一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法

摘要

本发明涉及微生物检测技术领域，本发明提供了一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法，包括以下步骤：1)将在野外采集的土壤置于开口透气容器中，密封容器开口；2)对步骤1)密封后的透气容器进行恒温鼓风，使其中的土壤干燥。试验结果显示，使用本发明所述方法预处理之后的土壤进行烃氧化菌的检测，其结果和常规冷冻方法的结果类似。本发明干燥之后的土壤经过两周的常温放置，之后再进行检测，其结果和刚刚干燥的样品类似。以上结果说明，本发明所述方法作为常规冷冻保存的替代方法，在油气微生物勘探中对烃氧化菌的研究中，具有较高的适用性。

权利要求

1.一种用于油气微生物勘探烃氧化菌基于培养检测的土壤样品的预处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将在野外采集的土壤置于开口透气容器中，密封容器开口；

2)对步骤1)密封后的透气容器进行恒温鼓风，所述恒温鼓风的温度为25～50℃，使其中的土壤干燥。

2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述恒温鼓风的温度为30～38℃。

3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述恒温鼓风的时间为1～72小时。

4.根据权利要求3所述的预处理方法，其特征在于，所述恒温鼓风的时间为3～24小时。

5.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述开口透气容器为牛皮纸袋。

6.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述恒温鼓风的方式为单独鼓风单独恒温或者恒温和鼓风同时使用。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的预处理方法，其特征在于，还包括：

3)将步骤2)干燥后的样品常温保存。

说明书

一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及土壤微生物检测技术领域，尤其涉及一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法。

背景技术

[0002] 目前，用于环境土壤微生物检测的样品保存方法主要是现场采集后迅速低温冷冻，或者保持在1-5℃保存，即在野外现场取一定量的土壤样品密封后，使用冰箱、液氮、冰袋或者干冰等方法进行冷冻或者保持1-5℃，运输的全程也需要保持冷冻或者低温的状态。利用保存的土壤样品检测微生物，所获得的微生物信息对农业、环保和油气勘探等领域有重要意义。

[0003] 其中，油气微生物勘探技术的微生物学基础是细菌对不同营养源异常高的适应性及广泛分布。通过测量烃类氧化菌的生物化学特性以及群体分布出现特征，来进行油气微生物勘探。烃氧化菌是一类能够代谢利用烃类的微生物的总称。研究表明，常见的烃氧化菌有链霉菌、假单胞菌、红球菌和糖丝菌等。这种微生物只要是在有持续轻烃气流的地方就可以利用极低的轻烃气聚集，而且仅在含烃构造之上地表之下富集。采用合适的微生物技术，检测出微生物异常，就可以精确预测下伏油气藏的存在及其油气藏的性质。

[0004] 然而，在油气微生物勘探中对烃氧化菌进行研究时，采用上述冷冻或低温法对土壤样品预处理，该方法存在以下问题：

[0005] 1)对温度要求严格。冷冻或低温保存必须保证样品从采集到运输的全程均需要严格的低温过程，而在野外施工中常常难以保证低温。

[0006] 2)运输困难。使用冰箱、液氮、冰袋或者干冰等方法保存的冷冻或者低温样品，从野外运输到实验室的过程实现起来比较困难，成本高，样品升温的风险大。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本申请提供一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法，本申请提供的预处理方法简单、有效，成本低，可用于油气微生物勘探烃氧化菌检测，尤其便于土壤样品长时间长途运输。

[0008] 本发明提供一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法，包括以下步骤：

[0009] 1)将在野外采集的土壤置于开口透气容器中，密封容器开口；

[0010] 2)对步骤1)密封后的透气容器进行恒温鼓风，使其中的土壤干燥。

[0011] 优选地，所述恒温鼓风的温度为25～50℃。

[0012] 优选地，所述恒温鼓风的温度为30～38℃。

[0013] 优选地，所述恒温鼓风的时间为1～72小时。

[0014] 优选地，所述恒温鼓风的时间为3～24小时。

[0015] 优选地，所述开口透气容器为牛皮纸袋。

[0016] 优选地，所述恒温鼓风的方式为单独鼓风单独恒温或者恒温和鼓风同时使用。

[0017] 优选地，还包括：

[0018] 3)将步骤2)干燥后的样品常温保存。

[0019] 干燥脱水属于微生物保存保藏方法，如沙土管保藏法。沙土管保藏法适用于产孢子类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属及少数酵母，保藏时间约为2-10年不等。但是，沙土管保藏法应用于营养细胞则效果不佳。由于干燥脱水处理会使得一部分微生物死亡，且对于营养细胞的保存效果不佳，所以还没有用于土壤微生物学研究，特别是油气微生物勘探中对于烃氧化菌的研究中作为样品预处理的一种方法。

