长链非编码RNA HERC2P3基因及其在胃癌中的用途

摘要

本发明公开了长链非编码RNA HERC2P3基因在胃癌诊断和治疗中的应用。具体地，本发明证实LncRNA‑HERC2P3基因在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且通过沉默LncRNA‑HERC2P3基因可以显著抑制胃癌细胞的生长，因此LncRNA‑HERC2P3基因及其表达产物可作为诊断胃癌的标志物和用于胃癌治疗的药物靶点，使胃癌诊断更加准确、快速。因此，本发明LncRNA‑HERC2P3基因及其用途为防治胃癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

权利要求

1.一种分离的lncRNA-HERC2P3的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备诊断胃癌的芯片、试剂或试剂盒；所述的lncRNA-HERC2P3选自：(a)如SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)与SEQ ID NO:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3；

所述lncRNA-HERC2P3的检测试剂包括特异性扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对，所述特异性扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对为SEQ ID NO:2-3所示的序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的lncRNA-HERC2P3分离自人或非人哺乳动物的血液和/或组织。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血液为血浆和/或血清。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血液不包括血细胞。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的组织包括肿瘤组织。

6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的lncRNA-HERC2P3分离自人。

7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的组织为胃癌组织。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有lncRNA-HERC2P3的检测试剂，和使用说明书，其中，所述的lncRNA-HERC2P3选自：

(a)如SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)与SEQ ID NO:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3；

所述lncRNA-HERC2P3的检测试剂包括特异性扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对，所述特异性扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对为SEQ ID NO:2-3所示的序列。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有lncRNA-HERC2P3作为阳性对照。

10.一种分离的lncRNA-HERC2P3的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂在体外和/或体内特异性抑制lncRNA-HERC2P3的表达和/或活性；

其中，所述的lncRNA-HERC2P3选自：

(a)如SEQ ID NO:1所示的序列；

(b)与SEQ ID NO:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3；

所述抑制剂为如SEQ ID NO:4-5或SEQ ID NO:6-7所示的siRNA。

11.权利要求10所述lncRNA-HERC2P3的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗胃癌和/或胃癌转移的药物组合物。

12.一种治疗胃癌和/或胃癌转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求10所述lncRNA-HERC2P3的抑制剂和药学上可接受的载体。

13.一种体外非治疗性抑制胃癌细胞生长和/或迁移的方法，其特征在于，在权利要求

10所述的抑制剂，和/或权利要求12所述的药物组合物的存在下培养胃癌细胞，从而抑制胃癌细胞生长和/或迁移。

说明书

长链非编码RNA HERC2P3基因及其在胃癌中的用途

技术领域

[0001] 本发明属于基因治疗和诊断技术领域，特别是涉及一种长链非编码RNA基因及其表达产物在胃癌的诊断和治疗中的应用。

背景技术

[0002] 我国是胃癌高发国家，其发病率和死亡率分别高居全部恶性肿瘤的第3位和第2位。2008年我国新发胃癌46.3万，占全世界的46.8％；同年全世界死亡胃癌患者约73.7万，其中我国死亡35.2万，占全世界的47.8％。胃部肿瘤很少在临床前期被发现或确诊，特别是在我国，超过80％的胃癌在确诊时就已处于进展期从而导致预后普遍较差。胃镜是早期胃癌的主要筛查手段，但胃镜检查价格较贵，同时也给患者带来不少痛苦，目前全世界仅日本实施无症状人群筛查。为了克服这一困难，目前已有很多生物标记物广泛应用于胃部肿瘤的诊断，其中主要包括癌基因，抑癌基因，DNA修复相关基因以及与细胞周期和细胞粘附相关的调节基因及其表达产物。但这些生物标志物对于早期胃癌诊断的灵敏度和特异性都不高。因此，发现灵敏度和特异性更高的新的肿瘤标志物，是提高胃癌早期诊断水平的关键。

