一种大孔吸附树脂分离纯化党参中苍术内酯I和苍术内酯II的工艺

摘要

本发明涉及种大孔吸附树脂分离纯化党参中苍术内酯I和苍术内酯II的工艺,属于天然药物化学技术领域。包括如下步骤:第1步,将党参用乙醇溶液进行提取,得到醇提液,将醇提液减压浓缩至干,固体物为党参粗提物,加水溶解后制备得到提取物溶液;第2步,将提取物溶液采用DM130大孔吸附树脂进行吸附,再用乙醇溶液进行解吸,得到解吸液;第3步,将解吸液减压浓缩至干后,得到含苍术内酯I和苍术内酯II的提取物。利用DM130大孔树脂吸附分离纯化党参中的苍术内酯I和苍术内酯II具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脱率高等特点,且产品的解吸率稳定,是党参深度利用的有效技术。

权利要求

1.一种大孔吸附树脂分离纯化党参中苍术内酯I和苍术内酯II的工艺，其特征在于，包括如下步骤：第1步，将党参用乙醇溶液进行提取，得到醇提液，将醇提液减压浓缩至干，固体物为党参粗提物，加水溶解后制备得到提取物溶液；第2步，将提取物溶液采用DM130大孔吸附树脂进行吸附，再用乙醇溶液进行解吸，得到解吸液；第3步，将解吸液减压浓缩至干后，得到含苍术内酯I和苍术内酯II的提取物；

所述的第1步中，党参与乙醇溶液的重量比是1：3～6；提取是采用回流提取1～3h；所述的乙醇溶液的体积浓度是95%；

所述的第1步中，提取物溶液是党参粗提物与水按照重量/体积比0.05～0.5g/ml稀释后得到；

所述的第2步中，吸附过程温度范围是25～35℃，吸附过程的上样流速是6ml/min；

所述的第2步中，解吸过程采用的解吸液是体积浓度在30～95%的乙醇溶液，解吸过程洗脱液的洗脱流速是4ml/min。

说明书

一种大孔吸附树脂分离纯化党参中苍术内酯I和苍术内酯II

的工艺

技术领域

[0001] 本发明涉及一种大孔吸附树脂分离纯化党参中苍术内酯I和苍术内酯II的工艺，属于天然药物化学技术领域。

背景技术

[0002] 中药党参来源于桔梗科植物的3个品种，分别为党参Codonopsis pliosula（Franch）Nannf、素花党参Codoncpsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf）L.T.Shen或川党参Codonopisis tangshen Oliv.的干燥根[1]。党参具有补中益气，生津和胃，健脾益肺[2-4]等功效，为我国传统的补益药，可以作为人参的替代品 。党参药材中指标性成分苍术内酯的主要药理作用为中枢抑制、解痉、光敏活性、抗炎活性等。大孔树脂因为具有选择性好、吸附迅速、绿色环保等优势，在天然产物的提取纯化方面得到了广泛的应用[5]。经过文献调研，大孔树脂分离纯化党参中苍术内酯 和苍术内酯 的工艺研究未见报道。

[0003] 1.Chinese Pharmacopoeia Commission (国家药典委员会). Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中华人民共和国药典). Beijing: China Medical Science Press, 2005. Vol Ⅰ, 199.

[0004] 2.Wang ZT (王峥涛), Zhu EY (朱恩圆), He Q (贺庆), et al. Chemical Study on the Root of Codonopsis pilosula..Journal of China Pharmaceutical University (中国药科大学学报), 2001, 32:94-95.

[0005] 3.Li  LX (李黎星), Kang JF  (康杰芳). Advances in studies on Codonopsis. Progress in Modern Blomedlelne  (现代生物医学进展), 2009, 9: 2371-
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[0006] 4.Chen KK (陈克克). Research Survey on Codonopsis. Journal of Xi’an University of Arts &Scicncc(Nat Sci Ed)  (西安文理学院学报自然科学版), 2008, 11: 33-39.

