比为2:0.8～1.5的叶酸和多西他赛制得。本发明还提供了所述多西他赛包合物的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供的多西他赛包合物具有叶酸能与细胞膜表面的叶酸受体结合，达到靶向治疗的目的，同时未使用Tween80等有毒溶剂，无毒副作用。

权利要求

1.一种多西他赛包合物，其特征在于，所述多西他赛包合物由摩尔比为10:0.8～1.2的叶酸-环糊精偶联物和叶酸-多西他赛偶联物制得；所述叶酸-环糊精偶联物由摩尔比为1:1～3的叶酸和环糊精CDEn制得；所述叶酸-多西他赛偶联物由摩尔比为2:0.8～1.5的叶酸和多西他赛制得，所述叶酸-环糊精偶联物分子结构式如下：

2.根据权利要求1所述的多西他赛包合物，其特征在于，所述叶酸-多西他赛偶联物由所述叶酸和所述多西他赛通过腙键结合形成。

3.根据权利要求2所述的多西他赛包合物，其特征在于，所述叶酸-多西他赛偶联物分子结构式如下：

4.一种基于权利要求1～3任一所述的多西他赛包合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取叶酸、琥珀酰亚胺、DCC避光条件下反应，制得FA-NHS，即叶酸琥珀酰亚胺酯；

步骤二、取步骤一制备的FA-NHS和环糊精CDEn在避光条件下反应，将得到的反应液倒入冰冻的丙酮和乙醚的混合液中，抽滤、干燥得到FA-CD，即叶酸-环糊精偶联物；

步骤三、取多西他赛用乙醇溶解，加入水合肼反应，减压蒸馏后得到粘稠液体，加入乙醚洗涤析出固体，减压干燥得到白色固体为DTX-Hz；

步骤四、将步骤三制备的DTX-Hz加入步骤一中制备的FA-NHS溶液中避光条件下反应，抽滤除去白色固体得到水溶液，将水溶液滴加至乙醚中，析出黄色固体，黄色固体为FA-DTX，即叶酸-多西他赛偶联物；

步骤五、将步骤四制备的FA-DTX溶于乙醇中得到FA-DTX乙醇溶液，将步骤二制备的FA-CD溶于水中得到FA-CD水溶液，将FA-DTX乙醇溶液逐滴加到FA-CD水溶液中，磁力搅拌12-36小时，旋转蒸发除去乙醇，用膜过滤法除去不溶性颗粒得到滤液，将滤液冷冻干燥，制得FA-CD/FA-DTX，即多西他赛包合物。

5.根据权利要求4的多西他赛包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤二具体为：

取溶于吡啶的环糊精CDEn，加入步骤一制备的FA-NHS中，充入惰性气体保护，在温度50～60℃条件下避光反应3～5h；将反应液冷倒入冰冻的丙酮、乙醚混合液中，抽滤得到橙黄色固体，将橙黄色固体用水溶解，倒入甲醇中重结晶，减压干燥，制得FA-CD，即叶酸-环糊精偶联物。

6.根据权利要求5的多西他赛包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四具体为：步骤三、取溶解于乙醇的多西他赛，加入85％水合肼反应3～5小时，在不大于40℃的温度下减压蒸馏得到粘稠液体，加入乙醚洗涤析出固体，减压抽滤、干燥得到白色固体为DTX-Hz；

步骤四、取步骤三制备的DTX-Hz加入步骤一制备的FA-NHS溶液中，充入惰性气体保护，室温避光搅拌反应48～56小时，抽滤除去白色固体得滤液，将滤液滴加至乙醚中，析出粘稠固体，再滴加乙酸乙酯洗涤，减压抽滤、干燥得黄色固体，黄色固体为FA-DTX，即叶酸-多西他赛偶联物。

7.根据权利要求6的多西他赛包合物的制备方法，其特征在于，所述步骤五中旋转蒸发乙醇的温度为35～45℃，膜过滤法采用滤膜的孔径为0.3～0.5μm。

8.一种基于权利要求1～3任一所述的多西他赛包合物或采用权利要求4-7任一项所述的多西他赛包合物的制备方法制得的多西他赛包合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

