一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用转让专利
申请号 : CN201710014165.8
文献号 : CN106701955B
文献日 : 2020-03-03
发明人 : 袁媛 , 蒋超 , 黄璐琦 , 赵玉洋
申请人 : 中国中医科学院中药研究所
摘要 :
本发明公开了一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用。本发明的引物组合，由序列1至6所示的6条单链DNA分子组成。本发明还保护所述引物组合在鉴别人参、西洋参和三七中的应用。本发明提供的检测方法对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1％，满足中药生产检验的需求。本发明可用于人参、西洋参、三七的根、根茎、叶、花、果实及其加工制品的鉴别。
权利要求 :
1.引物组合，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；
所述引物对Ⅰ由引物F1和引物F2组成；
所述引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；
所述引物F2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
所述引物对Ⅱ由引物F3和引物F4组成；
所述引物F3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物F4为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
所述引物对Ⅲ由引物F5和引物F6组成；
所述引物F5为序列表的序列5所示的单链DNA分子；
所述引物F6为序列表的序列6所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合的应用，为如下（b1）至（b6）中的任意一种：（b1）鉴别人参、三七和西洋参；
（b2）制备用于鉴别人参、三七和西洋参的试剂盒；
（b3）鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；
（b4）制备用于鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参的试剂盒；
（b5）鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参；
（b6）制备用于鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的试剂盒。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（c1）或（c2）或（c3）：（c1）鉴别人参、三七和西洋参；
（c2）鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；
（c3）鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.鉴别由单一原料加工的待测药材的原料为人参、三七还是西洋参的方法，为如下方法Ⅰ或方法Ⅱ；
所述方法Ⅰ包括如下步骤：提取待测药材基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有247bp的DNA片段、待测药材的原料为人参，如果扩增产物中含有492bp的DNA片段、待测药材的原料为三七，如果扩增产物中含有1088bp的DNA片段、待测药材的原料为西洋参；
所述方法Ⅱ包括如下步骤：检测待测药材基因组DNA中是否含有权利要求1所述的引物组合中的引物对Ⅰ的靶序列、引物对Ⅱ的靶序列或引物对Ⅲ的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅰ的靶序列、待测药材的原料为人参，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅱ的靶序列、待测药材的原料为三七，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅲ的靶序列、待测药材的原料为西洋参；
所述引物对Ⅰ的靶序列为序列表的序列7所示的DNA分子；
所述引物对Ⅱ的靶序列为序列表的序列8所示的DNA分子；
所述引物对Ⅲ的靶序列为序列表的序列9所示的DNA分子。
6.鉴定由单一原料加工的待测药材的原料是否为人参、三七或西洋参的方法，为如下方法Ⅲ或方法Ⅳ或方法Ⅴ；
所述方法Ⅲ包括如下步骤：提取待测药材的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，如果采用扩增产物中含有247bp的DNA片段、待测药材的原料为人参，如果扩增产物中含有492bp的DNA片段、待测药材的原料为三七，如果扩增产中含有1088bp的DNA片段、待测药材的原料为西洋参，如果扩增产物中不含有247bp的DNA片段、492bp的DNA片段或1088bp的DNA片段、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参；
所述方法Ⅳ包括如下步骤：提取待测药材的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测药材的原料为人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参；
所述方法Ⅴ包括如下步骤：检测待测药材的基因组DNA中是否含有权利要求1所述的引物组合中的引物对Ⅰ的靶序列、引物对Ⅱ的靶序列或引物对Ⅲ的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅰ的靶序列、待测药材的原料为人参，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅱ的靶序列、待测药材的原料为三七，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅲ的靶序列、待测药材的原料为西洋参，如果所述基因组DNA中不含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ或引物对Ⅲ的靶序列、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参；