[0007] 5.Chen X (程贤), Bi LW (毕良武), Zhao ZD  (赵振东),  ,etal. Static Adsorption and Desorption of Rosmarinic Acid on Macroporous resins. .Natural Product Research and Development (天然产物研究与开发), 2016,4: 601-606.发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题在于：党参中的苍术内酯I、苍术内酯II含量较低，富集、分离、纯化存在一定的困难，尤其是苍术内酯II，提取液中因含量太低无法测出。

[0009] 为解决上述问题，采用了如下技术手段：

[0010] 一种大孔吸附树脂分离纯化党参中苍术内酯I和苍术内酯II的工艺，包括如下步骤：

[0011] 第1步，将党参用乙醇溶液进行提取，得到醇提液，将醇提液减压浓缩至干，固体物为党参粗提物，加水溶解后制备得到提取物溶液；

[0012] 第2步，将提取物溶液采用DM130大孔吸附树脂进行吸附，再用乙醇溶液进行解吸，得到解吸液；

[0013] 第3步，将解吸液减压浓缩至干后，得到含苍术内酯I和苍术内酯II的提取物。

[0014] 所述的第1步中，党参与乙醇溶液的重量比是1：3～6，更优选是1：5；提取是采用回流提取1～3h，更优选是2h；所述的乙醇溶液的体积浓度是95%。

[0015] 所述的第1步中，提取物溶液是党参粗提物与水按照重量/体积比0.05～0.5g/ml稀释后得到，更优选的重量/体积比是0.125g/mL。

[0016] 所述的第2步中，吸附过程温度范围是25～35℃，更优选是30℃，吸附过程的上样流速是6ml/min。

[0017] 所述的第2步中，解吸过程采用的解吸液是体积浓度在30～95℃内的乙醇溶液，更优选是95%，解吸过程洗脱液的洗脱流速是4ml/min。

[0018] 所述的第1步中，在得到了提取物溶液后，将其送入C18硅胶柱色谱进行吸附，再用体积比为25∶75的甲醇-水体系洗脱5BV，弃洗脱液，再用体积比为45∶65的甲醇-水体系洗脱5BV，收集洗脱液，再将洗脱液减压蒸干之后，加水稀释作为纯化后的提取物溶液，送入第2步中处理。

[0019] 所述的提取物溶液与C18反相硅胶重量比是2：1。

[0020] 有益效果

[0021] 利用DM130大孔树脂吸附分离纯化党参中的苍术内酯I和苍术内酯II具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脱率高等特点，且产品的解吸率稳定, 是党参深度利用的有效技术。与原液相比较，苍术内酯I和苍术内酯II在干固体中的含量分别增加了32.3和25.6倍。

附图说明

[0022] 图1是对照品的色谱图（1：苍术内酯II；2：苍术内酯I）

[0023] 图2是苍术内酯I的静态吸附动力学曲线

[0024] 图3是苍术内酯I等温吸附曲线

[0025] 图4是苍术内酯I的泄漏曲线

[0026] 图5是苍术内酯I洗脱曲线

[0027] 图6是苍术内酯II洗脱曲线

[0028] 图7纯化前苍术内酯II的色谱图

[0029] 图8纯化后苍术内酯II的色谱图

[0030] 图9纯化前苍术内酯I的色谱图

[0031] 图10纯化后苍术内酯I的色谱图

具体实施方式

[0032] 仪器、样品与试药

[0033] 仪器

[0034] 超声波清洗器（KH-500DE，昆山禾创造声仪器有限公司）；高速粉碎机（YK-400B，山东省青州市益康中药机械有限公司）；恒温水浴锅（HH-601，金坛市恒丰仪器厂）；气流烘干器（豫康牌C型，上海豫康科教设备仪器有限公司）；电子天平（BS 110 S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1100 Series，美国安捷伦公司）；真空干燥箱（DZF-6020型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；远红外辐射干燥箱（766-3型，上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司）。

[0035] 样品

[0036] 党参来源于甘肃省天水市甘谷县，经甘肃中医药大学药学院生药学实验室林丽高级实验师鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pliosula（Franch）Nannf的干燥根。

[0037] 试剂

[0038] 乙腈（德国默克，色谱纯）；重蒸水；甲醇（色谱纯，工业纯）；乙醇（工业纯）；乙酸乙酯（分析纯，批号： 20120408，成都金山化学试剂有限公司）；正丁醇（分析纯，批号：20120211，天津市富宇精细化工有限公司）。