[0020] 与现有技术相比，本发明将在野外采集的土壤置于开口透气容器中，密封容器开口；然后对密封后的透气容器进行恒温鼓风，使其中的土壤干燥；将干燥后的样品常温保存。试验结果显示，使用本发明所述方法预处理之后的土壤进行烃氧化菌的检测，其结果和常规冷冻方法的结果类似。本发明干燥之后的土壤经过两周的常温放置，之后再进行检测，其结果和刚刚干燥的样品类似。以上结果说明，本发明所述方法作为常规冷冻保存的替代方法，在油气微生物勘探中对烃氧化菌的研究中，具有较高的适用性。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例1两种土壤预处理方法的检测结果对比图；

[0022] 图2为本发明实施例2两种土壤预处理方法的检测结果对比图；

[0023] 图3为本发明实施例3中样品1～16不同干燥时间处理后的检测结果对比图；

[0024] 图4为本发明实施例4样品1～16不同温度处理后的检测结果对比图。

具体实施方式

[0025] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0026] 本发明提供了一种用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法，包括以下步骤：

[0027] 1)将在野外采集的土壤置于开口透气容器中，密封容器开口；

[0028] 2)对步骤1)密封后的透气容器进行恒温鼓风，使其中的土壤干燥。

[0029] 本发明的目的是克服土壤样品冷冻保存的弊端，为土壤样品长时间长途运输提供一种简便的、新的预处理方法，在油气微生物勘探烃氧化菌研究中具有实际作用和效果。

[0030] 本发明实施例根据实际勘探情况，在野外采集地表的土壤，将其放入牛皮纸袋等非密封袋子中，并密封好，以防泄漏。

[0031] 在本申请实施例中，采集土壤样品的环境区域一般是要开展油气微生物勘探工作的地区或工作区域；在野外所采集的土壤中含有一定数量的烃氧化菌等。另外，本申请土壤预处理方法也适用于农田、森林、戈壁等含水土壤的预处理。

[0032] 在本申请的一些实施例中，所涉及区域是青藏高原的一块高海拔戈壁区，该地区属于永久冻土带，地表有少许植被。本申请实施例要在该地区开展油气微生物勘探工作，需要布设测线或者测网，采集地表的土壤。在本申请的另一些实施例中，所涉及区域是松辽盆地东部平原区，该地区属于高纬度寒冷区，地表为农田，种植水稻。本申请实施例要在该地区开展油气微生物勘探工作，需要布设测线或者测网，采集地表的土壤。

[0033] 本申请对土壤样品的采集方法没有特殊限制，采用本领域常规的采集方式即可。在本申请的实施例中，土壤样品采集间距可为250m，采集深度为20cm。本申请实施例可以采集8～20个样品进行预处理，每个样品质量为20g～30g。本申请可以将在野外采集的土壤直接预处理，也可以将其在密封塑料容器中冷冻保存后再预处理。

[0034] 本申请所用的透气容器是通气且开口的非密封容器，至少水蒸汽能够通过，比如采用有开口的牛皮纸袋这样的非密封袋。然后，本申请实施例将装好土壤的袋子封口密封，防止样品泄漏。

[0035] 本申请实施例将上述密封的装好土壤的透气容器放在带有鼓风和恒温功能的设备中，进行恒温鼓风，处理到其中的土壤干燥。

[0036] 本发明主要利用恒温和鼓风两个措施，使土壤脱水干燥。在本发明中，这样的干燥脱水处理会使得土壤样品烃氧化菌中的假单胞菌等部分革兰氏阴性菌和营养细胞死亡，但对土壤样品烃氧化菌之中的链霉菌等革兰氏阳性菌和一些产孢子的烃氧化菌影响不大。申请人意外地发现，本申请脱水处理虽然会使得部分烃氧化菌死亡，但是对休眠存活下来的烃氧化菌进行检测并统计研究，然后据此结果进行各种地质学研究，可以达到和冷冻低温样品处理相类似的结果。

[0037] 在本申请的实施例中，所述恒温鼓风的温度为25～50℃，优选为30～38℃。在本申请的实施例中，所述恒温鼓风的时间为1～72小时，如8小时、12小时、24小时、48小时等；本发明所述恒温鼓风的时间优选为3～24小时，更优选为8小时～12小时。本申请恒温鼓风处理的时间主要根据土壤的潮湿程度不同而变化，从沙漠土处理1小时到雨后土壤处理72小时都有可能。为了在野外操作方便和考虑处理效果等方面，可以恒温鼓风处理过夜，也就是优选处理12小时左右。