所述引物对Ⅰ的靶序列为序列表的序列7所示的DNA分子；
所述引物对Ⅱ的靶序列为序列表的序列8所示的DNA分子；
所述引物对Ⅲ的靶序列为序列表的序列9所示的DNA分子。
7.鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的方法，为如下方法Ⅵ或方法Ⅶ或方法Ⅷ；
所述方法Ⅵ包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有247bp的DNA片段、待测样品中含有人参，如果扩增产物中含有492bp的DNA片段、待测样品中含有三七，如果扩增产物中含有1088bp的DNA片段、待测样品中含有西洋参，如果扩增产物中不含有247bp的DNA片段、
492bp的DNA片段或1088bp的DNA片段、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参；
所述方法Ⅶ包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测样品中含有人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参；
所述方法Ⅷ包括如下步骤：检测待测样品的基因组DNA中是否含有权利要求1所述的引物组合中的引物对Ⅰ的靶序列、引物对Ⅱ的靶序列或引物对Ⅲ的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅰ的靶序列、待测样品中含有人参，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅱ的靶序列、待测样品中含有三七，如果所述基因组DNA中含有引物对Ⅲ的靶序列、待测样品中含有西洋参如果所述基因组DNA中不含有引物对Ⅰ、引物对Ⅱ或引物对Ⅲ的靶序列、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参；
所述引物对Ⅰ的靶序列为序列表的序列7所示的DNA分子；
所述引物对Ⅱ的靶序列为序列表的序列8所示的DNA分子；
所述引物对Ⅲ的靶序列为序列表的序列9所示的DNA分子。
8.引物对Ⅱ；
所述引物对Ⅱ由引物F3和引物F4组成；
所述引物F3为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物F4为序列表的序列4所示的单链DNA分子。
9.权利要求8所述引物对Ⅱ在制备试剂盒甲中的应用；
所述试剂盒甲的用途为如下（d1）或（d2）：
（d1）鉴定待测药材是否为三七；
（d2）鉴定待测样品中是否含有三七。
10.含有权利要求8所述引物对Ⅱ的试剂盒甲；
所述试剂盒甲的用途为如下（d1）或（d2）：
（d1）鉴定待测药材是否为三七；
（d2）鉴定待测样品中是否含有三七。
说明书 :
一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用。
背景技术
[0002] 人参属(Panax L.)植物是名贵的药用植物，全属植物均作药用。《中国药典》收载的有6种，包括人参、西洋参、三七、竹节参、珠子参、羽叶三七。其中人参、西洋参、三七是人参属最主要的药用及功能性食品品种，其根、根茎、叶、花、果实等均做药用，价值很高。在中医临床用药上，人参性温，功效大补元气、固脱生津、安神；三七性温、味甘微苦，功效散瘀止血、消肿定痛；西洋参性凉，功效补气养阴、清热生津。三者药效具有很大区别，不能混用。然而，由于人参、三七、西洋参为人参属近缘物种，形态和化学成分相似，市场有掺杂混用现象发生，尤其是市场常见人参、西洋参饮片或人参花、西洋参花、三七花相互掺杂的情况，对用药安全造成损害，需要建立准确、可靠、特别是能同时检测是否存在相互掺杂的鉴定方法。
[0003] 目前虽然分别有人参、西洋参特异性分子标记及其检测方法的报道，但这些技术只关注人参属真伪品的鉴定，无法鉴定是否存在掺杂品，对市场实际存在的花、叶、饮片类掺杂样品需要进行多次PCR反应才能判定。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用。
[0005] 本发明提供了一种引物组合，由引物对I、引物对II和引物对III组成；
[0006] 所述引物对I由引物F1和引物F2组成；
[0007] 所述引物F1为如下(a1)或(a2)：
[0008] (a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0009] (a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
[0010] 所述引物F2为如下(a3)或(a4)：
[0011] (a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0012] (a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
[0013] 所述引物对II由引物F3和引物F4组成；
[0014] 所述引物F3为如下(a5)或(a6)：
[0015] (a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
[0016] (a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
[0017] 所述引物F4为如下(a7)或(a8)：
[0018] (a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
[0019] (a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