多西他赛包合物、多西他赛包合物的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药化工领域，特别地，涉及一种多西他赛包合物、多西他赛包合物的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 环糊精(Cyclodextrins,简称为CD)是超分子化学第二代主体化合物，是一组环状低聚蔔萄糖的简称。环糊精分子的疏水空腔和亲水表面以及具有手性的微环境使其能够选择性地结合各种有机、无机和生物小分子而形成主-客体包结配合物，因此，环糊精在医药行业被广泛地应用于改善药物稳定性和溶解度、降低毒性、掩盖异味以及提高生物利用度和液体药物粉末化等作用。且环糊精包合是一项操作简单、行之有效的增加难溶性药物溶解度的技术。

[0003] 叶酸(Folic acid，FA)受体分布于细胞膜表面，为一种被磷脂酞肌醇锚在细胞膜上的叶酸结合蛋白，可通过特异性磷脂酶C或D将其切除，在卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和肾细胞癌等多种肿瘤细胞膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞。可利用叶酸介导药物靶向肿瘤细胞，增加药物在病灶局部的浓度、提高疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗目的。

[0004] 多西他赛为一种紫杉醇衍生物，能抑制细胞分裂，多用于治疗晚期乳腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤疾病。多西他赛的溶解性差，几乎不溶于水，现有技术采用Tween80增溶、乙醇助溶以制得药物制剂。由于Tween80的存在使得该制剂在临床使用过程中会导致如过敏反应、神经毒性等严重不良反应。

[0005] 多西他赛该类药物为细胞毒性抗肿瘤药物，进入体内后分布无选择性到达全身各组织器官从而带来全身毒副作用，易造成神经系统、免疫系统毒性，特别是易造成中性粒细胞减少症等免疫系统毒性，极大伤害患者的身心健康，使其临床应用受到限制。

[0006] 因此，有必要对现有多西他赛药物制剂进行进一步开发，提高多西他赛抗肿瘤药物的水溶性，避免使用表面活性剂和有毒溶剂；同时选择合适的肿瘤靶向因子降低药物毒副反应。

发明内容

[0007] 为解决上述现有多西他赛药物制剂毒副作用大的技术问题，本发明提供一种毒副作用小、能靶向治疗的多西他赛包合物、多西他赛包合物的制备方法及应用。

[0008] 本发明提供了一种多西他赛包合物，所述多西他赛包合物由摩尔比为10:0.8～1.2的叶酸-环糊精偶联物和叶酸-多西他赛偶联物制得；所述叶酸-环糊精偶联物由摩尔比为1:1～3的叶酸和环糊精CDEn制得；所述叶酸-多西他赛偶联物由摩尔比为2:0.8～1.5的叶酸和多西他赛制得，所述叶酸-环糊精偶联物分子结构式如下：

[0009]

[0010] 在本发明提供的多西他赛包合物的一种较佳实施例中，所述叶酸-多西他赛偶联物由所述叶酸和所述多西他赛通过腙键结合形成。

[0011] 在本发明提供的多西他赛包合物的一种较佳实施例中，所述叶酸-多西他赛偶联物分子结构式如下：

[0012]

[0013] 本发明提供一种基于上述多西他赛包合物的制备方法，包括以下步骤：

[0014] 步骤一、取叶酸、琥珀酰亚胺、DCC避光条件下反应，制得FA-NHS，即叶酸琥珀酰亚胺酯；

[0015] 步骤二、取步骤一制备的所述FA-NHS和环糊精CDEn在避光条件下反应，将得到的反应液倒入冰冻的丙酮和乙醚的混合液中，抽滤、干燥得到FA-CD，即叶酸-环糊精偶联物；

[0016] 步骤三、取多西他赛用乙醇溶解，加入水合肼反应，减压蒸馏后得到粘稠液体，加入乙醚洗涤析出固体，减压干燥得到白色固体为DTX-Hz；

[0017] 步骤四、将步骤三制备的DTX-Hz加入步骤一中制备的FA-NHS溶液中避光条件下反应，抽滤除去白色固体得到水溶液，将水溶液滴加至乙醚中，析出黄色固体，黄色固体为FA-DTX，即叶酸-多西他赛偶联物；

[0018] 步骤五、将步骤四制备的FA-DTX溶于乙醇中得到FA-DTX乙醇溶液，将步骤二制备的FA-CD溶于水中得到FA-CD水溶液，将FA-DTX乙醇溶液逐滴加到FA-CD水溶液中，磁力搅拌12-36小时，旋转蒸发除去乙醇，用膜过滤法除去不溶性颗粒得到滤液，将滤液冷冻干燥，制得FA-CD/FA-DTX，即多西他赛包合物。