[0038] 本申请实施例所述带有鼓风和恒温功能的设备可以为鼓风烘箱，此时，恒温鼓风处理的干燥方式可称为烘干。所述恒温鼓风的方式可以为单独鼓风、单独恒温，或者恒温和鼓风同时使用。其中，视鼓风烘箱的大小，鼓风量可为10-500m3/h，循环次数为100-1000次/h。

[0039] 本申请实施例在鼓风烘箱进行烘干处理之后，进行后续烃氧化菌的检测。其中，烃氧化菌的检测方法参照U.S.patent  3880142(Hitzman,1959)Hitzman,D.O.,1959.Prospecting forpetroleum deposits(detecting hydrocarbonconsuming bacteria colonies by artificial hydrocarbon nutrient culturing).U.S.Patent,3,
880,142,assigned to Phillips Petroleum Co.平板计数的结果直接记为该样品的微生物值。

[0040] 试验结果显示，使用本发明所述方法预处理之后的土壤进行烃氧化菌的检测，其结果和常规冷冻方法的结果类似。

[0041] 本申请一些实施例还包括：将上述干燥后的土壤样品常温保存。其中，所述的常温可称为室温，一般为本领域熟知的20～30℃；保存的时间可以在两周之内。本发明干燥之后的土壤经过两周的常温放置，之后再进行检测，其结果和刚刚干燥的样品类似。以上结果说明，本发明所述方法作为常规冷冻保存的替代方法，对于油气微生物勘探中对烃氧化菌的研究，具有较高的适用性。

[0042] 综上所述，本发明实施例将在野外采集的土壤放入牛皮纸袋等非密封袋子中，并密封好；将装好土壤的袋子放在带鼓风和恒温功能的箱子中，鼓风恒温处理到土壤干燥；处理干燥之后的样品常温保存。本发明所述方法通过对土壤进行脱水干燥处理，使一部分微生物死亡，另一部分微生物进入休眠状态，并在常温下保存与运输样品，其处理后的样品仍然适合于进行油气微生物勘探中的烃氧化菌检测。

[0043] 因此，本申请提供的预处理方法简单、有效，成本低，可用于油气微生物勘探，尤其便于土壤样品长时间长途运输。此外，该土壤预处理方法适用于农田、森林、戈壁等含水土壤的预处理。

[0044] 为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本发明提供的用于油气微生物勘探烃氧化菌检测的土壤样品的预处理方法进行具体地描述。

[0045] 实施例1

[0046] 所涉及区域是青藏高原的一块高海拔戈壁区，该地区属于永久冻土带，地表有少许植被。要在该地区开展油气微生物勘探工作，需要布设测线或者测网，采集地表的土壤。常规冷冻土壤预处理和运输方法需要准备冰箱，冰袋等控温设备，耗时且难以运输，且在高海拔地区难以实现样品的快速冷冻。

[0047] 本发明所述土壤样品预处理的具体实施步骤如下：

[0048] 1根据实际勘探情况，在工作区选取已布设的测线，采集20个样品，样品采集间距为250m，采集深度为20cm。

[0049] 2每个采样点按照常规方法采集，放置于密封塑料袋中，并立即使用冷冻保存，所有样品迅速运送回实验室。冷冻的条件和操作是：野外采集土壤后放入装有冷冻冰袋的保温箱，到营地后使用冰柜-20℃冷冻，运输使用带冷冻冰袋的保温箱，并保证到达实验室时保持冷冻状态，到达实验室后-20℃冰柜保存。

[0050] 3实验室内将冷冻的土壤样品分成两份，取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好后放置在30℃的鼓风烘箱内，进行烘干8h处理，鼓风参数为25m3/h，循环次数为400次/h，得到干燥样品(简称干样)，之后进行后续烃氧化菌的检测。另取一份冷冻的样品，称为湿样，其土壤样品不经过任何处理就进行后续烃氧化菌的检测。本实施例使用的冷冻样品为25g，干燥样品为将25g冷冻样品烘干后的样品。

[0051] 4将上述两种方法检测得到的结果制作成折线图对比，结果如图1所示，图1为本发明实施例1两种土壤预处理方法的检测结果对比图。从图1的整体上看，这两种土壤预处理方法之后，样品所培养出来的烃氧化菌数量相当。

[0052] 实施例2

[0053] 1所涉及工作区域与实施例1相同。根据实际勘探情况，在工作区选取已布设的测线，采集8个样品，样品采集间距为250m，采集深度为20cm。

[0054] 2每个采样点按照常规方法采集，放置于密封塑料袋中，并立即使用与实施例1中相同的方式冷冻保存，所有样品迅速运送回实验室。

[0055] 3实验室内将样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好后放置在30℃的鼓风烘箱内，进行烘干8h处理。之后将样品分成两份，一份称为烘干样品，立即进行后续烃氧化菌的检测；另一份在常温下放置储存，两周之后再进行烃氧化菌的检测。