[0003] 近年来，随着人类ENCODE计划的完成，人们发现非编码RNA在细胞生命活动中发挥着重要功能。非编码RNA是一类不编码蛋白质但具有功能的RNA分子，依据其长度可以分为两大类：短片段非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA等)和长片段非编码RNA(LncRNA)。miRNAs是短片段非编码RNA中研究较多的一类，它们是一种大小约22个碱基的非编码单链小分子RNA,通过与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合，导致靶基因mRNA的降解或转录抑制，在转录后水平调控基因的表达。LncRNA指长度大于200nt的RNA，位于细胞核内或胞浆内，大多数具有保守的二级结构、剪切形式以及亚细胞定位。LncRNA广泛存在并调节细胞内的信号传导系统，能够在多个层面调控基因的表达水平，目前已知的作用机制包括染色质修饰、转录调节、转录后调节(如前体mRNA加工)等。

[0004] LncRNA与癌症的发生发展同样存在密切的关系，像miRNA一样，lncRNA在疾病诊断和治疗上也代表了另一个重要的分子来源。目前的研究表明，lncRNA表达水平上的差异或某些癌症类型特异型lncRNA的表达，可作为肿瘤诊断和治疗的新分子标志物。

[0005] 因此，本领域迫切需要找到更多LncRNA与胃癌之间的联系，从而开发新的诊断和/或治疗胃癌的方法。

发明内容

[0006] 本发明人提供了一种LncRNA-HERC2P3在胃癌诊断和治疗中的用途。

[0007] 本发明第一方面，提供一种分离的lncRNA-HERC2P3或其检测试剂的用途，用于制备诊断胃癌的芯片、试剂或试剂盒；所述的lncRNA-HERC2P3选自：

[0008] (a)如SEQ ID NO.:1所示的序列；

[0009] (b)与SEQ ID NO.:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3。

[0010] 在另一优选例中，所述的lncRNA-HERC2P3分离自人或非人哺乳动物的血液和/或组织。

[0011] 在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。

[0012] 在另一优选例中，所述的血液不包括血细胞。

[0013] 在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。

[0014] 在另一优选例中，所述的组织包括肿瘤组织，尤其是胃癌组织。

[0015] 在另一优选例中，所述的lncRNA-HERC2P3分离自人。

[0016] 在另一优选例中，所述芯片包括：

[0017] 固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1所示的序列。

[0018] 本发明第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有lncRNA-HERC2P3的检测试剂，和使用说明书，

[0019] 其中，所述的lncRNA-HERC2P3选自：

[0020] (a)如SEQ ID NO.:1所示的序列；

[0021] (b)与SEQ ID NO.:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3。

[0022] 在另一优选例中，所述试剂盒中还含有lncRNA-HERC2P3作为阳性对照。

[0023] 在另一优选例中，所述lncRNA-HERC2P3的检测试剂包括特异性扩增SEQ ID NO.:1所示序列的引物对、探针、芯片。

[0024] 在另一优选例中，所述特异性扩增SEQ ID NO.:1所示序列的引物对包括SEQ ID NO.:2-3所示的序列。

[0025] 本发明第三方面，提供了一种分离的lncRNA-HERC2P3的抑制剂，所述抑制剂在体外和/或体内特异性抑制lncRNA-HERC2P3的表达和/或活性；

[0026] 其中，所述的lncRNA-HERC2P3选自：

[0027] (a)如SEQ ID NO.:1所示的序列；

[0028] (b)与SEQ ID NO.:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3。

[0029] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括SEQ ID NO.:1所示序列的反义核酸、siRNA、miRNA、shRNA。

[0030] 在另一优选例中，所述的siRNA如SEQ ID NO.:4-5或SEQ ID NO.:6-7所示。

[0031] 在另一优选例中，所述的shRNA如SEQ ID NO.:8-9所示。

[0032] 本发明第四方面，提供了本发明第三方面所述lncRNA-HERC2P3的抑制剂的用途，用于制备治疗胃癌和/或胃癌转移的药物组合物。

[0033] 在另一优选例中，所述的药物组合物含有lncRNA-HERC2P3的抑制剂和药学上可接受的载体。

[0034] 本发明第五方面，提供了一种治疗胃癌和/或胃癌转移的药物组合物，所述药物组合物含有本发明第三方面所述lncRNA-HERC2P3的抑制剂和药学上可接受的载体。