[0019] 在本发明提供的多西他赛包合物的制备方法一种较佳实施例中，所述步骤二具体为：

[0020] 取溶于吡啶的环糊精CDEn，加入步骤一制备的FA-NHS中，充入惰性气体保护，在温度50～60℃条件下避光反应3～5h，制得反应液；将反应液冷却倒入冰冻的丙酮、乙醚混合液中，抽滤得到橙黄色固体，将橙黄色固体用水溶解，倒入甲醇中重结晶，减压干燥，制得FA-CD，即叶酸-环糊精偶联物。

[0021] 在本发明提供的多西他赛包合物的制备方法一种较佳实施例中，所述步骤三和步骤四具体为：

[0022] 步骤三、取溶解于乙醇的多西他赛，加入85％水合肼反应3～5小时，在不大于40℃的温度下减压蒸馏得到粘稠液体，加入乙醚洗涤析出固体，减压抽滤、干燥得到白色固体为DTX-Hz；

[0023] 步骤四、取步骤三制备的DTX-Hz加入步骤一制备的FA-NHS溶液中，充入惰性气体保护，室温避光搅拌反应48～56小时，抽滤除去白色固体得滤液，将滤液滴加至乙醚中，析出粘稠固体，再滴加乙酸乙酯洗涤，减压抽滤、干燥制得黄色固体，黄色固体为FA-DTX，即叶酸-多西他赛偶联物。

[0024] 在本发明提供的多西他赛包合物的制备方法一种较佳实施例中，所述步骤五中旋转蒸发乙醇的温度为40℃，膜过滤法采用滤膜的孔径为0.3～0.5μm。

[0025] 本发明提供一种基于上述任一所述的多西他赛包合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0026] 相较于现有技术，本发明提供的多西他赛包合物、多西他赛包合物的制备方法及应用，具有以下有益效果：

[0027] 一、通过所述叶酸-环糊精偶联物和所述叶酸-多西他赛偶联物制备所述多西他赛包合物，使得其具有双靶头，细胞膜表面的叶酸受体可与所述叶酸结合，介导多西他赛进入细胞内，从而达到靶向治疗癌细胞的目的；

[0028] 二、在所述多西他赛包合物中加入环糊精，增加所述多西他赛包合物的稳定性和溶解度；

[0029] 三、所述多西他赛包合物不含表面活性剂和有毒溶剂，无毒副作用；

[0030] 四、所述多西他赛包合物采用水溶法制备，操作简单易得。

附图说明

[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

[0032] 图1是本发明提供的多西他赛包合物一较佳实施例的制备方法步骤流程图；

[0033] 图2是本发明提供的叶酸-环糊精偶联物一较佳实施例的制备方法步骤流程图；

[0034] 图3是本发明提供的叶酸-环糊精一较佳实施例的合成反应路线图；

[0035] 图4是本发明提供的FA-CD采用傅立叶红外光谱法得到的红外图谱；

[0036] 图5是本发明提供的FA-CD采用核磁共振法得到的核磁共振图谱；

[0037] 图6是本发明提供的FA-CD采用差示热分析法得到的差示热图谱；

[0038] 图7为本发明提供的FA-DTX一较佳实施例的合成反应路线图；

[0039] 图8是本发明提供的FA-DTX采用傅立叶红外光谱法得到的红外图谱；

[0040] 图9是本发明提供的FA-DTX采用核磁共振法得到的核磁共振图谱；

[0041] 图10是本发明提供的FA-DTX的质谱图；

[0042] 图11是本发明提供的FA-CD/FA-DTX采用傅立叶红外光谱法得到的红外图谱；

[0043] 图12是本发明提供的FA-CD/FA-DTX采用差示热分析法得到的差示热图谱。

具体实施方式

[0044] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0045] 除非特别说明，本发明中所采用的原材料、试剂、设备均可通过市场购买或可通过现有方法制备得到。

[0046] 除非特别说明，本发明所采用的环糊精，可为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精等任意一种或多种环糊精。