[0020] 所述引物对III由引物F5和引物F6组成；
[0021] 所述引物F5为如下(a9)或(a10)：
[0022] (a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
[0023] (a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
[0024] 所述引物F6为如下(a11)或(a12)：
[0025] (a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
[0026] (a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
[0027] 所述引物组合的用途为如下(b1)至(b6)中的任意一种：
[0028] (b1)鉴别人参、三七和西洋参；
[0029] (b2)制备用于鉴别人参、三七和西洋参的试剂盒；
[0030] (b3)鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；
[0031] (b4)制备用于鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参的试剂盒；
[0032] (b5)鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参；
[0033] (b6)制备用于鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的试剂盒。
[0034] 本发明还保护所述引物组合的应用，如下(b1)至(b6)中的任意一种：
[0035] (b1)鉴别人参、三七和西洋参；
[0036] (b2)制备用于鉴别人参、三七和西洋参的试剂盒；
[0037] (b3)鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；
[0038] (b4)制备用于鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参的试剂盒；
[0039] (b5)鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参；
[0040] (b6)制备用于鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的试剂盒。
[0041] 本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：
[0042] (c1)鉴别人参、三七和西洋参；
[0043] (c2)鉴定待测药材是否为人参、三七或西洋参；
[0044] (c3)鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参。
[0045] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
[0046] 本发明还保护鉴别由单一原料加工的待测药材的原料为人参、三七还是西洋参的方法，为如下方法I或方法II。
[0047] 所述方法I包括如下步骤：提取待测药材基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有227-267bp的DNA片段、待测药材的原料为人参，如果扩增产物中含有472-512bp的DNA片段、待测药材的原料为三七，如果扩增产物中含有1068-1108bp的DNA片段、待测药材的原料为西洋参。
[0048] 所述方法II包括如下步骤：检测待测药材基因组DNA中是否含有所述引物组合中的引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测药材的原料为人参，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测药材的原料为三七，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测药材的原料为西洋参。
[0049] 所述待测药物的原料为人参、三七或西洋参的根、叶、花、茎或种子。
[0050] 本发明还保护鉴定由单一原料加工的待测药材的原料是否为人参、三七或西洋参的方法，为如下方法III或方法IV或方法V。
[0051] 所述方法III包括如下步骤：提取待测药材的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果采用扩增产物中含有227-267bp的DNA片段、待测药材的原料为人参，如果扩增产物中含有472-512bp的DNA片段、待测药材为三七，如果扩增产中含有1068-1108bp的DNA片段、待测药材的原料为西洋参，如果扩增产物中不含有227-267bp的DNA片段、472-512bp的DNA片段或1068-1108bp的DNA片段、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参。
[0052] 所述方法IV包括如下步骤：提取待测药材的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测药材的原料为人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测药材的原料为非人参且非三七且非西洋参。
[0053] 所述方法V包括如下步骤：检测待测药材的基因组DNA中是否含有所述引物组合中的引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测药材的原料为人参，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测药材的原料为三七，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测药材的原料为西洋参，如果所述基因组DNA中不含有引物对I、引物对II或引物对III的靶序列、待测的原料为非人参且非三七且非西洋参。