[0035] 本发明第六方面，提供了一种筛选治疗胃癌和/或胃癌转移药物候选化合物的方法，所述方法包括：

[0036] 在测试组中，向胃癌细胞培养体系中，加入所述候选化合物，并测定如SEQ ID NO.:1所示序列的表达和/或活性E1；在对照组中，向胃癌细胞培养体系中，不加入所述候选化合物，并测定如SEQ ID NO.:1所示序列的表达和/或活性E0；

[0037] 其中，当E1显著高于E0时，则表明所述的候选化合物是能够治疗胃癌和/或胃癌转移的药物。

[0038] 在另一优选例中，所述的显著高于是指E1/E0≥1.5，优选地E1/E0≥2。

[0039] 在另一优选例中，所述方法还包括将步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对胃癌细胞的生长和/或迁移的作用。

[0040] 本发明第七方面，听了一种体外非治疗性抑制胃癌细胞生长和/或迁移的 方法，在本发明第三方面所述的抑制剂，和/或本发明第五方面所述的药物组合物的存在下培养胃癌细胞，从而抑制胃癌细胞生长和/或迁移。

[0041] 本发明第八方面，提供了一种诊断胃癌和/或胃癌转移的方法，检测所需对象来源的样本中，lncRNA-HERC2P3的表达和/或活性，当所述样本中所述lncRNA-HERC2P3的表达和/或活性显著高于对照，则表明所述对象可能患有胃癌和/或胃癌转移；

[0042] 其中，所述的lncRNA-HERC2P3选自：

[0043] (a)如SEQ ID NO.:1所示的序列；

[0044] (b)与SEQ ID NO.:1所示序列互补的lncRNA-HERC2P3。。

[0045] 本发明第九方面，提供了一种治疗胃癌和/或胃癌转移的方法，包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的本发明第三方面所述的抑制剂和/或本发明第五方面所述的药物组合物。

[0046] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0047] 图1A显示了实施例1中，qPCR结果显示沉默LncRNA-HERC2P3基因后的胃癌细胞的LncRNA-HERC2P3的表达量明显减少。

[0048] 图1B显示了实施例1中，靶向LncRNA-HERC2P3的siRNA组胃癌细胞的生长增殖能力相比阴性对照组明显减弱。

[0049] 图2A显示了实施例2中，细胞侵袭实验定性地表明了沉默LncRNA-HERC2P3基因的胃癌细胞的侵袭能力明显减弱。

[0050] 图2B显示了实施例2中沉默LncRNA-HERC2P3基因的实验组比对照组细胞数明显减少。

[0051] 图3A显示了实施例3中白光和荧光显微镜下(×100)shHERC2P3组和shNC组的转染效率情况，在SGC-7901胃癌细胞中成功转染了敲除LncRNA-HERC2P3基因的慢病毒载体。

[0052] 图3B显示了实施例3中shHERC2P3组对比shNC组，LncRNA-HERC2P3基因的表达明显减少。

[0053] 图4A显示了沉默的LncRNA-HERC2P3基因抑制胃癌细胞SGC-7901在裸鼠皮下形成肿瘤的能力。无论在体积和肿瘤重量上LncRNA-HERC2P3沉默组都比对照组小和轻，同时两组具有统计学意义。

[0054] 图4B显示了shHERC2P3组小鼠肺的可见肿瘤数相对于对照组明显减少。

[0055] 图5显示了实施例5中实时定量PCR检测LncRNA-HERC2P3基因在30例胃癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，其中，“N”指癌旁组织，“C”指胃癌组织。结果显示13例(43.3％)病人的癌组织中LncRNA-HERC2P3基因表达量高于相应的癌旁组织。

具体实施方式

[0056] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一个与胃癌发病及转移密切相关的长链非编码RNA，HERC2P3，其在胃癌组织中高表达，而在癌旁组织及正常组织中高表达，因此可作为辅助胃癌或其转移的检测标志物。此外，本发明人进一步通过实验表明，抑制该lncRNA，可以非常有效地抑制胃癌或其转移，从而用于胃癌治疗的药物靶点。

