一种氮杂吖啶类化合物及其制备方法与用途

摘要

本发明公开了一种高效制备氮杂吖啶类化合物的方法。所述氮杂吖啶类化合物结构式如式I所示，所述的制备方法为：在空气条件下加入2‑氨基喹啉‑3‑甲酰胺化合物与溶剂，加热至反应温度，反应完毕后分离提纯得到多取代吖啶类衍生物，如下式所示；反应温度为100‑200℃；反应时间为1‑24h。本发明的氮杂吖啶类化合物合成方法科学合理，合成过程简便易操作、合成产率高、产品易于纯化。本发明还涉及一种能够抑制EGFR和Src的氮杂吖啶类衍生物及其制备方法、包含它的药物活性及其用途。所述化合物如式II所示，所述化合物可用于制备EGFR和Src活性抑制剂的制备以及由EGFR和Src活化介导的疾病治疗药的制备。

权利要求

1.一种式II所示的化合物，或其可药用的盐，

上述式II中，Linker选自下列结构单元中的一种：其中，Linker1连接到C1原子或C2原子上，Linker2连接到C1或C2原子上；

R独立地为H、F、Cl、Br、CH3、CH2CH3、OCH3、CF3、CCl3。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中，式II化合物选自化合物12a-12f、13a-13f、14a-

14f中的任意一种，

3.一种式II所示化合物的制备方法，其包括以下步骤：

1a)将式I所示化合物 在POCl3下回流反应，反应完全后滴加入冰水中，调解pH至7-10，过滤收集沉淀，得到化合物5

1b)将三光气溶于0℃以下的有机溶剂中，并向其中滴加对硝基苯胺或林硝基苯胺，以及Et3N，待反应完全后升温回流3-4小时，反应完全后去除溶剂获得化合物6

1c)以有机溶剂溶解步骤1b)获得的化合物6 并加入苯胺衍生物，在40-80℃下反应，反应完全后过滤，纯化后得到化合物7

1d)将化合物7 的醇溶液中加入铁粉加热至40-60℃反应至完全，然后加NH4Cl水溶液回流反应反应至完全后过滤，将除去溶剂后加入丙酮，过滤后滤液去除溶剂，得到化合物8

1e)化合物5和化合物8在醇溶剂和Et3N条件下回流反应至完全，除去溶剂后纯化，获得式II所示化合物；

其中，式II所示化合物中Linker选自Linker1；

其中，苯胺衍生物选自苯胺、3-氟苯胺、3-氯苯胺、3-溴苯胺、3-甲基苯胺、3-乙基苯胺、

3-甲氧基苯胺、3-三氟甲基苯胺或3-三氯甲基苯胺；相应地，R基选自H、F、Cl、Br、CH3、CH2CH3、OCH3、CF3或CCl3。

4.一种式II所示化合物的制备方法，其包括以下步骤：

2a)将式I 所示化合物在POCl3下回流反应，反应完全后滴加入冰水中，调解pH至7-10，过滤收集沉淀，得到化合物5；

2b)苯甲酸衍生物溶于SOCl2，在60-95℃下反应至完全，去除溶剂得到化合物9

2c)将化合物9溶于有机溶剂中冷却至0℃以下，并向其中加入间硝基苯胺或对硝基苯胺和Et3N，反应完全后去除溶剂，纯化后得到化合物10

2d)将化合物10的醇溶液中加入铁粉和氯化铵，回流反应2h；反应完全后过滤，并除去滤液中的溶剂，纯化后得到化合物11

2e)化合物5和化合物11在醇溶剂和Et3N条件下回流反应至完全，除去溶剂后纯化，获得式II所示化合物；

其中，式II所示化合物中Linker选自Linker2；

其中，苯甲酸衍生物选自苯甲酸、3-氟苯甲酸、3-氯苯甲酸、3-溴苯甲酸、3-甲基苯甲酸、3-乙基苯甲酸、3-甲氧基苯甲酸、3-三氟甲基苯甲酸或3-三氯甲基苯甲酸；相应地，R基选自H、F、Cl、Br、CH3、CH2CH3、OCH3、CF3或CCl3。

5.权利要求1所述的化合物在制备治疗细胞增殖性疾病，增殖性疾病为癌症或癌前期病变的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，所述癌症为转移癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、慢性髓细胞性白血病、黑素瘤、肺小细胞肺癌或卵巢癌。

7.权利要求2所述的化合物在制备治疗癌细胞扩散或转移的药物中的用途。

8.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1所述的化合物。

说明书

一种氮杂吖啶类化合物及其制备方法与用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种简单、有效的氮杂吖啶类母核合成方法和其应用。

背景技术

[0002] 发现一种新的吖啶类化合物作为激酶抑制剂的母核，尤其是合成方法的优化，有重要的研究意义。氮吖啶类衍生物是一种极具研究与应用价值的化合物，可以广泛的应用于染料、荧光、药物化学，并且对于抗癌也有一定的功效。氮杂吖啶类化合物的研究仍然是有机合成以及药物化学的热点之一，所以高效便捷的合成氮杂吖啶类衍生物具有重要意义。简单直接地合成氮杂吖啶类衍生物的方法迄今仍报道不多。

[0003] 吖啶的高度共平面性，使其在抗肿瘤方面表现优秀，可以作为DNA拓扑异构酶、端粒酶、蛋白激酶等的抑制剂，受到科研工作者的关注。EGFR是HER激酶家族包括HER1(EGFR)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)及HER4(ErbB4)中的一员，以单体形式存在。当配体与受体相结合时，会激发ErbB发生同源二聚或异源二聚，之后诱导一系列酪氨酸残基发生磷酸化。Src作为EGFR的C端受体Tyr845的磷酸化激酶，磷酸化的Src通过调节MAPK、PI3K、STAT3等下游多种信号通路，影响细胞生长、增殖、血管生成等各项生命活动。此外，在人的许多肿瘤细胞中，Src-EGFR协同作用可导致肿瘤发生。临床实验表明，EGFR抑制剂和Src小分子抑制剂联合用药可以有效地抑制对EGFR抑制剂产生耐药性的癌细胞。因此，双重抑制EGFR和Src能达到更理想的抑癌效果。本专利发明了一种可以抑制EGFR/Src的化合物及其制备方法、包含它的药物活性及其用途。

发明内容

[0004] 本发明提供一种简单、高产率的由2-氨基喹啉-3-甲酰胺制备氮杂吖啶类衍生物的方法。

[0005] 本发明的目的在于提供一种能够抑制EGFR/Src的化合物及其制备方法、包含它的药物活性及其用途。

[0006] 本发明一个方面提供了所述氮杂吖啶类母核，其结构如式I所示

[0007]

[0008] 化合物为氮杂吖啶类化合物，其结构如式II所示；

[0009]

[0010]

[0011] 上述式II中，Linker可以选自下列结构单元：

[0012]

[0013] 其中，Linker1连接到C1原子或C2原子上，Linker2连接到C1或C2原子上；

[0014] R选自H、F、Cl、CH3、CH2CH3、OCH3、CF3；

[0015] 上述式II所示的化合物优选为下述任意一种：

[0016]