[0039] 对照品

[0040] 苍术内酯I和苍术内酯II(批号：MUST-11122210，MUST-11122211，成都曼思特股份有限公司)；大孔吸附树脂（D101、HPD-100、H103、 DM130和S-8，沧州市宝恩化工有限公司）。

[0041] 高效液相色谱分析

[0042] 对照品溶液的制备

[0043] 精密称取对照品苍术内酯I 1.07mg，苍术内酯II 1.12mg、置10mL容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品1。将对照品1分别吸取1mL，置l00mL的容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品2。

[0044] 含量测定方法

[0045] 色谱条件：色谱柱：Thermo ODS HYPERSIL柱；检测波长: 苍术内酯I为277nm、苍术内酯II为220 nm；柱温：25℃；流速：1mL/ min；流动相：乙腈(B)-水(A)；梯度洗脱：0   ~13min, 25%B；13 35min，60%B；35 40min, 100%B；40 55min，100%B；进样量：20µL。
~ ~ ~

[0046] 色谱条件的优化

[0047] 检测波长的选择：选择吸收波长为220、 267、238、250和277nm，测得苍术内酯I的最大吸收波长为277 nm，苍术内酯II的最大吸收波长为220nm，在267nm均处无吸收。在277和220nm 处，苍术内酯I、苍术内酯II分离良好，故选择277nm和220nm为检测波长。流动相选择：分别对甲醇-水、乙腈-水等流动相进行了考察，并考察了等度洗脱及不同比例梯度洗脱条件，最终以乙腈（B）-水（A）为流动进行梯度洗脱(0 13min，25% B；13  35min，60% B；35~ ~ ~40min，100% B；40 55min，100%B)，样品的分离较好，且重复性良好。在选定条件下，色谱峰~
能达到基线分离，苍术内酯I和苍术内酯II与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数大于3000。色谱图见图1。

[0048] 树脂的预处理

[0049] 称取不同型号的大孔吸附树脂，加入95%的乙醇50ml浸泡超过24h，湿法装柱后，先用95%的乙醇洗涤树脂至流出液加水（1:4）不呈白色浑浊为止，再用蒸馏水洗至水液澄清无醇味。

[0050] 实施例1 党参粗提物的制备

[0051] 将党参与95%乙醇按照重量比1：5混合，升温至回流提取2h，结束后过滤，滤液减压浓缩至干，固体物为党参粗提物，可加水制备得到不同浓度的提取物溶液。

[0052] 实施例2大孔吸附树脂类型的选择

[0053] 实施例1中的党参粗提物与水按照重量/体积比0.125g/mL制备得到提取物溶液。

[0054] 称取已处理好的D101、HPD-100、H103、DM130、S-8 5种大孔树脂1.00 g，置具塞锥形瓶中，各精密加入提取物溶液30mL，置于摇床上振摇 24 h，取出，抽滤，滤液经处理后进行含量测定。树脂再精密加入95%乙醇溶液50mL，于摇床上振摇24h取出，抽滤，滤液作为解吸液经处理后进行含量测定，根据公式计算苍术内酯I的吸附量、解吸量、解吸率和干固量。

[0055] 大孔树脂吸附量、吸附率、解吸附量、解吸附率的计算公式如下：

[0056] 吸附量＝（C0－Ce）×V                    （1）

[0057] 吸附率＝［（C0－Ce）/C0］×100％           （2）

[0058] 解吸量＝ V1×C1                        （3）

[0059] 解吸率＝［V1C1/（C0－Ce）V］×100％       （4）

[0060] 吸附量（mg/干树脂g）＝（C0－Ce）×V/M      （5）

[0061] 干固体含量（苍术内酯I或者苍术内酯II）=解吸量/解吸液干固体重量

[0062] C0为起始浓度； Ce 为平衡时浓度； C1为解析液浓度； V 为吸附液体积； V1为解吸液体积；M为干树脂重。

[0063] 5种不同型号树脂的各项指标如表1所示，树脂的吸附能力是由树脂孔径、比表面积、表面电性或形成氢键等综合性所决定。大孔树脂吸附有机物是有机物通过树脂的孔径扩散到树脂孔内被吸附, 因此孔径大小直接影响吸附效果，同时巨大的比表面积大大增加了树脂的吸性能。本项研究针对苍术内酯类化合物溶于乙醇，而不溶于水(能溶于热水)的特点，将95%乙醇回流提取液浓缩至无醇味，加热水使溶解, 抽滤，滤液上大孔树脂柱，这样大大增加了大孔树脂的吸附能力。通过吸附作用的比较，结果显示树脂HPD-100和DM 130的吸附量和解吸量较好，再根据干固量的计算表明树脂DM 130纯化出的党参中苍术内酯I的含量较高，所以选用大孔吸附树脂DM 130纯化党参的有效成分（表2）