[0056] 4将上述两种方法检测得到的结果制作成折线图对比，结果如图2所示，图2为本发明实施例2两种土壤预处理方法的检测结果对比图。

[0057] 从图2的整体上看，土壤鼓风干燥处理后立即进行烃氧化菌检测，和处理后室温放置两周再进行检测，检测得到所培养出来的烃氧化菌数量相当。可见，本申请恒温鼓风脱水处理之后的土壤样品能够进行长时间的常温保存，本申请所述方法的适用性高。

[0058] 实施例3

[0059] 所涉及区域是松辽盆地东部平原区，该地区属于高纬度寒冷区，地表为农田，种植水稻。要在该地区开展油气微生物勘探工作，需要布设测线或者测网，采集地表的土壤。常规冷冻土壤预处理和运输方法需要准备冰箱，冰袋等控温设备，耗时且难以运输。

[0060] 为了比较不同烘干时间对于烃氧化菌计数结果的影响，进行以下试验：

[0061] 1根据实际勘探情况，在工作区选取已知油气田，设计通过油气田的测线，采集16个样品，编号为1-16，其中5-10号样品位于油田上方，样品采集间距为250m，采集深度为20cm。

[0062] 2每个采样点按照常规方法采集，放置于密封塑料袋中，并立即使用与实施例1中相同的方式冷冻保存，所有样品迅速运送回实验室。

[0063] 3实验室内将冷冻的土壤样品分成五份，取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在38℃的鼓风烘箱内进行烘干12h处理；取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在38℃的鼓风烘箱内进行烘干24h处理；取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在38℃的鼓风烘箱内进行烘干48h处理；取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在38℃的鼓风烘箱内进行烘干72h处理，之后进行后续烃氧化菌的检测。另取一份冷冻的样品，即不烘干的样品，其土壤样品不经过任何处理就进行后续烃氧化菌的检测。

[0064] 4将五种方法检测得到的结果制作成折线图对比，结果如图3所示，图3为本发明实施例3中样品1～16不同干燥时间处理后的检测结果对比图。

[0065] 从图3可以看到，不同烘干时间对于最后检测得到的烃氧化菌数量影响不大。5-10号样品呈现高值，与其下方赋存油气藏相符。

[0066] 实施例4

[0067] 所涉及研究区域与实施例3相同。为了比较不同烘干温度对于烃氧化菌计数结果的影响，进行以下试验：

[0068] 1根据实际勘探情况，在工作区选取已知油气田，设计通过油气田的测线，采集16个样品，编号为1-16，其中5-10号样品位于油田上方，样品采集间距为250m，采集深度为20cm。采集的样品与实施例3相同。

[0069] 2每个采样点按照常规方法采集，放置于密封塑料袋中，并立即使用与实施例1中相同的方式冷冻保存，所有样品迅速运送回实验室。

[0070] 3实验室内将冷冻的土壤样品分成五份，取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在20℃的鼓风烘箱内进行烘干72h处理；取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在30℃的鼓风烘箱内进行烘干72h处理；取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在40℃的鼓风烘箱内进行烘干72h处理；取一份样品从密封的塑料袋中转移放置到牛皮纸袋中，密封好之后放置在50℃的鼓风烘箱内进行烘干72h处理，之后进行后续烃氧化菌的检测。另取一份冷冻的样品，即不烘干的样品，其土壤样品不经过任何处理就进行后续烃氧化菌的检测。

[0071] 4将上述五种方法检测得到的结果制作成折线图对比，结果如图4所示，图4为本发明实施例4样品1～16不同温度处理后的检测结果对比图。

[0072] 从图4可以看到，50℃处理之后微生物值比其他温度处理低；除了50℃烘干以外，不同烘干温度对于最后检测得到的烃氧化菌数量影响不大。且所有处理温度的5-10号样品呈现相对高值，与其下方赋存油气藏相符。

[0073] 由以上实施例可知，使用本发明所述方法预处理之后的土壤进行烃氧化菌的检测，其结果和常规冷冻方法的结果类似。本发明干燥之后的土壤经过两周的常温放置，之后再进行检测，其结果和刚刚干燥的样品类似。本发明为土壤样品长时间长途运输提供了一种简便的、新的预处理方法，克服了土壤样品冷冻保存的弊端，在油气微生物勘探烃氧化菌研究中具有实际作用和效果，且适用性高。

[0074] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。