[0017]

[0018] 本发明另一个方面提供了一种式I所示化合物的制备方法，

[0019] 式I化合物结构式如下： 式I；

[0020] 制备方法包括如下步骤：

[0021] 1)邻硝基苯甲醛在铁粉和氯化铵条件下，回流反应至反应完全，过滤回收滤液；

[0022] 2)在步骤1)所得滤液中加入丙二腈和Et3N，回流反应至反应完全；过滤收集沉淀，得到化合物2

[0023] 3)将步骤2)所得化合物2 中加入浓硫酸，反应完全后滴加入冰水中，调解pH至8，过滤收集沉淀，得到化合物3

[0024] 4)将步骤3)所得化合物3 溶于甲酰胺，在100-200℃下反应至完全，过滤收集沉淀，得到式I所示化合物。

[0025] 本发明再一个方面提供了一种式II所示化合物的制备方法，其包括以下步骤：

[0026] 1a)将式I所示化合物在POCl3下回流反应，反应完全后滴加入冰水中，调解pH至7-10，过滤收集沉淀，得到化合物5

[0027] 1b)将三光气溶于0℃以下的有机溶剂中，并向其中滴加对硝基苯胺或林硝基苯胺，以及Et3N，待反应完全后升温回流3-4小时，反应完全后去除溶剂获得化合物6[0028] 1c)以有机溶剂溶解步骤b)获得的化合物6 并加入苯胺衍生物，在40-80℃下反应，反应完全后过滤，纯化后得到化合物7

[0029] 1d)将化合物7 的醇溶液中加入铁粉加热至40-60℃反应至完全，然后加NH4Cl水溶液回流反应反应至完全后过滤，将除去溶剂后加入丙酮，过滤后滤液去除溶剂，得到化合物8

[0030] 1e)化合物5和化合物8在醇溶剂和Et3N条件下回流反应至完全，除去溶剂后纯化，获得式II所示化合物；

[0031] 其中，式II所示化合物中Linker选自Linker1；

[0032] 其中，苯胺衍生物选自苯胺、3-氟苯胺、3-氯苯胺、3-溴苯胺、3-甲基苯胺、3-乙基苯胺、3-甲氧基苯胺、3-三氟甲基苯胺或3-三氯甲基苯胺；相应地，R基选自H、F、Cl、Br、CH3、CH2CH3、OCH3、CF3或CCl3。

[0033] 优选地，所述式I化合物通过前述的制备方法获得。

[0034] 本发明再一个方面提供了一种式II所示化合物的制备方法，其包括以下步骤：

[0035] 2a)将式I所示化合物在POCl3下回流反应，反应完全后滴加入冰水中，调解pH至7-10，过滤收集沉淀，得到化合物5；

[0036] 2b)苯甲酸衍生物溶于SOCl2，在60-95℃下反应至完全，去除溶剂得到化合物9[0037] 2c)将化合物9溶于有机溶剂中冷却至0℃以下，并向其中加入间硝基苯胺或对硝基苯胺和Et3N，反应完全后去除溶剂，纯化后得到化合物10

[0038] 2d)将化合物10的醇溶液中加入铁粉和氯化铵，回流反应2h；反应完全后过滤，并除去滤液中的溶剂，纯化后得到化合物11

[0039] 2e)化合物5和化合物11在醇溶剂和Et3N条件下回流反应至完全，除去溶剂后纯化，获得式II所示化合物；

[0040] 其中，式II所示化合物中Linker选自Linker2；

[0041] 其中，苯甲酸衍生物选自苯甲酸、3-氟苯甲酸、3-氯苯甲酸、3-溴苯甲酸、3-甲基苯甲酸、3-乙基苯甲酸、3-甲氧基苯甲酸、3-三氟甲基苯甲酸或3-三氯甲基苯甲酸；相应地，R基选自H、F、Cl、Br、CH3、CH2CH3、OCH3、CF3或CCl3。

[0042] 优选地，所述式I化合物通过前述的式I所示化合物的制备方法获得。

[0043] 本发明一个具体的技术方案中还提供了一种上述式I所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0044] a、邻硝基苯甲醛(化合物1)溶于EtOH(20ml)，加入铁粉和氯化铵水溶液(5ml)，回流反应。反应完成后趁热过滤，收集滤液。

[0045] b、往滤液直接加丙二腈和Et3N(2ml)，加热至回流反应。然后将反应液冷却至室温，过滤将固体收集化合物2。

[0046] c、将化合物2溶于浓H2SO4，搅拌24h后滴加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物3。

[0047] 化合物3溶于甲酰胺，在100-200℃下反应1-24h，待反应液冷却后过滤，用溶剂洗去多余甲酰胺及杂质，烘干得到化合物4(化合物I).

[0048] 本发明一个具体的技术方案中还提供了一种上述式II所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0049] a、邻硝基苯甲醛(化合物1)溶于EtOH(20ml)，加入铁粉和氯化铵水溶液(5ml)，回流反应。反应完成后趁热过滤，收集滤液。

[0050] b、往滤液直接加丙二腈和Et3N(2ml)，加热至回流反应。然后将反应液冷却至室温，过滤将固体收集化合物2。

[0051] c、将化合物2溶于浓H2SO4，搅拌24h后滴加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物3。

[0052] d、化合物3溶于甲酰胺，在100-200℃下反应1-24h，待反应液冷却后过滤，用溶剂洗去多余甲酰胺及杂质，烘干得到化合物4(化合物I).

[0053] e、化合物4(化合物I)溶于POCl3回流反应3h,待反应液冷却后加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物5。

[0054] f、将三光气溶于-20℃的THF中，并向其中缓慢滴加对硝基苯胺的THF溶液和Et3N，待反应稳定后升温回流3-4小时，然后将反应液旋干得到化合物6。

[0055] g、化合物6后溶于THF，加入不同取代苯胺(10.0mmol)的THF溶液，加热至60℃反应3h，待反应液冷却后过滤,用二氯和乙醚洗涤得到7(a-f)。

[0056] h、7(a-f)溶于乙醇加入铁粉加热至50℃搅拌半小时，然后加NH4Cl水溶液升温至回流反应2小时，趁热过滤。将滤液旋干后投入丙酮中，过滤,旋干得到8(a-f)。

[0057] i、化合物5溶于异丙醇加入不同取代基的侧链8(a-f)和Et3N，回流反应过夜。冷却反应液后旋干，用少量乙醚洗即可得化合物14(a-f)。

[0058] 本发明一个具体的技术方案中还提供了一种上述式II所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0059] a.邻硝基苯甲醛(化合物1)溶于EtOH(20ml)，加入铁粉和氯化铵水溶液(5ml)，回流反应。反应完成后趁热过滤，收集滤液。

[0060] b.往滤液直接加丙二腈和Et3N(2ml)，加热至回流反应。然后将反应液冷却至室温，过滤将固体收集化合物2。

[0061] c.将化合物2溶于浓H2SO4，搅拌24h后滴加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物3。

[0062] d.化合物3溶于甲酰胺，在100-200℃下反应1-24h，待反应液冷却后过滤，用溶剂洗去多余甲酰胺及杂质，烘干得到化合物4(化合物I).