[0054] 所述待测药材的原料具体可为人参、三七、西洋参、竹节参、珠子参或羽叶三七的根、叶、花、茎或种子。
[0055] 本发明还保护鉴定待测样品中是否含有人参和/或三七和/或西洋参的方法，为如下方法VI或方法VII或方法VIII。
[0056] 所述方法VI包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如果扩增产物中含有227-267bp的DNA片段、待测样品中含有人参，如果扩增产物中含有472-512bp的DNA片段、待测样品中含有三七，如果扩增产物中含有1068-1108bp的DNA片段、待测样品中含有西洋参，如果扩增产物中不含有227-267bp的DNA片段、472-512bp的DNA片段或1068-1108bp的DNA片段、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。
[0057] 所述方法VII包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增；如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后可以检测到绿色荧光、待测样品中含有人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入SYBR Green I荧光染料后不可以检测到绿色荧光、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。
[0058] 所述方法VIII包括如下步骤：检测待测样品的基因组DNA中是否含有所述引物组合中的引物对I的靶序列、引物对II的靶序列或引物对III的靶序列；如果所述基因组DNA中含有引物对I的靶序列、待测样品中含有人参，如果所述基因组DNA中含有引物对II的靶序列、待测样品中含有三七，如果所述基因组DNA中含有引物对III的靶序列、待测样品中含有西洋参如果所述基因组DNA中不含有引物对I、引物对II或引物对III的靶序列、待测样品中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。
[0059] 本发明还保护所述引物对II或引物对III。
[0060] 本发明还保护所述引物对II在制备试剂盒甲中的应用。
[0061] 所述试剂盒甲的用途为如下(d1)或(d2)：
[0062] (d1)鉴定待测药材是否为三七；
[0063] (d2)鉴定待测样品中是否含有三七。
[0064] 本发明还保护所述引物对III在制备试剂盒乙中的应用。
[0065] 所述试剂盒乙的用途为如下(d3)或(d4)：
[0066] (d3)鉴定待测药材是否为西洋参；
[0067] (d4)鉴定待测样品中是否含有西洋参。
[0068] 本发明还保护含有所述引物对II的试剂盒甲。
[0069] 所述试剂盒乙的用途为如下(d1)或(d2)：
[0070] (d1)鉴定待测药材是否为三七；
[0071] (d2)鉴定待测样品中是否含有三七。
[0072] 本发明还保护含有所述引物对III的试剂盒乙。
[0073] 所述试剂盒乙的用途为如下(d3)或(d4)：
[0074] (d3)鉴定待测药材是否为西洋参；
[0075] (d4)鉴定待测样品中是否含有西洋参。
[0076] 以上任一所述的PCR扩增退火温度为60℃。
[0077] 以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板(DNA含量为0.032g-20ng)，16.3μL无菌双蒸水。
[0078] 所述DNA含量具体可为10ng。
[0079] 以上各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为5μM。
[0080] 以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。
[0081] 以上任一所述227-267bp的DNA片段具体可为247bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列7所示的DNA分子。
[0082] 以上任一所述472-512bp的DNA片段具体可为492bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列8所示的DNA分子。
[0083] 以上任一所述1068-1108bp的DNA片段具体可为1088bp的DNA片段，更具体可为序列表的序列9所示的DNA分子。
[0084] 以上任一所述待测样品具体可为人参、三七、西洋参、竹节参、珠子参或羽叶三七的根、叶、花、茎、种子、加工制品或其他类型的药材。
[0085] 真伪掺杂品的鉴别一直是中药鉴别的难点问题，依赖于具有同时检测真伪品特异性标记的方法的开发。多重PCR是一种在同一体系内进行多个PCR扩增的技术，其突出优势是在一次检测中同时表征多个位点或基因片段，从而具有掺杂检测的潜力。此前的人参属多重PCR鉴别方法往往只关注于能否同时检测人参、西洋参、三七物种，对每种药材均需要两对引物的扩增结果才能判定，无法用于鉴定是否存在掺杂样品。本发明对多批人参、西洋参、三七及其他近缘物种进行了实验验证，包含根、叶、花、种子和不同类型的药材，结果所有人参、三七、西洋参均获得正确的阳性鉴别结果，其他人参属近缘物种均为阴性，与形态学鉴定结果完全吻合，进一步验证了本发明的可靠性和稳定性。为检测该方法对混伪品的鉴别能力，本发明制作了一系列不同掺伪程度的人参、西洋参、三七混合样品并进行多重PCR扩增，结果对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1％，满足中药生产检验的需求。本发明可用于人参、西洋参、三七的根、根茎、叶、花、果实及其加工制品的鉴别。
附图说明