[0047] 请一并参阅图1、图2和图3，其中，图1是本发明提供的多西他赛包合物一较佳实施例的制备方法步骤流程图；图2是本发明提供的叶酸-环糊精偶联物一较佳实施例的制备方法步骤流程图；图3是本发明提供的FA-CD一较佳实施例的合成反应路线图。

[0048] 步骤S1、取叶酸、琥珀酰亚胺、DCC避光条件下反应，制得FA-NHS，即叶酸琥珀酰亚胺酯；

[0049] 具体的，将叶酸1.0g(2.23mM)投入50mL圆底烧瓶中，加入40mL二甲基亚砜(DMSO)，超声至完全溶解。然后再加入琥珀酰亚胺(NHS)0.28g(2.48mM)和二环己基碳二亚胺(DCC)0.56g(2.48mM)，充入N2保护，避光，在室温下搅拌反应过夜，其中DCC为脱水剂。抽滤除去不溶物，得到橙红色溶液为FA-NHS，即叶酸琥珀酰亚胺酯。

[0050] 步骤S2、取步骤S1制备的FA-NHS和环糊精在避光条件下反应，将得到的反应液倒入冰冻的丙酮和乙醚的混合液中，抽滤、干燥得到FA-CD，即叶酸-环糊精偶联物；

[0051] 步骤S21、取溶于吡啶的环糊精，加入步骤S1制备的FA-NHS中，充入惰性气体保护，在温度50～60℃条件下避光反应3～5h，制得反应液；

[0052] 具体的，将环糊精(CDEn)4.0g(3.0mM)溶于吡啶20mL，加入橙红色溶液FA-NHS中，继续在N2保护下，55℃，避光反应4h。反应结束后，制得反应液；

[0053] 步骤S22、将步骤S21中制备的反应液冷却，倒入冰冻的丙酮、乙醚混合液中，抽滤得到橙黄色固体；将橙黄色固体用水溶解，倒入甲醇中重结晶，减压干燥，制得FA-CD，即所述叶酸-环糊精偶联物。

[0054] 具体的，将步骤S21中制备的反应液冷却，倒入体积比为1：1的冰冻的丙酮、乙醚混合液中，立即抽滤，得到橙黄色固体，将橙黄色固体用水溶解，倒入甲醇中重结晶。减压干燥，制得黄色结晶FA-CD4.1g，产率为82％。

[0055] 优选的，使用等量的NHS，使叶酸结构中的其中一个羧基被活化，以避免产生一分子叶酸结合两分子FA-CD的产物；增加CDEn的投料量，以保证活化的叶酸能够充分反应，否则游离的叶酸将增加后处理的难度，而未除去的叶酸可影响环糊精的包合行为；水分可干扰反应，反应体系避免含水和见光，以避免叶酸见光分解。

[0056] 采用傅立叶红外光谱法对步骤S2制备的FA-CD进行检测。取叶酸，CDEn，叶酸和CDEn混合物以及步骤S2制备的FA-CD适量，分别与KBr混匀，压片，进行红外光谱扫描，扫描范围为400-4000cm-1。

[0057] 请参阅图4，是本发明提供的FA-CD采用傅立叶红外光谱法得到的红外图谱。其中，曲线1的材料为叶酸；曲线2的材料为环糊精；曲线3的材料为叶酸、环糊精混合物；曲线4的材料为FA-CD。曲线4与曲线2相比较，产生了四个新峰位：1643cm-1；1607cm-1；1511cm-1；1405cm-1，与叶酸环糊精偶联物的特征峰一致，证明FA-CD为叶酸-环糊精偶联物。曲线4与曲线3相比较，混合物在2000-1200区段有1696cm-1；1640cm-1；1410cm-1三个峰比较突出，经对照，这三个峰均是叶酸的特征峰，与曲线4在同一区段的图谱有明显区别。

[0058] 采用1H核磁共振法对步骤S2制备的FA-CD进行检测。使用核磁共振仪,以四甲基硅烷(TMS)为内参，重水(D2O)为溶剂。

[0059] 请参阅图5，是本发明提供的FA-CD采用核磁共振法得到的核磁共振图谱。曲线1材料为FA-CD；曲线2材料为环糊精。参阅曲线1得出：ppm 8.53(s,H23),7.56(d,H17,H19),6.59(d,H16,H18),4.97(d,H1),4.23(t,H12),3.48-3.76(m,H2,H3,H4,H5,H6),2.64(t,H8),2.37-2.45(q,H11),2.16(q,H10),2.03(t,H7),与叶酸-环糊精偶联物一致，证明FA-CD为叶酸-环糊精偶联物。与曲线2相比较，曲线1具有明显的芳香环上的H，说明结构中含有叶酸的结构。