[0063] e.化合物4(化合物I)溶于POCl3回流反应3h,待反应液冷却后加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物5。

[0064] f.苯甲酸衍生物溶于SOCl2，在80℃下反应2-3h，旋出溶剂得到化合物9(a-f).[0065] g.加入CH2Cl2溶解化合物9(a-f)冷却至-20℃。保持低温向其中加间硝基苯胺CH2Cl2溶液和Et3N。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，再次用CH2Cl2洗涤得到纯净的酰胺键产物10(a-f)。

[0066] h.10(a-f)溶于EtOH加入铁粉和氯化铵水溶液，回流反应2h。趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，将滤液旋干即为纯产物11(a-f)。

[0067] i.化合物5溶于异丙醇加入不同取代基的侧链11(a-f)和Et3N，回流反应过夜。冷却反应液后旋干，用少量乙醚洗即可得化合物13(a-f)。

[0068] 本发明还提供了一种上述式II所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

[0069] a.邻硝基苯甲醛(化合物1)溶于EtOH(20ml)，加入铁粉和氯化铵水溶液(5ml)，回流反应。反应完成后趁热过滤，收集滤液。

[0070] b.往滤液直接加丙二腈和Et3N(2ml)，加热至回流反应。然后将反应液冷却至室温，过滤将固体收集化合物2。

[0071] c.将化合物2溶于浓H2SO4，搅拌24h后滴加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物3。

[0072] d.化合物3溶于甲酰胺，在100-200℃下反应1-24h，待反应液冷却后过滤，用溶剂洗去多余甲酰胺及杂质，烘干得到化合物4(化合物I).

[0073] e.化合物4(化合物I)溶于POCl3回流反应3h,待反应液冷却后加至冰水中，用NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物5。

[0074] f.苯甲酸衍生物溶于SOCl2，在80℃下反应2-3h，旋出溶剂得到化合物9(a-f).[0075] g.加入CH2Cl2溶解化合物9(a-f)冷却至-20℃。保持低温向其中加入对硝基苯胺CH2Cl2溶液和Et3N。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，再次用CH2Cl2洗涤得到纯净的酰胺键产物10(g-m)。

[0076] h.10(g-m)溶于EtOH加入铁粉和氯化铵水溶液，回流反应2h。趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，将滤液旋干即为纯产物11(g-m)。

[0077] i.化合物5溶于异丙醇加入不同取代基的侧链11(g-m)和Et3N，回流反应过夜。冷却反应液后旋干，用少量乙醚洗即可得化合物12(a-f)。

[0078] 所述不同取代基苯胺化合物选自：苯胺、3-氟苯胺、3-氯苯胺、3-甲基苯胺、3-甲氧基苯胺、3-三氟甲基苯胺；苯甲酸衍生物选自：苯甲酸、3-氟苯甲酸、3-氯苯甲酸、3-甲基苯甲酸、3-甲氧基苯甲酸、3-三氟甲基苯甲酸。

[0079] 本发明再一个方面提供了前述化合物在制备治疗细胞增殖性疾病，优选为癌症或癌前期病变的药物中的用途，更有选地，所述癌症为转移癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、白血病、慢性髓细胞性白血病、黑素瘤、肺小细胞肺癌或卵巢癌。

[0080] 本发明再一个方面提供了前述化合物在制备治疗癌细胞扩散或转移的药物中的用途。

[0081] 本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的前述化合物。

[0082] 有益效果

[0083] 1、本发明合成了一系列新的的氮杂吖啶类化合物，合成过程简便易操作、合成产率高、产品易于纯化等特点。

[0084] 2、本发明的制备的新化合物具有明显抗肿瘤效果，显著影响EGFR，p-EGFR，Src和p-Src蛋白表达水平；并能诱导癌细胞凋亡，并抑制癌细胞迁移。

附图说明

[0085] 图1表示化合物式I的核磁表征谱图：1HNMR和13CNMR

[0086] 图2表示化合物13b在A549细胞中对EGFR，p-EGFR，Src和p-Src蛋白表达水平的影响。

[0087] 图3A表示化合物13b浓度为0μmol(对照组)时在K562细胞凋亡的影响。

[0088] 图3B表示化合物13b浓度为0.01μmol时在K562细胞凋亡的影响。

[0089] 图3C表示化合物13b浓度为0.1μmol时在K562细胞凋亡的影响。

[0090] 图3D表示化合物13b浓度为1μmol时在K562细胞凋亡的影响。

[0091] 图4A表示化合物13b浓度为0μmol对A549细胞迁移的影响。

[0092] 图4B表示化合物13b浓度为0.1μmol对A549细胞迁移的影响。

[0093] 图4C表示化合物13b浓度为1μmol对A549细胞迁移的影响。

[0094] 图4D表示化合物13b浓度为对A549细胞迁移的影响量化分析。

具体实施方式

[0095] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

[0096] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0097]

[0098] 合成方法1、反应试剂与条件:(a)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(b)丙二睛，回流；(c)浓硫酸,24h；(d)甲酰胺，100-200℃,1-24h.

[0099]

[0100] 合成方法2、反应试剂与条件:(a)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(b)丙二睛，回流；(c)浓硫酸，室温；(d)甲酰胺，160℃；(e)三氯氧磷，80℃；(f)三光气，四氢呋喃,-20℃；(g)不同取代基的苯胺，三乙胺，四氢呋喃，回流；(h)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(i)异丙醇，回流。

[0101]

[0102] 合成方法3、反应试剂与条件:(a)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(b)丙二睛，回流；(c)浓硫酸，室温；(d)甲酰胺，160℃；(e)三氯氧磷，80℃；(f)氯化亚砜,80℃；(g)间硝基苯胺，二氯甲烷，-20℃；(h)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(i)异丙醇，回流。

[0103]

[0104] 合成方法4、反应试剂与条件:(a)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(b)丙二睛，回流；(c)浓硫酸，室温；(d)甲酰胺，160℃；(e)三氯氧磷，80℃；(f)氯化亚砜,80℃；(g)对硝基苯胺，二氯甲烷，-20℃；(h)Fe，氯化铵，乙醇，回流；(i)异丙醇，回流。

[0105] 实施例1A： (化合物I)的制备

[0106] 步骤1a、1b制备2-氨基喹啉-3-甲腈(2)

[0107] 邻硝基苯甲醛(3.02g,20mmol)溶于EtOH(20ml)中，然后向其中加入铁粉(3.0g)和氯化铵(1.07g,20mmol)水溶液(5ml)，回流反应。反应完成后趁热过滤，收集滤液，直接加入丙二腈(1.32g,20mmol)和Et3N(2ml)，加热至回流反应。然后将反应液冷却至室温，过滤将固体收集即为化合物2。产率79.6％。

[0108] 化合物结构确证数据为：

[0109] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.69(s,1H),7.65(d,J＝8Hz,1H),7.66(dd,J1＝J2＝8Hz,1H),7.51(d,J＝8Hz,1H),7.28(dd,J1＝J2＝8Hz,1H),7.21(s,3H).