[0057] 非编码RNA(Non-coding RNAs)

[0058] 如本文所用，术语“非编码RNA”是指不编码蛋白质的RNA。在人类基因组中，大部分为非编码RNA。人类基因组中仅有2％产生的转录本是可编码RNA，剩余98％均为非编码RNA，它们是不能翻译成蛋白质的功能性RNA分子。这些非编码RNA广泛参与人体生理、病理活动，与众多肿瘤密切相关。

[0059] 在非编码RNA中，根据大小的不同，具有调控作用的分子主要分为两类：短链非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)。这些ncRNA广泛参与人体几乎所有的生理、病理活动，包括参与、调控或介导众多肿瘤的发生、发展过程。

[0060] 长链非编码RNA(LncRNA)

[0061] 如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。

[0062] 在人类基因组序列中，4％～9％产生的转录本是长链非编码RNA(lncRNA)， 其中许多lncRNA仅在特定的发育阶段出现，具有组织或细胞特异性，lncRNA能够通过多种方式在不同层面上调节与之相关的蛋白编码基因，参与诱导疾病的发生。

[0063] 本发明提供了一种从血液和/或组织中分离的长链非编码RNA。

[0064] 如本文所用，术语“血液”可以为血浆、血清，但不包括血细胞。

[0065] 如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

[0066] LncRNA可从前体LncRNA加工而来，前体LncRNA可被剪切生成成熟的LncRNA，所述成熟的LncRNA可能与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。

[0067] 如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

[0068] 如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

[0069] 本发明lncRNA具有如SEQ ID NO.:1所示的序列。

[0070] 长链非编码RNA HERC2P3基因

[0071] 如本文所用，术语“lncRNA-HERC2P3”、“长链非编码RNA HERC2P3基因”“本发明长链RNA”、或“本发明lncRNA”均可互换使用，指的是如SEQ ID NO.:1所示序列或其互补序列代表的HERC2假基因3，不编码蛋白。HERC2是具有HECT和RLD结构域的巨大蛋白，具有E3泛素连接酶活性。已发现其突变与自闭症相关，且至今无与肿瘤相关性报道。该基因有多个假基因序列，HERC2P3就是其中之一。HERC2P3的功能至今未见报道。

[0072] 反义寡核苷酸

[0073] 如本文所用，术语“反义寡核苷酸”、“antisense-oligonucleotides”、“AS-Ons”、或“ASO”含义相同。根据本发明所提供的LncRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的LncRNA的量或LncRNA的表达。

[0074] 在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。

[0075] 将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人或非人哺乳动物体内后，它们能够明显下调相关LncRNA的表达。

[0076] 多核苷酸构建物

[0077] 根据本发明所提供的人LncRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的LncRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的LncRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成LncRNA。

[0078] 作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

[0079] Seq正向-X-Seq反向   式I，

[0080] 式I中，

[0081] Seq正向为可在细胞中表达成所述的LncRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq 正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的LncRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；

[0082] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；

[0083] 式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

[0084] 式II，

[0085] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；

[0086] ||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

[0087] 通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的LncRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

[0088] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

[0089] 芯片

[0090] LncRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种RNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种RNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的RNA的转录水平进行检测。

[0091] 利用本发明所述的LncRNA序列，还可以制备相应的LncRNA芯片，进而研究其表达谱以及LncRNA的调节方式。

[0092] 在另一方面，本发明还提供一种用于分析LncRNA表达谱的芯片。本发明的所述的LncRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1所示的序列，此外，本发明lncRNA芯片还可含有针对其它已知的胃癌相关标记物的探针。

[0093] 具体地，可根据本发明所述的LncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

[0094] 所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

[0095] 所述的LncRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

[0096] 检测试剂盒

[0097] 本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测血液中所述LncRNA的表达。

[0098] 优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

[0099] 此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

[0100] 此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

[0101] LncRNA抑制剂

[0102] 如本文所用，术语“本发明的活性成分”、“本发明的抑制剂”、“LncRNA抑制剂”可互换使用，都指能够抑制或降低LNCRNA表达或活性的物质。

[0103] 代表性的lncRNA抑制剂包括反义核酸、小分子化合物、miRNA、shRNA、或siRNA等。

[0104] 获得了本发明lncRNA的靶点之后，可通过本发明常规技术制备和/或筛选lncRNA的抑制剂。筛选本发明lncRNA抑制剂的候选范围可以包括任何现有技术中已知常用的数据库，如化合物数据库等。