[0060] 采用差示扫描热量法对步骤S2制备的FA-CD进行检测。采用热分析仪对FA-CD进行差热分析，分析条件为:温度范围为25-300℃，升温速率为15℃/min，N2流速为100mL/min，样品质量约10mg。

[0061] 请参阅图6，是本发明提供的FA-CD采用差示热分析法得到的差示热图谱。其中，曲线1原料为叶酸；曲线2原料为环糊精；曲线3原料为FA-CD。曲线1在144.1℃有一较大吸热峰，201.2℃有一弱吸热峰；曲线2在102.6℃附近有一较大的吸热峰；曲线3的这两个位置均无吸热峰，证明FA-CD与叶酸、环糊精不是相同物质。

[0062] 综上所述，由以上验证试验得出通过步骤S2制备的FA-CD为所述叶酸-环糊精偶联物。

[0063] 请结合参阅图7，为叶酸-多西他赛合成路线图。首先将叶酸结构中的羧基活化，琥珀酰亚胺(NHS)与叶酸(FA)在二甲基亚砜(DMSO)中反应，生成叶酸琥珀酰亚胺酯(FA-NHS)溶液，备用。然后在多西他赛结构中引入腙键，多西他赛(DTX)与85％水合肼(NH2-NH2)在乙醇中反应，DTX结构中的羰基与肼发生缩合，生成DTX-Hz，在乙醚中析出，为白色固体。最后将DTX-Hz与FA-NHS反应，生成产物FA-DTX，在乙醚中析出，为黄色固体，减压干燥，产率约65％。

[0064] 步骤S3、取多西他赛用乙醇溶解，加入水合肼反应，减压蒸馏后得到粘稠液体，加入乙醚洗涤析出固体，减压干燥得到白色固体为DTX-Hz；

[0065] 具体的、取溶解于乙醇的多西他赛，加入85％水合肼反应3～5小时，在不大于40℃的温度下减压蒸馏得到粘稠液体，加入乙醚洗涤析出固体，减压抽滤、干燥得到白色固体为DTX-Hz；

[0066] 优选的，将DTX 1.0g(1.24mmol)投入100mL圆底烧瓶中，加乙醇20mL，搅拌溶解，滴加85％水合肼3mL，采用TLC跟踪反应，约4小时后结束反应，在环境温度小于40℃的条件下，将反应液减压蒸馏，除去乙醇，得粘稠液体。加乙醚，充分振摇后，弃去乙醚，反复多次，析出固体，此时减压抽滤，并用乙醚洗三次，得到白色固体，即DTX-Hz，减压干燥。其中，TLC跟踪反应中展开剂为氯仿和甲醇，氯仿和甲醇以体积比9:1比例配置。

[0067] 步骤S4、将步骤S3制备的DTX-Hz加入步骤S1中制备的FA-NHS溶液中避光条件下反应，抽滤除去白色固体得到水溶液，将水溶液滴加至乙醚中，析出黄色固体，黄色固体为FA-DTX，即叶酸-多西他赛偶联物；

[0068] 具体的、取步骤S3制备的DTX-Hz加入步骤S1制备的FA-NHS溶液中，充入惰性气体保护，室温避光搅拌反应48～56小时，抽滤除去白色固体得滤液，将滤液滴加至乙醚中，析出粘稠固体，再滴加乙酸乙酯洗涤，减压抽滤、干燥得黄色固体，黄色固体为FA-DTX，即叶酸-多西他赛偶联物。

[0069] 优选的，取步骤S3制得的DTX-Hz 0.63g(0.77mmol)，投入步骤S1制得的FA-NHS溶液8.7mL(0.51mmol)中，充入N2保护，避光，在室温下搅拌反应，48小时后，抽滤除去白色固体，滤液滴加至160mL乙醚中，析出粘稠固体，弃去乙醚液，滴加乙酸乙酯，粘稠状固体成颗粒状，抽滤，用乙酸乙酯洗涤，得黄色固体为FA-DTX，即所述叶酸-多西他赛偶联物，减压干燥。