[0064] 表1 不同型号树脂的物理结构参数

[0065]

[0066] 表2不同型号树脂吸附作用比较

[0067]

[0068] 静态吸附动力学曲线的绘制

[0069] 精密称取预处理好的大孔树脂（DM130）1.00 g，置具塞锥形瓶中，加入党参粗提物与水按照重量/体积比0.125g/mL制备得到提取物溶液30mL，置摇床上振摇，然后按间隔时间0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及24h，每次吸取1mL，按上述色谱条件进行测定，计算吸附量。

[0070] 由图2中的动力学曲线可发现大孔吸附树脂DM130对党参中苍术内酯I的静态吸附10h后即达平衡，故静态吸附的最佳时间为10h。

[0071] 静态吸附等温曲线的绘制

[0072] 分别吸取党参粗提物与水按照重量/体积比0.125g/mL制备得到提取物溶液10、20、25、28、30、35、40mL定容至25mL，加入已处理好的树脂（DM130）1.00g中，于恒温水浴振荡器中25℃、30℃、35℃振摇12h测其吸附量，绘制等温曲线。由图3可知静态吸附党参中苍术内酯I的最适温度为30℃。

[0073] 实施例3 动态吸附试验

[0074] 上样液浓度考察

[0075] 分别将党参粗提物与水按照重量/体积比0.25g/mL 、0.125g/mL、0.0625g/mL制备得到提取物溶液。

[0076] 量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.00g三份湿法装柱，将不同浓度、相同体积的提取物溶液400mL以相同流速（3mL/min）通过大孔吸附树脂色谱柱，计算吸附量，确定最佳动态吸附浓度。结果：药液浓度：0.25g/mL，吸附量：0.0145mg/g；药液浓度：0.125g/mL，吸附量：0.0215mg/g；药液浓度：0.0625g/mL，吸附量：0.0062mg/g。结果显示苍术内酯I的吸附量随着上样液浓度的增加而增大，但相差不大。故选择0.125g/mL为最佳上样浓度。

[0077] 上样液流速考察

[0078] 量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g三份湿法装柱，将相同浓度0.125g/mL、相同体积400mL的供试品上样液，以不同流速(3mL/min、6mL/min、8mL/min）通过大孔吸附树脂层析柱，计算吸附量，确定动态吸附上柱液的最佳流速。

[0079] 结果：流速：3mL/min，吸附量:0.01931 mg/g；流速：6mL/min，吸附量:0.01815mg/g；流速：8mL/min，吸附量:0.01059 mg/g。结果显示随着上柱液流速的增加，苍术内酯I、苍术内酯II的吸附量减小。说明流速增加使扩散时间减小，泄漏加快，吸附率降低。从生产周期以及经济效益角度考虑，选择6mL/min为最佳动态吸附上柱液流速。

[0080] 泄漏曲线的测定

[0081] 量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g湿法装柱，将0.125g/mL供试品溶液上样, 6mL/min流速通过大孔吸附树脂色谱柱。流出液每40mL接一份，按上述色谱条件进行测定，绘制苍术内酯I的泄露曲线。由图4可知大孔树脂（DM130）对苍术内酯I的吸附收集液至
400mL时达到吸附平衡，故最大上样液体积为400mL。

[0082] 不同洗脱溶剂考察

[0083] 量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g湿法装柱，将0.125g/mL浓度的供试品上样液，以6mL/min通过大孔吸附树脂层析柱，上样液体积为400mL。对吸附饱和的大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗至无糖，再分别用95%、70%、50%、30%乙醇200mL作洗脱剂，以相同流速(6mL/min）通过大孔吸附树脂层析柱。将洗脱液水浴蒸干用甲醇定容至25mL的容量瓶中，按上述色谱条件进行测定，计算解吸率、干固量，确定动态解吸的最佳洗脱溶剂。