[0105] 一种优选的本发明lncRNA抑制剂为SEQ ID NO.:1所示序列的siRNA或shRNA，较佳地，所述的siRNA如SEQ ID NO.:4-5或SEQ ID NO.:6-7所示；所述的shRNA如SEQ ID NO.:8-9所示。

[0106] 药物组合物

[0107] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的LNCRNA抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的LNCRNA抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。

[0108] 使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明LNCRNA抑制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

[0109] 本发明有益效果

[0110] 本发明实验证实LncRNA-HERC2P3基因在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且通过沉默LncRNA-HERC2P3基因可以显著抑制胃癌细胞的生长，因此LncRNA-HERC2P3基因及其表达产物可作为诊断胃癌的标志物和用于胃癌治疗的药物靶点，使胃癌诊断更加准确、快速。总之，本发明LncRNA-HERC2P3基因及其用途为防治胃癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

[0111] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring  Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

[0112] 通用方法：

[0113] (1)临床组织样本的获取

[0114] 胃癌及癌旁组织取自手术治疗的胃癌患者，在获取样本前均与患者签订了知情同意书。手术切除的胃癌组织一经离体，迅速切取肿瘤原发灶及周围5cm以外的癌旁组织，投入液氮中速冻并移至－80℃冰箱保存，运输时储存于液氮中。癌与癌旁组织均通过病理专家做出最终诊断。样本依据Edmondson分级标准分为I-III级。

[0115] (2)组织及细胞RNA抽提

[0116] 采用TRIzol Reagent(Invitrogen)试剂抽提RNA，具体操作如下：

[0117] 1)研钵、碾杵和匀浆器等器皿洗净，分别再用ddH2O和DEPC H2O冲洗，然后在180℃烘箱中烘约4小时，以去除RNA酶；

[0118] 2)在研钵中加入适量液氮使之预冷，将组织从液氮中迅速取出，切取约50-100mg大小，在研钵中研磨成粉末；

[0119] 3)用刮匙将研磨好的组织粉末尽可能完全的移至无RNA酶的EP管中，EP管被预先加入适量体积(1ml)TRIzol试剂，充分匀浆；

[0120] 4)室温放置5分钟，按比例向离心管中加入氯仿(200μl/1ml TRIzol)，迅速剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟，4℃，12000×g条件下离心15分钟；

[0121] 5)将上层水相尽可能地转移至新的无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀5次，室温静置10分钟，4℃，12000×g条件下离心10分钟，此时可见RNA沉淀；

[0122] 6)将上清倒掉，加入75％乙醇(1ml/1ml TRIzol)，混匀，洗涤RNA，离心4℃，7500×g条件下离心5分钟；

[0123] 7)弃上清，尽可能除尽残留乙醇，沉淀自然干燥5-10min(注意切勿完全干燥)；加入30-50μl DEPC H2O，吹吸几次，溶解RNA沉淀；

[0124] 8)酶标仪测定RNA浓度及纯度OD 260/280(1.8-2.0)；凝胶电泳观察有无降解，－80℃保存。

[0125] 细胞株RNA抽提，取对数生长期的细胞，吸取培养液，根据培养皿的面积加入相应量的TRIzol试剂(1ml TRIzol/10cm2)裂解细胞，吹打几次，将裂解下来的细胞收集至无RNA酶的EP管中，其余按照上述步骤4)-8)完成氯仿 -异丙醇法分离纯化RNA。

[0126] (3)RNA的逆转录

[0127] 用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)逆转录，操作如下：

[0128] 1)在无核酸酶的EP管中加入以下组分：

[0129]

[0130] 置于PCR仪中，70℃，5分钟，然后立即在冰上冷却5min。

[0131] 2)在上述体系中再加入以下组分：

[0132]