[0110] 步骤1c、制备2-氨基喹啉-3-甲酰胺(3)

[0111] 将化合物2(1.69g,10mmol)溶于浓H2SO4(10ml)中，搅拌24h，待反应液冷却后滴加至冰水中，用20％NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物3。产率95.4％。

[0112] 化合物结构确证数据为：

[0113] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.47(s,1H),8.21(s,1H),7.67(d,J＝8Hz,1H),7.57(m,2H),7.46(d,J＝8Hz,1H),6.98(s,2H).

[0114] 步骤1d、制备5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-醇(4，化合物I)

[0115] 将化合物3(1.88g,10mmol)溶于甲酰胺(20ml)，在100-200℃下反应1-24h，用TLC检测跟踪反应，反应结束后，冷却反应液后过滤，用溶剂甲醇洗去多余甲酰胺及杂质，烘干得到化合物4(化合物I)产率85.3％。

[0116] 化合物结构确证数据为：

[0117] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.096(s,1H),7.835(s,1H),7.035-6.965(m,2H),6.824-6.766(m,2H),6.280(s,2H),3.755(s,2H).

[0118] 实施例1： (化合物14a)的制备

[0119] 步骤2a、2b制备2-氨基喹啉-3-甲腈(2)

[0120] 邻硝基苯甲醛(3.02g,20mmol)溶于EtOH(20ml)中，然后向其中加入铁粉(3.0g)和氯化铵(1.07g,20mmol)水溶液(5ml)，回流反应。反应完成后趁热过滤，收集滤液，直接加入丙二腈(1.32g,20mmol)和Et3N(2ml)，加热至回流反应。然后将反应液冷却至室温，过滤将固体收集即为化合物2。产率79.6％。

[0121] 步骤2c、制备2-氨基喹啉-3-甲酰胺(3)

[0122] 将化合物2(1.69g,10mmol)溶于浓H2SO4(10ml)中，搅拌24h，待反应液冷却后滴加至冰水中，用20％NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物3。产率95.4％。

[0123] 步骤2d、制备5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-醇(4)

[0124] 将化合物3(1.88g,10mmol)溶于甲酰胺(20ml)，在100-200℃下反应1-24h，用TLC检测跟踪反应，反应结束后，冷却反应液后过滤，用溶剂甲醇洗去多余甲酰胺及杂质，烘干得到化合物4(化合物I)产率85.3％。

[0125] 步骤2e、5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-氯(5)

[0126] 将得到化合物4(1.99g,10mmol)直接溶于POCl3(10ml)，回流反应3h。待反应液冷却后滴加至冰水中，用20％NaOH溶液调节pH至8左右，过滤收集沉淀，烘干，得到化合物5。步骤1d和1e的总产率85.6％。

[0127] 化合物结构确证数据为：

[0128] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),8.26(s,1H),7.17-7.10(m,2H),6.94-6.91(m,2H),4.12(s,2H).

[0129] 步骤2f、制备4-异氰酸酯硝基苯(6)

[0130] 将三光气(10.0mmol)溶于-20℃的THF(50ml)中，并向其中缓慢滴加对硝基苯胺(10.0mmol)的THF溶液(50ml)，然后向其中滴加Et3N(20.0mmol)，待反应稳定后升温回流3-4小时，将反应液旋干后得到化合物6。产率79.4％。

[0131] 步骤2g、制备1-(4-硝基苯)-3-苯脲(7a)

[0132] 化合物6(10.0mmol)溶于THF中(20ml)，向其中加入苯胺(10.0mmol)的THF溶液(10ml)，加热至60℃反应3小时，待反应液冷却后过滤，收集固体，分别用二氯和乙醚洗涤固体得到纯产品7a。产率82.3％。

[0133] 步骤2h、制备1-(4-苯胺)-3-苯脲(8a)

[0134] 将7a(2.0mmol)溶于乙醇(20ml)中，加入铁粉(10.0mmol)加热至50℃搅拌半小时，然后向其中加入NH4Cl(2.0mmol)的水溶液(5ml)兵升温至回流反应2小时，趁热过滤。将滤液旋干，投入丙酮中，过滤。收集滤液将其旋干得到化合物8a。产率86.2％。

[0135] 步骤2i、制备1-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-苯基脲(14a)

[0136] 化合物5(100mg,0.46mmol)溶于异丙醇(10ml)中，向其中加入侧链1-(4-苯胺)-3-苯脲8a(0.5mmol)和Et3N(1ml)，回流反应过夜。反应液冷却后旋干，用少量乙醚洗即可得化合物14a。产率67.5％。HRMS(ESI)：[M+H]+409.1777。

[0137] 化合物结构确证数据为：

[0138] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.58(s,1H),10.27(s,1H),9.34(s,1H),8.20(s,1H),7.55-7.51(m,3H),7.48-7.39(m,3H),7.26-7.21(m,3H),7.19-7.11(m,2H),7.07-7.01(m,
2H),4.10(s,2H).

[0139] 实施例2： (化合物14b)的制备

[0140] 按照实施例1的步骤制备化合物14b，不同之处在于：

[0141] 1、制备1-(3-氟苯基)-3-(4-硝基苯)脲(7b)

[0142] 将实施例1中的步骤1g中的苯胺换成3-氟苯胺进行反应。产率83.9％。

[0143] 2、制备1-(4-氨基苯基)-3-(3-氟苯基)脲(8b)

[0144] 将实施例1中的步骤1h中的7a换成7b进行反应。产率87.1％。

[0145] 3、制备1-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-(3-氟苯基)脲(14b)

[0146] 将实施例1中的步骤2i中的8a换成8b进行反应。产率77.5％,HRMS(ESI)：[M+H]+427.1683。

[0147] 化合物结构确证数据为：

[0148] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.58(s,1H),10.27(s,1H),9.49(s,1H),8.68(s,1H),8.40(s,1H),7.60(d,J＝8Hz,2H),7.51(d,J＝8Hz,1H),7.39(d,J＝8Hz,1H),7.34-7.28(m,
3H),7.12(d,J＝8Hz,1H),7.06(d,J＝8Hz,2H),7.01(d,J＝8Hz,2H),4.11(s,2H).[0149] 实施例3： (化合物14c)的制备

[0150] 按照实施例1的步骤制备化合物14c，不同之处在于：

[0151] 1、制备1-(3-氯苯基)-3-(4-硝基苯)脲(7c)

[0152] 将实施例1中的步骤1g中的苯胺换成3-氯苯胺进行反应。产率89.1％。

[0153] 2、制备1-(4-氨基苯基)-3-(3-氯苯基)脲(8c)

[0154] 将实施例1中的步骤1h中的7b换成7c进行反应。产率77.9％。

[0155] 3、制备1-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-(3-氯苯基)脲(14c)

[0156] 将实施例1中的步骤2i中的8b换成8c进行反应。产率87.6％,HRMS(ESI)：[M+H]+423.1367。

[0157] 化合物结构确证数据为：

[0158] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.27(s,1H),9.88(s,1H),9.52(s,1H),8.67(s,1H),8.39(s,1H),7.69(s,1H),7.65(d,J＝8Hz,1H),7.60(d,J＝8Hz,2H),7.38(s,1H),7.31-7.28(m,4H),7.00(d,J＝8Hz,2H),6.97-6.94(m,2H),6.92-6.84(m,2H),4.11(s,2H).