[0084] 由表3可得，根据计算所得的解吸率、解吸量显示95%乙醇洗脱的苍术内酯 纯度较高，故选用95%乙醇做洗脱剂。

[0085] 表3乙醇洗脱浓度选择

[0086]洗脱溶剂 解吸率 (%) 干固体含量(mg/g)
95 % 91.8 0.1219
70 % 48.4 0.1043
50 % 6.3 0.0205
30 % — —

[0087] 不同洗脱流速考察

[0088] 量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g湿法装柱，将0.125g/mL浓度的供试品上样液，以6mL/min通过大孔吸附树脂层析柱，上样液体积为400mL。对已吸附饱和的大孔树脂，先用蒸馏水洗至无糖，再用95%乙醇200mL以不同流速(2mL/min、3mL/min、4mL/min、6mL/min)洗脱，将洗脱液水浴蒸干用甲醇定容，按上述色谱条件进行测定，计算解吸率，确定洗脱液的最佳流速。苍术内酯I的解吸率分别为：74.12%、83.74%、90.59%和83.15%，结果显示洗脱流速为4mL/min时苍术内酯I的解吸率最大，故4mL/min 为最佳洗脱流速。

[0089] 洗脱体积考察

[0090] 量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g湿法装柱，将0.125g/mL浓度的供试品上样液，以6mL/min通过大孔吸附树脂层析柱，上样液体积为400mL。对已吸附饱和的大孔树脂，先用蒸馏水洗至无糖，再用95%乙醇200mL以流速4mL/min洗脱，将洗脱液每20mL接一份水浴蒸干用甲醇定容至5mL的容量瓶中，按上述色谱条件进行测定，计算解吸量，确定洗脱液的用量。由洗脱曲线（图5和图6）可知，用洗脱体积为30mL时解吸量最大，随后减小，100mL以后保持平衡，说明已洗脱完全，故洗脱体积的最大用量为100mL。

[0091] 实施例4 动态吸附解吸验证试验

[0092] 根据以上实验，确定了DM130型大孔吸附树脂纯化党参中苍术内酯I、苍术内酯II的最优工艺条件，验证试验如下：

[0093] 将实施例1中得到的提取物用水溶解制成重量/体积比0.125g/mL的提取物溶液，量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g湿法装柱，取400mL，在30℃下将上样流速为6mL/min； 95%乙醇作洗脱剂，洗脱剂流速为4mL/min，洗脱体积的用量为100mL。在此条件下，进行动态吸附-解吸验证试验。纯化前后的色谱图见图7-10。

[0094] 表4吸附解吸效果

[0095]

[0096] 实施例5 改进的提取方式

[0097] 为了进一步地提高树脂的吸附、解吸量，发现通过采用反相C18硅胶柱进行吸附和解吸操作之后，可以有效地去除影响DM130吸附解吸的物质，能够提高苍术内酯I、苍术内酯II的提取收率。在实施例4的基础上，本实施例对上述工艺进行了改进：

[0098] 将实施例1中得到的提取物用水溶解制成重量/体积比0.125g/mL的提取物溶液，送入反相C18硅胶柱色谱分离，提取物溶液与C18反相硅胶重量比是2：1，先在35℃下用甲醇-水体积比为25∶75洗脱5BV后弃去洗脱液，再在40℃下用体积比为45∶65的甲醇-水体系洗脱5BV，收集洗脱液并减压回收溶剂，即得纯化后的提取物，再将纯化后的提取物用水溶解制成重量/体积比0.125g/mL进行上样，量取已处理好的大孔树脂（DM130）1.0g湿法装柱，取400mL，在30℃下将上样流速为6mL/min； 95%乙醇作洗脱剂，洗脱剂流速为4mL/min，洗脱体积的用量为100mL。

[0099] 表5吸附解吸效果

[0100]

[0101] 可以看出，通过以上实施例5通过对提取物溶液进行了C18反相硅胶树脂处理之后，可以有效地去除影响DM130吸附解吸的杂质，提高吸附和解吸效果。