[0086] 图1为退火温度优化实验结果。其中，各温度泳道1和泳道2为西洋参样本(表1中的序号为16、17)；泳道3和4为三七样本(表1中的序号为10、11)；泳道5和6为人参样本(表1中的序号为1、2)；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0087] 图2为PCR鉴定方法验证结果。其中，泳道1-7为人参(表1中的序号为1-7)；泳道8-13为三七(表1中的序号为10-15)；泳道14-20为西洋参(表1中的序号为16、17、18、19、20、
20、20)；泳道21为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的1/3，西洋参样本质量占混合样本质量的1/3，三七样本质量占混合样本质量的1/3)；泳道22为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的49.75％，西洋参样本质量占混合样本质量的0.5％，三七样本质量占混合样本质量的49.75％)；泳道23为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的0.5％，西洋参样本质量占混合样本质量的
49.75％，三七样本质量占混合样本质量的49.75％)；泳道24为以水做模板的空白对照；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
20、20)；泳道21为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的1/3，西洋参样本质量占混合样本质量的1/3，三七样本质量占混合样本质量的1/3)；泳道22为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的49.75％，西洋参样本质量占混合样本质量的0.5％，三七样本质量占混合样本质量的49.75％)；泳道23为人参、西洋参、三七混合样本(序号为1、10和16的样本混合，人参样本质量占混合样本质量的0.5％，西洋参样本质量占混合样本质量的
49.75％，三七样本质量占混合样本质量的49.75％)；泳道24为以水做模板的空白对照；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0088] 图3为人参、三七、西洋参相互掺伪样品PCR鉴别检出限。其中，泳道1为人参；泳道9为三七；泳道17为西洋参；泳道2-8、泳道10-16、泳道18-24为人参、三七、西洋参以不同质量比混合的混合样本，人参、三七、西洋参占混合样本质量的百分比为：泳道2(50％、12.5％、12.5％)，泳道3(80％、10％、10％)，泳道4(90％、5％、5％)，泳道5(95％、2.5％、2.5％)，泳道6(98％、1％、1％)，泳道7(99％、0.5％、0.5％)，泳道8(0％、50％、50％)，泳道10(12.5％、
50％、12.5％)，泳道11(10％、80％、10％)，泳道12(5％、90％、5％)，泳道13(2.5％、95％、
2.5％)，泳道14(1％、98％、1％)，泳道15(0.5％、99％、0.5％)，泳道16(50％、0％、50％)，泳道18(12.5％、12.5％、50％)，泳道19(10％、10％、80％)、泳道20(5％、5％、90％)，泳道21(2.5％、2.5％、95％)，泳道22(1％、1％、98％)，泳道23(0.5％、0.5％、99％)，泳道24(50％、
50％、0％)；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、
100bp。
50％、12.5％)，泳道11(10％、80％、10％)，泳道12(5％、90％、5％)，泳道13(2.5％、95％、
2.5％)，泳道14(1％、98％、1％)，泳道15(0.5％、99％、0.5％)，泳道16(50％、0％、50％)，泳道18(12.5％、12.5％、50％)，泳道19(10％、10％、80％)、泳道20(5％、5％、90％)，泳道21(2.5％、2.5％、95％)，泳道22(1％、1％、98％)，泳道23(0.5％、0.5％、99％)，泳道24(50％、
50％、0％)；泳道M为DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、
100bp。
具体实施方式
[0089] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，各条引物均以引物溶液形式加入至PCR反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为5μM。
[0090] 10×buffer缓冲液：Takara公司，产品目录号：A1101E。
[0091] SpeedStar HS Taq DNA聚合酶：Takara公司，5U/μL，产品目录号：RR070A。
[0092] 100×SYBR Green I：Invitrogen公司，产品目录号：1135054。
[0093] 人参：参考文献：张均田.人参研究的最新进展[J].江苏大学学报医学版，2009，19(3)：185-191.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
[0094] 西洋参：参考文献：王筠默.西洋参药理作用研究的最新进展[J].中药药理与临床，2001，13(4)：46-48.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
[0095] 三七：参考文献：杨志刚，陈阿琴，俞颂东.三七药理研究新进展[J].上海中医药杂志，2005，39(4)：59-62.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
[0096] 竹节参：参考文献：左锐，袁丁.竹节参化学成分和药理活性研究进展[J].时珍国医国药，2005，16(9)：838-839.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