[0159] 实施例4： (化合物14d)的制备

[0160] 按照实施例1的步骤制备化合物14d，不同之处在于：

[0161] 1、制备1-(3-甲基苯基)-3-(4-硝基苯)脲(7d)

[0162] 将实施例1中的步骤1g中的苯胺换成3-甲基苯胺进行反应。产率73.9％。

[0163] 2、制备1-(4-氨基苯基)-3-(3-甲基苯基)脲(8d)

[0164] 将实施例1中的步骤1h中的7c换成7d进行反应。产率77.2％。

[0165] 3、制备1-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-(3-甲基苯基)脲(14d)

[0166] 将实施例1中的步骤2i中的8c换成8d进行反应。产率75.5％,HRMS(ESI)：[M+H]+423.1899。

[0167] 化合物结构确证数据为：

[0168] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.32(s,1H),9.14(s,1H),8.71(s,1H),8.22(s,1H),7.65-7.56(m,3H),7.47(d,J＝8Hz,2H),7.29(d,J＝8Hz,1H),7.26-7.23(m,2H),7.06(d,J＝8Hz,
2H),7.02(d,J＝8Hz,2H),4.21(s,2H),2.02(s,3H).

[0169] 实施例5： (化合物14e)的制备

[0170] 按照实施例1的步骤制备化合物14e，不同之处在于：

[0171] 1、制备1-(3-甲氧基苯基)-3-(4-硝基苯)脲(7e)

[0172] 将实施例1中的步骤1g中的苯胺换成3-甲氧基苯胺进行反应。产率80.9％。

[0173] 2、制备1-(4-氨基苯基)-3-(3-甲氧基苯基)脲(8e)

[0174] 将实施例1中的步骤1h中的7d换成7e进行反应。产率82.1％。

[0175] 3、制备1-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-(3-甲氧基苯基)脲(14e)

[0176] 将实施例1中的步骤2i中的8d换成8e进行反应。产率76.5％,HRMS(ESI)：[M+H]+439.1882。

[0177] 化合物结构确证数据为：

[0178] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.32(s,1H),9.32(s,1H),9.14(s,1H),8.71(s,1H),8.23(s,1H),7.64(d,J＝8Hz,1H),7.62-7.56(m,2H),7.45(dd,J1＝8Hz,J2＝4Hz 2H),7.29(d,J＝8Hz,1H),7.25(dd,J1＝8Hz,J2＝4Hz 2H),7.16-7.12(m,2H),6.93-6.91(m,2H),4.14(s,2H),3.73(s,3H).

[0179] 实施例6： (化合物14f)的制备

[0180] 按照实施例1的步骤制备化合物14f，不同之处在于：

[0181] 1、制备1-(3-三氟甲基苯基)-3-(4-硝基苯)脲(7f)

[0182] 将实施例1中的步骤1g中的苯胺换成3-三氟甲基苯胺进行反应。产率70.9％。

[0183] 2、制备1-(4-氨基苯基)-3-(3-三氟甲基苯基)脲(8f)

[0184] 将实施例1中的步骤1h中的7e换成7f进行反应。产率92.1％。

[0185] 3、制备1-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-(3-三氟甲基苯基)脲(14f)

[0186] 将实施例1中的步骤2i中的8e换成8f进行反应。产率70.5％,HRMS(ESI)：[M+H]+476.1572。

[0187] 化合物结构确证数据为：

[0188] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.74(s,1H),9.67(s,1H),8.81(s,1H),8.47(s,1H),7.65(d,J＝8Hz,2H),7.60(d,J＝8Hz,1H),7.53(d,J＝8Hz,1H),7.50(d,J＝8Hz,1H),7.42(d,J＝8Hz,2H),7.32(d,J＝8Hz,2H),7.16-7.14(m,2H),6.93-6.91(m,2H),4.18(s,2H).

[0189] 实施例7： (化合物12a)的制备

[0190] 按照实施例1的步骤制备化合物12a，不同之处在于：

[0191] 1、制备氮-(3-硝基苯)苯甲酰胺(10a)

[0192] 将苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9a.加入CH2Cl2(10ml)溶解9a，冷却至-20℃并保持，向其中滴加间硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10a。产率75.5％。

[0193] 2、制备氮-(3-苯胺)苯甲酰胺(11a)

[0194] 化合物10a溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11a.产率89.8％。

[0195] 3、制备N-(3-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)苯甲酰胺(12a)[0196] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11a进行反应。产率83.7％。HRMS(ESI)：[M++H]394.1656。

[0197] 化合物结构确证数据为：

[0198] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.19(s,1H),9.76(s,1H),8.25(s,1H),7.76-7.71(m,4H),7.29(d,J＝4Hz,2H),7.16-7.12(m,2H),7.04(s,1H),6.92(m,2H),6.60(d,J＝8Hz,
2H),5.76(s,1H),4.11(s,2H)；

[0199] 实施例8： (化合物12b)的制备

[0200] 按照实施例1的步骤制备化合物12b，不同之处在于：

[0201] 1、制备3-氟-氮-(3-硝基苯)苯甲酰胺(10b)

[0202] 将3-氟苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9b.加入CH2Cl2(10ml)溶解9b，冷却至-20℃并保持，向其中滴加间硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10b。产率85.5％。

[0203] 2、制备3-氟-氮-(3-苯胺)苯甲酰胺(11b)

[0204] 化合物10b溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11b.产率79.8％。

[0205] 3、制备氮-(3-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-氟苯甲酰胺(12b)

[0206] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11b进行反应。产率86.7％。HRMS(ESI)：[M+H]+412.1560。

[0207] 化合物结构确证数据为：

[0208] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.18(s,1H),9.94(s,1H),8.25(s,1H),7.92(d,J＝8Hz,2H),7.57-7.49(m,2H),7.16-7.11(m,3H),6.96-6.92(m,3H),6.91(d,J＝8Hz,1H),5.07(s,
1H),4.11(s,2H).

[0209] 实施例9： (化合物12c)的制备

[0210] 按照实施例1的步骤制备化合物12c，不同之处在于：

[0211] 1、制备3-氯-氮-(3-硝基苯)苯甲酰胺(10c)

[0212] 将3-氯苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9c.加入CH2Cl2(10ml)溶解9c，冷却至-20℃并保持，向其中滴加间硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10c。产率87.5％。

[0213] 2、制备3-氯-氮-(3-苯胺)苯甲酰胺(11c)

[0214] 化合物10c溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11c.产率83.8％。

[0215] 3、制备氮-(3-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-氯苯甲酰胺(12c)

[0216] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11c进行反应。产率87.3％。HRMS(ESI)：[M+H]+428.1278。

[0217] 化合物结构确证数据为：

[0218] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.20(s,1H),10.06(s,1H),8.26(s,1H),7.96(s,1H),7.88(d,J＝8Hz,1H),7.65(d,J＝8Hz,1H),7.55(dd,J1＝J2＝8Hz,1H),7.16-7.12(m,4H),
6.94-6.92(m,4H),5.12(s,1H),4.12(s,2H).