[0133] 轻轻混匀后，置于PCR仪中，37℃，60min。

[0134] 逆转得到的cDNA置于4℃保存。

[0135] (4)实时定量PCR

[0136] 实时定量PCR反应使用 Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd.Dalian,China)的反应体系，利用Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TP800实时荧光定量PCR仪，TaKaRa)进行操作。定量PCR的扩增产物长度以80bp-150bp最为合适(可以延长至300bp)。

[0137] 反应体系如下：

[0138]

[0139]

[0140] 溶解曲线分析步骤：

[0141] 95℃                 15sec

[0142] 60℃                 30sec

[0143] 95℃                 15sec

[0144] 解离时间为4sec。

[0145] 荧光本底信号和阈值采用仪器设置的默认值，每次PCR反应结束后会自动生成，Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定阈值(基线荧光强度的10倍)时所经历的循环数；目的基因HERC2P3每个模板做3个复管，得到的Ct值取平均值；HERC2P3基因的Ct平均值减去相应模板的内参基因(β-actin)的Ct平均值，得到ΔCt。胃癌组的ΔCt减去相应癌旁组织的ΔCt，得到ΔΔCt值，胃癌组和癌旁组中的HERC2P3基因的倍数关系用2-ΔΔCt表示。

[0146] (5)细胞生长曲线的测定

[0147] 1)将不同种类的HCC细胞根据其生长特性按3-5×103/100μl/孔计算细胞总量，充分消化细胞后，稀释到所需浓度，接种于96孔板内。每天每组三复孔，按5-7天接种细胞；

[0148] 2)待细胞基本贴壁后观察细胞状态和数目。用CCK-8显色剂(Cell Counting Kit-8，DOJINDO，Japan)进行显色反应，每100μl培养液加10μl CCK-8，37℃，5％CO2培养箱放置孵育1h，酶标仪测定450nm处的吸光度，记录，确定细胞实际的起始密度，作为生长相对零点。

[0149] 3)每天或隔天半量换液，具体视实验要求而定；

[0150] 4)显微镜下观察细胞形态，固定时间间隔测量，记录细胞生长状况；

[0151] 5)一般测5至7天。待测定结束后，收集数据进行处理，用Excel绘出图表。

[0152] (6)细胞克隆形成实验

[0153] 1)转染：采用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)转染细胞，过表达或沉默细胞中HERC2P3基因的表达；

[0154] 2)转染后的细胞，于6孔板或35mm培养皿用正常培养液培养24h后消化计数，按一定数目接种至100mm培养皿(不同细胞株数目不同)，继续培养24h，然后依据细胞种类加入适当浓度的G418(600-1000μg/ml)，以筛选转染阳性的细胞克隆；

[0155] 3)培养2-3周，其间每隔3-5天更换新鲜培养液并加G418筛选，直至有肉眼可见的细胞克隆形成；

[0156] 4)吸去培养皿内的培液，1×PBS洗两次，考马斯亮蓝R-250染色2h，用水轻轻冲洗后，再用考马斯亮蓝染色脱色液脱色30-60min；

[0157] 5)克隆形成染色结果拍照，按照相同的标准(细胞克隆大小)对每个培养皿上的细胞克隆进行计数。

[0158] (7)裸鼠成瘤实验

[0159] 1)所用小鼠为5-6周大小的雄性BLAB/c nu裸鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养于南方模式动物培养中心；