[0097] 珠子参：参考文献：赵仁，赵毅，李东明，等.珠子参研究进展[J].中国现代中药，2008，10(7)：3-6..；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
[0098] 羽叶三七：参考文献：赵毅，赵仁，山学祥，等.羽叶三七植物性状及生长动态分析[J].云南中医学院学报，2012，35(2)：24-27.；公众可以从中国中医科学院中药研究所获得。
[0099] 以下实施例中的人参属植物材料及其来源见表1。表1中的样品均符合中国药典(2015年版)一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，各味样品实物与名称相符，质量符合标准。所有植物材料均经过减压干燥后使用球磨粉碎机粉碎至能过五号筛，得到植物材料粉末用于检测。
[0100] 表1人参属植物材料来源表
[0101]
[0102]
[0103] 实施例1、引物设计
[0104] 对各种人参属物种的基因组进行大量序列分析，获得了用于鉴定人参、三七和西洋参的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定人参、三七和西洋参的三套引物对。
[0105] 用于鉴定人参的引物对(引物对I)由引物F1和引物F2组成(5’→3’)：
[0106] F1(序列表的序列1)：TAACAATACCGGGCTGATAC；
[0107] F2(序列表的序列2)：CCAGTTAAGGACAGGAG；
[0108] 用于鉴定三七的引物对(引物对II)由引物F3和引物F4组成(5’→3’)：
[0109] F3(序列表的序列3)：AGGGATGAGGGGTGCGTAG；
[0110] F4(序列表的序列4)：CGACATGAGAAGAGGGCTTTTA；
[0111] 用于鉴定西洋参的引物对(引物对III)由引物F5和引物F6组成(5’→3’)：
[0112] F5(序列表的序列5)：AAATGCGGGTTATGACAAA；
[0113] F6(序列表的序列6)：TTCTGCATATACGCCCAAATT。
[0114] 引物对I、引物对II和引物对III组成引物组合。
[0115] 实施例2、鉴定方法优化
[0116] 一、退火温度优化
[0117] 待测样本为：人参(表1中的序号为1和2)、三七(表1中的序号为10和11)、西洋参(表1中的序号为16和17)。
[0118] 1、提取待测样本的基因组DNA。
[0119] 2、取步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增。
[0120] PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.4μL引物F1，0.4μL引物F2，0.4μL引物F3，0.4μL引物F4，0.4μL引物F5，0.4μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板(DNA含量为10ng)，16.3μL无菌双蒸水。
[0121] PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。
[0122] 分别设置如下退火温度：
[0123] 退火温度I：59℃；
[0124] 退火温度II：60℃；
[0125] 退火温度III：61℃；
[0126] 退火温度IV：62℃。
[0127] 3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
[0128] 结果如图1所示。结果表明退火温度为60℃-62℃时人参、三七、西洋参分别出现约247bp、492bp以及1088bp大小的特异性条带，无非特异性扩增及假阳性条带出现，但61℃以上时人参、三七特异性条带亮度明显降低，因此确定PCR最佳退火温度为60℃。
[0129] 二、引物用量优化
[0130] 待测样本为：人参(表1中的序号为1和2)、三七(表1中的序号为10和11)、西洋参(表1中的序号为16和17)。
[0131] 1、提取待测样本的基因组DNA。
[0132] 2、取步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增。
[0133] PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，引物F1，引物F2，引物F3，引物F4，引物F5，引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板(DNA含量为10ng)，无菌双蒸水加至25μL。
[0134] PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。
[0135] 分别设置不同的引物加入量。设置方法如表2所示，按照表2所示的3个因素(F1、F2加入量，F3、F4加入量，F5、F6加入量)设置64个处理组。
[0136] 表2引物加入量
[0137] F1、F2加入量(μL) F3、F4加入量(μL) F5、F62加入量(μL)0.1 0.1 0.1
0.2 0.2 0.15
0.3 0.3 0.2
0.4 0.4 0.25
0.2 0.2 0.15
0.3 0.3 0.2
0.4 0.4 0.25
[0138] 3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
[0139] 结果显示，最佳引物加入量为F1、F2各0.3μL，F3、F4各0.2μL，F5、F6各0.25μL。
[0140] 实施例3、鉴定方法建立
[0141] 一、琼脂糖凝胶电泳法
[0142] 1、提取待测样本的基因组DNA。
[0143] 2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0144] PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.3μL引物F1，0.3μL引物F2，0.2μL引物F3，0.2μL引物F4，0.25μL引物F5，0.25μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板DNA，17.2μL无菌双蒸水。