[0219] 实施例10： (化合物12d)的制备

[0220] 按照实施例1的步骤制备化合物12d，不同之处在于：

[0221] 1、制备3-甲基-氮-(3-硝基苯)苯甲酰胺(10d)

[0222] 将3-甲基苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9d.加入CH2Cl2(10ml)溶解9d，冷却至-20℃并保持，向其中滴加间硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10d。产率87.5％。

[0223] 2、制备3-甲基-氮-(3-苯胺)苯甲酰胺(11d)

[0224] 化合物10d溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11d.产率83.8％。

[0225] 3、制备氮-(3-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺(12d)

[0226] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11d进行反应。产率83.10％。HRMS(ESI)：[M+H]+408.1813。

[0227] 化合物结构确证数据为：

[0228] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.218(s,1H),10.01(s,1H),8.25(s,1H),7.79-7.73(m,3H),7.57(s,J＝8Hz,1H),7.42(d,J＝8Hz,1H),7.14-7.09(m,3H),6.97-6.87(m,2H),6.34(m,2H),5.10(s,1H),4.11(s,2H).

[0229] 实施例11： (化合物12e)的制备

[0230] 按照实施例1的步骤制备化合物12e，不同之处在于：

[0231] 1、制备3-甲氧基-氮-(3-硝基苯)苯甲酰胺(10e)

[0232] 将3-甲氧基苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9e.加入CH2Cl2(10ml)溶解9e，冷却至-20℃并保持，向其中滴加间硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10e。产率83.7％。

[0233] 2、制备3-甲氧基-氮-(3-苯胺)苯甲酰胺(11e)

[0234] 化合物10e溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11d.产率88.8％。

[0235] 3、制备氮-(3-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺(12e)

[0236] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11e进行反应。产率80.3％。HRMS(ESI)：[M+H]+424.1760。

[0237] 化合物结构确证数据为：

[0238] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.93(s,1H),8.26(s,1H),7.50(d,J＝8Hz,1H),7.44-7.40(m,2H),7.16-7.10(m,3H),7.08(s,1H),6.98-6.90(m,3H),6.85(d,J＝8Hz,
1H),6.31(d,J＝8Hz,1H),5.11(s,1H),4.11(s,2H),3.83(s,3H).

[0239] 实施例12： (化合物12f)的制备

[0240] 按照实施例1的步骤制备化合物12f，不同之处在于：

[0241] 1、制备3-三氟甲基-氮-(3-硝基苯)苯甲酰胺(10f)

[0242] 将3-三氟甲基苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9f.加入CH2Cl2(10ml)溶解9f，冷却至-20℃并保持，向其中滴加间硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10f。产率83.7％。

[0243] 2、制备3-三氟甲基-氮-(3-苯胺)苯甲酰胺(11f)

[0244] 化合物10f溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11f.产率88.8％。

[0245] 3、制备氮-(3-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(12f)

[0246] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11f进行反应。产率78.3％。HRMS(ESI)：[M++H]462.1520。

[0247] 化合物结构确证数据为：

[0248] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),10.17(s,1H),8.21(s,1H),7.65(m,3H),7.60(d,J＝8Hz,1H),7.54(d,J＝8Hz,1H),7.50(d,J＝8Hz,1H),7.43-7.41(m,2H),7.33-
7.31(m,2H),7.15(d,J＝8Hz,2H),4.11(s,2H).

[0249] 实施例13： (化合物13a)的制备

[0250] 按照实施例1的步骤制备化合物13a,不同之处在于：

[0251] 1、制备氮-(4-硝基苯)苯甲酰胺(10g)

[0252] 将苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9g.加入CH2Cl2(10ml)溶解9g，冷却至-20℃并保持，向其中滴加对硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10g。产率87.2％。

[0253] 2、制备氮-(4-苯胺)苯甲酰胺(11g)

[0254] 化合物10g溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11g.产率79.8％。

[0255] 3、制备N-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)苯甲酰胺(13a)[0256] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11g进行反应。产率88.3％。HRMS(ESI)：[M+H]+394.1650。

[0257] 化合物结构确证数据为：

[0258] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.96(s,1H),8.26(s,1H),7.78(dd,J1＝8Hz,J2＝4Hz,2H),7.56-7.47(d,J＝8Hz,1H),7.41-7.35(m,3H),7.16-7.12(m,2H),6.93-
6.92(m,2H),6.54(d,J＝8Hz,2H),6.37(s,1H)5.01(s,1H),4.11(s,2H).

[0259] 实施例14： (化合物13b)的制备

[0260] 按照实施例1的步骤制备化合物13b,不同之处在于：

[0261] 1、制备3-氟-氮-(4-硝基苯)苯甲酰胺(10h)

[0262] 将3-氟苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9h.加入CH2Cl2(10ml)溶解9h，冷却至-20℃并保持，向其中滴加对硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10h。产率87.2％。

[0263] 2、制备3-氟-氮-(4-苯胺)苯甲酰胺(11h)

[0264] 化合物10h溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11h.产率79.8％。

[0265] 3、制备N-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-氟苯甲酰胺(13b)

[0266] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11h进行反应。产率89.1％。HRMS(ESI)：[M+H]+412.1549。

[0267] 化合物结构确证数据为：

[0268] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.96(s,1H),8.26(s,1H),7.79-7.77(m,2H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.60-7.54(m,1H),7.41-7.35(m,3H),7.16-7.12(m,2H),6.92(d,J＝8Hz,2H),6.52(d,J＝8Hz,1H),5.01(s,1H),4.12(s,2H).

[0269] 实施例15： (化合物13c)的制备

[0270] 按照实施例1的步骤制备化合物13c,不同之处在于：

[0271] 1、制备3-氯-氮-(4-硝基苯)苯甲酰胺(10i)

[0272] 将3-氯苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9i.加入CH2Cl2(10ml)溶解9i，冷却至-20℃并保持，向其中滴加对硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10i。产率72.2％。

[0273] 2、制备3-氯-氮-(4-苯胺)苯甲酰胺(12i)

[0274] 化合物10i溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物12i.产率83.8％。

[0275] 3、制备N-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-氯苯甲酰胺(13c)

[0276] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成12i进行反应。产率90.6％。HRMS(ESI)：[M+H]+428.1256。

[0277] 化合物结构确证数据为：

[0278] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.96(s,1H),8.26(s,1H),7.78(d,J＝8Hz,1H),7.76(d,J＝8Hz,1H),7.56(d,J＝8Hz,1H),7.39(d,J＝8Hz,1H),7.38-7.35(m,2H),
7.16-7.12(m,2H),6.92(d,J＝8Hz,2H),6.54(d,J＝8Hz,2H),5.01(s,1H),4.12(s,2H).[0279] 实施例16： (化合物13d)的制备

[0280] 按照实施例1的步骤制备化合物13d,不同之处在于：

[0281] 1、制备3-甲基-氮-(4-硝基苯)苯甲酰胺(10j)

[0282] 将3-甲基苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9j.加入CH2Cl2(10ml)溶解9j，冷却至-20℃并保持，向其中滴加对硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10j。产率82.2％。

[0283] 2、制备3-甲基-氮-(4-苯胺)苯甲酰胺(11j)

[0284] 化合物10j溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11j.产率85.2％。

[0285] 3、制备N-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺(13d)

[0286] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11j进行反应。产率80.5％。HRMS(ESI)：[M+H]+408.1809。

[0287] 化合物结构确证数据为：

[0288] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.90(s,1H),8.26(s,1H),7.92(d,J＝8Hz,2H),7.53-7.48(m,2H),7.38(d,J＝8Hz,2H),7.16-7.10(m,2H),6.93-6.90(m,2H),6.55(d,J＝8Hz,2H),5.23(s,1H),4.09(s,2H),2.09(s,3H).