[0070] 采用傅立叶红外光谱法对步骤S4制备的FA-DTX进行检测。取叶酸，多西他赛，步骤S4制备的FA-DTX，叶酸、多西他赛混合物适量，分别与KBr混匀，压片，进行红外光谱扫描，扫描范围为400-4000cm-1。

[0071] 请参阅图8，是本发明提供的FA-DTX采用傅立叶红外光谱法得到的红外图谱。其中，曲线1材料为叶酸；曲线2材料为多西他赛；曲线3材料为FA-DTX；曲线4材料为叶酸和多西他赛的混合物。由曲线1看出叶酸的特征峰有：FTIR(cm-1)1694,1607,1485,1412,1339,1194；由曲线2看出多西他赛的特征峰有：FTIR(cm-1)1737,1712,1513,1453,1367,1268,
1172,1110,978,709；由曲线3看出FA-DTX的特征峰有：FTIR(cm-1)1683,1640,1609,1513,
1413,1303,1175,1016；由曲线4看出叶酸和多西他赛混合物的特征峰有：FTIR(cm-1)1698,
1606,1486,1454,1367,1270,1177,1135,978,708。曲线4、曲线1和曲线2比较，其特征峰基-1
本一致，没有新的吸收峰产生。而曲线3产生了三个新峰位：FTIR(cm )1683,1640,1303,其中最强特征峰是1640，属于腙键中C＝N双键的特征吸收峰，另外，曲线3与曲线4有明显区别，判断叶酸与多西他赛已通过腙键结合形成FA-DTX。

[0072] 采用1H核磁共振法检测步骤S4制备的FA-DTX。1HNM光谱在500MHz核磁共振仪上进行,以四甲基硅烷(TMS)为内参，使用重水(D2O)为溶剂。

[0073] 请参阅图9，是本发明提供的FA-DTX采用核磁共振法得到的核磁共振图谱。其中，曲线1材料为叶酸；曲线2材料为多西他赛；曲线3材料为FA-DTX。

[0074] 由曲线1得出:H1NMR(400MHz,D2O):ppm 8.65(s),8.12(d),7.66(d),7.64(d),6.94(d),6.65(d),4.49(s),4.32(m),3.33(s),2.50(d),2.32(t),2.05(m),1.91(m)；

[0075] 由曲线2得出:H1NMR(400MHz,D2O):ppm 7.96(d),7.70(m),7.64(m),7.36(d),7.30(d),7.20(m),5.89(m),5.41(d),5.10(s),4.89(m),4.51(s),4.32(t),4.02(m),3.67(d),3.32(s),2.21(s),1.88(m),1.74(s),1.65(t),1.52(s),1.35(s),1.01(d)；

[0076] 由曲线3得出:H1NMR(400MHz,D2O):ppm 8.63(s),8.12(d),7.99(d),7.91(d),7.70(m),7.64(m),7.30(d),7.22(m),6.94(d),6.61(d),5.97(m),5.85(d),5.41(d),5.22(d),5.13(s),4.88(m),4.49(s),4.31(t),4.15(m),4.03(m),3.91(d),3.82(d),3.34(s),
3.00(s),2.98(s),2.19(s),1.92(m),1.32(s),1.26(d),1.23(d),1.14(s),0.94(s)；

[0077] 比较曲线1、曲线2和曲线3的核磁共振图谱，曲线3兼有曲线1和曲线2的特征峰：8.63(s),8.12(d),7.64(m),6.94(d),6.61(d),4.49(s),4.31(t),对应于叶酸的特征峰；
7.99(d),7.64(m),7.30(d),7.22(m),5.41(d),5.13(s),4.88(m),4.49(s),4.31(t),4.03(m)，对应于多西他赛的特征峰，因此判断FA-DTX结构中存在叶酸和多西他赛结构。

[0078] 请参阅图10，是本发明提供的FA-DTX的质谱图。质谱中FA-DTX的分子离子峰结果为623，这是FA-DTX在测试中带了双电荷，其质荷比是(M+1)/2，而FA-DTX的分子量为1245，符合图谱中分子离子峰结果，质谱进一步佐证了FA-DTX结构。