[0145] PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。
[0146] 3、将步骤2得到的扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据结果进行如下判断：
[0147] 如果扩增产物中含有247bp的DNA片段，则待测样本中含有人参，如果扩增产物中不含有247bp的DNA片段，则待测样本中不含有人参；
[0148] 如果扩增产物中含有492bp的DNA片段，则待测样本中含有三七，如果扩增产物中不含有492bp的DNA片段，则待测样本中不含有三七；
[0149] 如果扩增产物中含有1088bp的DNA片段，则待测样本中含有西洋参，如果扩增产物中不含有1088bp的DNA片段，则待测样本中不含有西洋参。
[0150] 二、荧光染色法
[0151] 1、提取待测样本的基因组DNA。
[0152] 2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0153] PCR扩增体系(25μL)：2.5μL 10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.3μL引物F1，0.3μL引物F2，0.2μL引物F3，0.2μL引物F4，0.25μL引物F5，0.25μL引物F6，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，2μL模板DNA，17.2μL无菌双蒸水。
[0154] PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸3min。
[0155] 3、向步骤2得到的PCR扩增产物中加入1μL 100×SYBR Green I，于362nm紫外波长下检测荧光，根据结果进行如下判断：
[0156] 如果扩增产物加入1μL 100×SYBR Green I后进行检测可以产生绿色荧光，则待测样本中含有人参或三七或西洋参，如果扩增产物加入1μL 100×SYBR Green I后进行检测不能产生绿色荧光，则待测样本中不含有人参且不含有三七且不含有西洋参。
[0157] 实施例4、鉴定方法验证
[0158] 待测样本：表1中的人参属植株材料。
[0159] 分别采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法对待测样本进行鉴定，PCR反应体系中，模板的DNA含量均为10ng。
[0160] 部分采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定的结果见图2。将图1中泳道1-7的247bp的目的条带测序，测序结果均如序列7所示。将图1中泳道8-13的492bp的目的条带测序，测序结果均如序列8所示。将图1中泳道14-20的1088bp的目的条带测序，测序结果均如序列9所示。混合样本均得到247bp、492bp和1088bp的三条目的条带。其余样本(竹节参、珠子参和羽叶三七)均未得到条带。结果表明，采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定的结果均与实际情况相符，检测准确率高达100％。
[0161] 采用荧光染色法进行鉴定的结果均与实际情况相符，检测准确率高达100％。
[0162] 综上所述，采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法均能够成功鉴定人参、三七和西洋参三种人参属植物材料。
[0163] 实施例5、灵敏度
[0164] 待测样品为：表1中编号为1的人参样本、编号为5的10的三七样本、编号为16的西洋参样本。
[0165] 1、提取待测样品的基因组DNA，得到DNA溶液；
[0166] 2、用ddH2O稀释步骤1得到的DNA溶液，得到各稀释液；
[0167] 3、取步骤2到的各稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合分别按照实施例3中的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法进行鉴定；
[0168] 由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
[0169] 反应体系1中，待测样品基因组DNA初始含量为：20ng；
[0170] 反应体系2中，待测样品基因组DNA初始含量为：4ng；
[0171] 反应体系3中，待测样品基因组DNA初始含量为：0.8ng；
[0172] 反应体系4中，待测样品基因组DNA初始含量为：0.16ng；
[0173] 反应体系5中，待测样品基因组DNA初始含量为：0.032ng。
[0174] 结果显示，模板DNA含量最低为0.032ng时，采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法均能够成功鉴定人参、三七、西洋参三种人参属植物材料。
[0175] 实施例6、掺伪检测限
[0176] 待测样本为：人参(表1中的序号为1)、三七(表1中的序号为10)、西洋参(表1中的序号为16)。
[0177] 1、取待测样本粉末，以不同质量比混合，得到混合样本。
[0178] 2、取待测样本和步骤1得到的混合样本，提取基因组DNA，得到DNA溶液。
[0179] 3、分别采用实施例3建立的琼脂糖凝胶电泳法对步骤2得到的DNA溶液进行鉴定，PCR反应体系中，模板的DNA含量均为10ng。
[0180] 结果如图3所示。结果表明，利用本发明的方法鉴定掺伪混合样本，人参的质量占混合样本质量的0.5％以上即可检出，三七的质量占混合样本质量的1％以上即可检出，西洋参的质量占混合样本质量的0.5％以上即可检出。
[0181] 综合上述结果表明，利用本发明的方法对人参、西洋参、三七中任意两者相互掺伪的检出限均达到1％。