[0289] 实施例17： (化合物13e)的制备

[0290] 按照实施例1的步骤制备化合物13e,不同之处在于：

[0291] 1、制备3-甲氧基-氮-(4-硝基苯)苯甲酰胺(10k)

[0292] 将3-甲氧基苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9k.加入CH2Cl2(10ml)溶解9k，冷却至-20℃并保持，向其中滴加对硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10k。产率82.2％。

[0293] 2、制备3-甲氧基-氮-(4-苯胺)苯甲酰胺(11k)

[0294] 化合物10k溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11k.产率85.2％。

[0295] 3、制备N-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺(13e)

[0296] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11k进行反应。产率78.6％。HRMS(ESI)：[M+H]+424.1773。

[0297] 化合物结构确证数据为：

[0298] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.21(s,1H),9.87(s,1H),8.27(s,1H),7.51(d,J＝8Hz,1H),7.46(s,J＝8Hz,1H),7.42(d,J＝8Hz,1H),7.37(d,J＝8Hz,2H),7.17-7.11(m,3H),
6.94(d,J＝8Hz,2H),6.55(d,J＝8Hz,2H),4.13(s,2H),3.84(s,3H).

[0299] 实施例18： (化合物13f)的制备

[0300] 按照实施例1的步骤制备化合物13f,不同之处在于：

[0301] 1、制备3-三氟甲基-氮-(4-硝基苯)苯甲酰胺(10l)

[0302] 将3-三氟甲基苯甲酸(10mmol)溶于SOCl2(10ml)中，在80℃下反应2-3h，然后将溶剂旋出，得到化合物9l.加入CH2Cl2(10ml)溶解9l，冷却至-20℃并保持，向其中滴加对硝基苯胺(12mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液和Et3N(2ml)。室温搅拌2-3h，旋干溶液，将得到的固体投入丙酮中，过滤收集液体，旋干，用CH2Cl2洗涤得到化合物10l。产率87.2％。

[0303] 2、制备3-三氟甲基-氮-(4-苯胺)苯甲酰胺(11l)

[0304] 化合物10l溶于EtOH(20ml)中，加入铁粉(2.5g)和氯化铵(0.53g,10mmol)水溶液(5ml)，回流反应2h。之后趁热过滤，收集滤液旋干。将得到固体溶于丙酮中，过滤收集滤液，旋干溶液得到化合物11l.产率79.8％。

[0305] 3、制备N-(4-((5,10-二氢嘧啶酮[4,5-b]喹啉-4-)氨基)苯基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(13f)

[0306] 将实施例1中的步骤2i中的侧链8a换成11l进行反应。产率89.1％。HRMS(ESI)：[M+H]+412.1549。

[0307] 化合物结构确证数据为：

[0308] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.18(s,1H),9.94(s,1H),8.25(s,1H),7.92(d,J＝8Hz,2H),7.57-7.49(m,2H),7.16-7.11(m,3H),6.96-6.92(m,3H),6.31(d,J＝8Hz,2H),5.07(s,
1H),4.11(s,2H).

[0309] 实施例19：体外抑制活性(酶活)测定

[0310] 体外酶活实验测定化合物的EGFR和Src抑制活性测定

[0311] 配置1×激酶缓冲液，然后用酶对应的2.5％的DMSO溶液三倍倍比梯度稀释待测化合物，向所有反应孔中加入激酶、底物与待测化合物，混匀后室温孵育10分钟，让化合物和酶充分作用结合。向所有反应孔中加入激酶对应浓度的ATP溶液来启动激酶反应，酶反应时间为30分钟。待激酶反应结束后，向所有反应孔中加入稀释好的的Streptavidin-XL665，混匀后立即加入稀释好的TK antibody europium cryptate检测液。封板混匀，室温反应1h后，用ENVISION(Perkinelmer)仪器检测荧光信号(320nm刺激,665nm，615nm发射)。通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率，复孔取平均值，同时用专业的画图分析软件PRISM 5.0对每个待测化合物进行半数抑制活性(IC50)的拟合。实验结果见表2。

[0312] Src抑制活性测定

[0313] 配置1×缓冲液，然后用100％的DMSO三倍倍比梯度稀释待测化合物，用1×缓冲液制备酶的溶液，往1×缓冲液中加入trypsin and Ac-peptide来制备底物溶液，向反应孔中加入酶与待测化合物，混匀后室温孵育10分钟。再向所有反应孔中加入底物溶液来启动反应。室温反应1h后，用Synergy MX仪器检测荧光信号(355nm刺激,480nm发射)。通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率，复孔取平均值，同时用专业的画图分析软件PRISM 5.0对每个待测化合物进行半数抑制活性(IC50)的拟合。实验结果见表2。

[0314] 表2.体外抑制活性(酶活)测定结果

[0315]

[0316] 表2表明，本发明化合物对EGFR和Src具有较强的抑制作用。

[0317] 实施例20：化合物对癌细胞增殖的影响

[0318] 通过MTT法，检测实施例1-18制备获得的化合物对A549和K562肿瘤细胞体外增殖抑制活性。

[0319] 首先，将实施例1-18制备获得的化合物(即样品)分别配制成化合物浓度为5mM/L的DMSO(二甲基亚砜)溶液，然后将获得的溶液经梯度稀释，得到一系列浓度梯度的样品溶液。

[0320] 取对数生长期A549,根据不同细胞的生长速度，以每孔5×105个细胞数均匀铺于96孔细胞培养板(100μL/孔)中，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养12小时。吸去旧培养基，每孔加入含有不同浓度药物的新鲜培养基100μL(药物溶于DMSO，其中DMSO的终浓度为1％(v/v))，每个浓度组设5个复孔。同时设阴性对照组(加同样体积的正常培养基)、DMSO对照组(加同样体积含1％DMSO的培养基)和空白对照组(加同样体积含1％DMSO的培养基)，继续培养48小时。除空白对照组，其他组均加入5mg/mL的MTT溶液，10μL/孔。继续培养4小时，吸除上清后每孔加入100μL的DMSO。使用微量振荡器振荡，使DMSO完全溶解甲瓒。然后使用多功能检测酶标仪测量490nm处的OD值，并计算每组5个复孔OD值的平均值，并按如下公式计算抑制率(inhibition rate，IR％)：IR％＝(ODDMSO-OD加药)/(ODDMSO-OD空白)×100％，其中ODDMSO为DMSO对照组的OD值、OD加药为加药组的OD值、OD空白为空白对照组的OD值。根据抑制率使用绘图软件绘图，求出IC50值。实验结果见表3。