[0079] 综上所述，步骤S4中制备的FA-DTX为叶酸-多西他赛偶联物。

[0080] 步骤S5、将步骤S4制备的FA-DTX溶于乙醇中得到FA-DTX乙醇溶液，将步骤S2制备的FA-CD溶于水中得到FA-CD水溶液，将FA-DTX乙醇溶液逐滴加到FA-CD水溶液中，磁力搅拌12-36小时，旋转蒸发除去乙醇，用膜过滤法除去不溶性颗粒得到滤液，将滤液冷冻干燥，制得FA-CD/FA-DTX，即多西他赛包合物。

[0081] 具体的，使用水溶液法制备包合物。按照FA-CD：FA-DTX的摩尔比为10:1，即称取步骤S4制备的FA-DTX溶于乙醇中制得FA-DTX乙醇溶液，称取步骤S2制备的FA-CD溶于水中并搅拌制得FA-CD水溶液，将FA-DTX乙醇溶液逐滴加到FA-CD水溶液中，搅拌24h。40℃旋转蒸发乙醇，过0.3～0.5μm水系滤膜除去不溶性颗粒，滤液冷冻干燥既得FA-CD/FA-DTX。

[0082] 优选的，膜过滤法中采用的0.45μm过滤膜。

[0083] 采用傅里叶红外光谱法对步骤S5制备的FA-CD/FA-DTX检测。取FA-CD，FA-DTX，和FA-CD/FA-DTX包合物适量，分别与KBr混合，压片，进行红外光谱扫描，扫描范围400-4000cm-1。

[0084] 请参阅图11，是本发明提供的FA-CD/FA-DTX采用傅立叶红外光谱法得到的红外图谱。其中，曲线1材料为FA-CD；曲线2材料为FA-DTX；曲线3材料为FA-CD/FA-DTX。由曲线1看出FA-CD含1650，1407，1156和1030cm-1的特征吸收峰，由曲线2看出FA-DTX含1697，1606，-11513和1173cm 的特征吸收峰，由曲线3看出FA-CD/FA-DTX包合物中，FA-DTX的几个特征吸收峰消失，同时有些峰的峰形发生了变化。这些变化说明，由于形成了包合物，客体分子FA-DTX的振动受到了限制并且有部分的基团插入到FA-CD的空腔中。

[0085] 采用差示扫描热量法检测步骤S5制备的FA-CD/FA-DTX。对FA-CD，FA-DTX和FA-CD/FA-DTX包合物适量进行差热分析。分析条件为25-300℃，升温速率15℃/min，N2流100mL/min。

[0086] 请参阅图12，为本发明提供的FA-CD/FA-DTX差示扫描热量法的曲线图，其中，曲线1材料为FA-DTX；曲线2材料为FA-CD；曲线3材料为FA-CD和FA-DTX混合物；曲线4材料为FA-CD/FA-DTX。曲线1含有特征吸热峰74℃和171℃，放热峰229℃。曲线2含较宽的吸热峰94℃。
在曲线3中吸热峰为84℃，放热峰为231℃，表明并未有新相的生成，而在曲线4中，FA-DTX的放热峰229℃消失，说明包合物的形成。

[0087] 由图12可看出FA-DTX具有晶体结构，出现系列强烈尖锐的衍射峰，而FA-CD是非晶体结构，不出现衍射峰。其物理混合物出现类似FA-DTX的强度较弱的衍射峰，而FA-CD/FA-DTX包合物未出现衍射峰，表明形成了非晶体结构的固相包合物，即FA-CD/FA-DTX为所述多西他赛包合物。

[0088] 本发明提供的所述多西他赛包合物、多西他赛的制备方法及应用其具有以下有益效果：

[0089] 一、通过所述叶酸-环糊精偶联物和所述叶酸-多西他赛偶联物制备所述多西他赛包合物，使得其具有双靶头，细胞膜表面的叶酸受体可与所述叶酸结合，介导多西他赛进入细胞内，从而达到靶向治疗癌细胞的目的；

[0090] 二、在所述多西他赛包合物中加入环糊精，增加所述多西他赛包合物的稳定性和溶解度；

[0091] 三、在所述多西他赛包合物不含表面活性剂和有毒溶剂，无毒副作用；

[0092] 四、所述多西他赛包合物采用水溶法制备，操作简单易得。

[0093] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。