[0160] 2)取处理后的细胞，以相同数量接种于小鼠皮下(不同细胞种类接种数目不同)，为避免个体差异导致的误差，同种细胞不同处理可左右对称接种于同一只小鼠；

[0161] 3)待出现可见肿瘤后，每3天监测肿瘤大小，游标卡尺读取肿瘤长径和短径，按以下公式计算肿瘤体积：体积＝0.5*长径x短径2；

[0162] 4)持续监测约7-8次后，整理数据，统计。

[0163] 实施例1：沉默LncRNA-HERC2P3的表达抑制胃癌细胞生长。

[0164] 为了进一步验证沉默LncRNA-HERC2P3对胃癌细胞的生长抑制功能，本发明人采取RNA干扰沉默其表达的方式检测细胞生长情况的变化。用于干扰LncRNA-HERC2P3表达的siRNA由上海吉码制药有限公司合成，序列为si-1：正义链5-CACCAAGACUUUAUGCGGAdTdT-3(SEQ ID NO.:4)；反义链5-UCCGCAUAAAGUCUUGGUGdTdT-3(SEQ ID NO.:5)。Si-2：正以链5-CUCAUCAACAAGUACAUCAdTdT-3(SEQ ID NO.:6)，反义链5-UGAUGUACUUGUUGAUGAGdTdT-3(SEQ ID  NO .:7)。作为干扰对照的NC非特异性核苷  酸序列为 ：正义链5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3(SEQ ID NO.:10)；反义链5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3(SEQ ID NO.:11)。经实时定量PCR检测表明，人工合成的干扰siRNA能够有效的下调LncRNA-HERC2P3的表达水平(图1A)，生长曲线实验也证明了LncRNA-HERC2P3的下调能够抑制胃癌细胞SGC-7901的生长(图1B)，有力的支持了靶向LncRNA-HERC2P3能够抑制肿瘤细胞生长的结论。

[0165] 实施例2：沉默LncRNA-HERC2P3的表达抑制胃癌细胞侵袭。

[0166] 为了进一步了解LncRNA-HERC2P3和胃癌细胞侵袭的关系，本发明人将靶向LncRNA-HERC2P3的siRNA转染至AGS和SGC-7901细胞，通过transwell实验验证转染细胞的侵袭能力。每个8小室加入3×104个细胞，48h后染色并观察计数。本发明人发现沉默LncRNA-HERC2P3基因的胃癌细胞的侵袭能力明显减弱(图2A)。细胞计数定量地表明了沉默LncRNA-HERC2P3基因的实验组比对照组细胞数明显减少(图2B)。

[0167] 实施例3：成功转染沉默LncRNA-HERC2P3的慢病毒载体至SGC-7901细胞。

[0168] 将沉默LncRNA-HERC2P3的慢病毒载体转染至SGC-7901细胞后，白光和荧光显微镜下的转染效率实验表明阳性对照和阴性对照组的细胞均转染良好(图3A)。qPCR结果进一步显示shHERC2P3组的LncRNA-HERC2P3表达量明显少于shNC组。

[0169] 实施例4：LncRNA-HERC2P3影响胃癌细胞在裸鼠的血运转移能力。

[0170] 体外实验已经明确表明Srrp35抑制胃癌细胞的生长和侵袭，接下来本发明人利用6
裸鼠模型来研究沉默LncRNA-HERC2P3对胃癌细胞裸鼠转移成瘤能力的影响。将1.5×10 个沉默LncRNA-HERC2P3的SGC-7901细胞和对照细胞对称注射入裸鼠尾静脉。6周后，杀死裸鼠取出肺组织称重。结果表明无论在单个瘤体的体积和重量上(图4A)，还是在肺组织的瘤体数目上(图4B)，沉默LncRNA-HERC2P3都有效抑制了SGC-7901细胞在裸鼠体内的转移成瘤能力。

[0171] 实施例5：胃癌组织样本中LncRNA-HERC2P3表达水平有明显上调的趋势。

[0172] 本发明人前期通过大量实验研究，发现LncRNA-HERC2P3在胃癌组织中明显上调。在30对临床样本中，通过实时定量PCR检测发现有13对样本胃癌组织中LncRNA-HERC2P3的表达明显高于相应的癌旁组织，上调率达到43.3％，统计学分 析表明p<0.01(图5)，说明结果的可靠性。实验中所用检测LncRNA-HERC2P3表达的实时定量PCR的引物序列为GCGATCAGGATAGGCCTCCT(SEQ ID NO.:2)和Seq2：GTTCGGCTTCAGAGTCGTCC(SEQ ID NO.:3)作为内参的β-actin的引物序列为CCTGGCACCCAGCACAATG(SEQ ID NO.:12)和Seq4：
GGGCCGGACTCGTCATACT(SEQ ID NO.:13)。

[0173] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。