[0321] 取对数生长期K562细胞,根据不同细胞的生长速度，以每孔7×105个细胞数均匀铺于96孔细胞培养板(100μL/孔)中，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养12小时。然后每孔加入含有不同浓度药物的新鲜培养基100μL(药物溶于DMSO，其中DMSO的终浓度为1％(v/v))，每个浓度组设5个复孔。同时设阴性对照组(加同样体积的正常培养基)、DMSO对照组(加同样体积含1％DMSO的培养基)和空白对照组(加同样体积含1％DMSO的培养基)，继续培养48小时。除空白对照组，其他组均加入5mg/mL的MTT溶液，10μL/孔。继续培养4小时，吸除上清后每孔加入100μL的DMSO。使用微量振荡器振荡，使DMSO完全溶解甲瓒。然后使用多功能检测酶标仪测量490nm处的OD值，并计算每组5个复孔OD值的平均值，并按如下公式计算抑制率(inhibition rate，IR％)：IR％＝(ODDMSO-OD加药)/(ODDMSO-OD空白)×100％，其中ODDMSO为DMSO对照组的OD值、OD加药为加药组的OD值、OD空白为空白对照组的OD值。根据抑制率使用绘图软件绘图，求出IC50值。实验结果见表3。

[0322] 表3.癌细胞增殖抑制活性测定结果

[0323]

[0324]

[0325] 表3表明，本发明化合物对A549和K562肿瘤细胞具有较强的抑制作用。

[0326] 实施例21：化合物13b对EGFR,p-EGFR,Src和p-Src蛋白表达水平的影响[0327] 在人肺癌细胞株A549通过测定EGFR p-EGFR,Src和p-Src的蛋白表达水平，评估了化合物13b对细胞中的EGFR,p-EGFR,Src和p-Src的影响。

[0328] 用不同浓度的化合物13b处理A549细胞，然后取出预处理细胞(60mm细胞培养皿)，吸去上清，以2mL 1×PBS洗涤2次。根据细胞的生长密度，加入50–80μL NP-40蛋白裂解液，使用细胞刮刀刮取细胞，置冰上裂解30分钟。4℃，20000g，离心10分钟。取上清，转移至新的离心管并记录上清体积。取5μL上清，用DC蛋白质定量试剂盒进行蛋白定量。剩余上清加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(加入5×SDS-PAGE上样缓冲液的体积为剩余上清体积的1/4)，混匀，100℃，10分钟，-80℃保存备用。

[0329] 提取预处理细胞的细胞总蛋白后，利用western blot检测相关蛋白的表达水平。根据DC法蛋白定量结果等量上样(20–30μg)，根据检测目的蛋白的大小，分别进行浓度为
7.5％、10％、12％或15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，小心取出凝胶，同时剪裁与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于无水甲醇中活化10秒。按照湿转方法叠放滤纸片、凝胶、PVDF膜和滤纸片，使用玻璃棒赶出其中的气泡。固定电流于260mA，转膜1–3小时，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。转膜结束后，取出PVDF膜，将其浸泡于丽春红染色液中，观察转膜效果。用1×TBST洗涤，彻底去除去丽春红染色液，加入适量的5％(w/v)BSA溶液，室温封闭2–4小时。封闭结束后，PVDF膜用1×TBST稍微洗涤2次，然后加入稀释好的相应抗体，4℃孵育过夜。PVDF膜用1×TBST洗涤3次，每次5分钟，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠的抗体(使用1×TBST溶液稀释相应抗体，稀释比例为1:3000)，室温孵育1.5–2小时。
PVDF膜用1×TBST洗涤3次，每次5分钟，加入发光底物(ClarityTMWestern ECL Substrate试剂盒)，使其均匀覆盖于PVDF膜表面，然后使用凝胶成像仪的化学发光系统进行显影曝光。结果参见图1。

[0330] 实验结果表明，化合物13b在A549细胞中对EGFR,p-EGFR,Src和p-Src有很明显的抑制作用这充分说明化合物13b是个双靶点EGFR和Src抑制剂。

[0331] 实施例21：化合物13b在K562细胞上对细胞凋亡的影响

[0332] 本实验使用LifeTechnologies公司所出售的Alexa 488 Annexin Ⅴ/Dead Cell Apoptosis试剂盒(货号：V13241)检测细胞凋亡。该试剂盒主要包括：Alexa 488 annexin Ⅴ(Component A)，Propidium iodide(PI，Component B)和5×annexin-binding buffer(Component C)。具体实验流程如下：取1mL 5×annexin-binding buffer(Component C)，加入4mL超纯水，得到1×annexin-binding buffer。取5μL 1mg/mL的PI储存液(Component B)，加入45μL 5×annexin-binding buffer(Component C)，得到PI染色工作液。用不同浓度的化合物4处理BT-474细胞，取出预处理细胞，1×PBS洗涤1次，加入胰酶细胞消化液消化细胞，收集细胞。离心后去上清，加1×PBS洗涤1次，离心并去除上清。加入100μL 1×annexin-binding buffer重悬细胞，并调整细胞密度为1×106个细胞/mL。加入5μL Alexa 488 annexin Ⅴ(Component A)和1μL PI染色工作液(步骤2得到的溶液)。室温避光孵育15分钟。加入400μL 1×annexin-binding buffer，慢慢混匀，冰浴避光放置。用流式细胞仪检测细胞周期凋亡。结果参见图3A至图3D。

[0333] 实验结果如图3A至图3D所示，在K562细胞中，随着化合物13b的药物浓度从0μM增加到1μM，诱导的凋亡细胞从4.68％上升到18.8％。实验结果表明，化合物13b能显著诱导K562细胞凋。

[0334] 实施例22：化合物13b在A549细胞上对细胞迁移的影响

[0335] 将有基质的小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，室温下静置15-30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。A549细胞加不同浓度的化合物13b预处5
理6h,然后接种细胞密度至1-5×10 到Transwell小室里，加入200μl细胞悬液，下室加入
500μl含FBS的培养基，培养A549细胞12h,加化合物13b 37℃孵育静置24h.用1×PBS洗涤，
3％福尔马林固定15分钟后用棉签把上层未穿透小孔的细胞轻轻擦拭掉，PBS洗干净后用结晶紫染色，最后观察和拍照。五个随机的观察视野统计穿透的细胞数目用Image-Pro-Plus 
6.0of Media Cybernetics(MD,USA).24小时。

[0336] 结果参见图4A至图4D。

[0337] 实验结果如图4A至图4D所示，在A549细胞中，随着化合物13b的药物浓度从0μM增加到1μM，抑制A549细胞迁移率从52.5％上升到82.8％。

[0338] 实验结果表明，化合物13b能显著抑制A549细胞迁移。