玉米抗灰斑病主效QTL的连锁分子标记和应用

摘要

本发明属于玉米分子育种和生物技术领域，公开了玉米抗灰斑病主效QTL的连锁分子标记和应用，本发明中玉米抗灰斑病的主效QTL点位置明确，贡献率高，通过对玉米抗灰斑病的主效QTL位点的检测，可在苗期对感病单株进行淘汰。所述分子标记的引物为TD111F:5’‑ GTCGGAGGGTGTCCTTAGC ‑3’、TD111R：5’‑GACAGGTCGTGGTGATTATAGC ‑3’、TD382F:5’‑ CAAGGGCCCTGAAAACAATGG ‑3’和TD382R：5’‑ AGTGCGCCCAAAAAGCTGAT‑3’。利用该引物进行筛选，可提高玉米抗灰斑病育种的选择效率，从而加快育种进程。

权利要求

1.一种与玉米抗灰斑病主效QTL连锁的分子标记引物，所述的引物为TD111F: 5’- GTCGGAGGGTGTCCTTAGC -3’、TD111R：5’-GACAGGTCGTGGTGATTATAGC -3’ 、TD382F: 5’- CAAGGGCCCTGAAAACAATGG -3’和TD382R：5’- AGTGCGCCCAAAAAGCTGAT-3’。

2.权利要求1所述的引物在玉米抗灰斑病辅助育种中的应用。

说明书

玉米抗灰斑病主效QTL的连锁分子标记和应用

技术领域

[0001] 本发明属于玉米分子育种和生物技术领域，具体涉及一种与玉米抗灰斑病主效QTL位点、以及与主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

[0002] 玉米(Zea may L.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。玉米病害是玉米产量的重要影响因素，玉米灰斑病由玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)引起的一种常见的玉米真菌性病害，在我国西南玉米产区尤其严重。玉蜀黍尾孢菌主要是通过残存在土壤中的植物病残体进行越冬[1]，由真菌产生的分生孢子通过风和雨水飞溅的形式散布到玉米植株上[2-3]，温和潮湿的条件下，玉米灰斑病会进一步侵染，进而导致严重的叶片组织坏死和茎秆腐烂和倒伏[4]。玉米灰斑病的病原菌适应性较强，发生范围较广，所造成的产量损失一般在5-30％，严重时可达60％以上，甚至绝收，给玉米生产造成了严重的经济损失[5]。鉴于玉米灰斑病对经济和生态都有很重要的影响，培育抗病品种成为控制病害流行的有效手段。研究实践证明，在拓宽玉米种质基础的前提下，充分挖掘玉米抗灰斑病的优异等位基因，开发相应的功能性分子标记，实施分子标记辅助选择是抗性改良及抗性育种的重要途径。但是，用于分子标记辅助选择的QTL必须对目标性状具有较大的贡献率，即主效QTL，因此寻找主效QTL和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，玉米对灰斑病的抗性属数量性状，主要表现为加性遗传效应[6-9]。目前对玉米抗灰斑病的QTL定位研究也有一定的报道，但通常检测出的QTL分布在不同的染色体上，单个QTL效应值较小，很难在玉米抗灰斑病育种中应用。本研究利用在玉米高抗灰斑病和高感灰斑病自交系构建的分离群体定位到一个效应较大的主效QTL，并开发出与其紧密连锁的分子标记用于玉米抗灰斑病的辅助选择。

[0003] 参考文献：

[0004] [1]Payne GA,Duncan HE,Adkins CR.Influence of tillage on development of gray leaf spot and number of airborne conidia of Cercospora zeae-maydis.Plant Dis.,1987,71(4):329-332.

[0005] [2]Nazareno NRX de,Lipps PE,Madden LV.Effect of levels of corn residue on the epi demiology of gray leaf spot of corn in Ohio.Plant Dis.,1993,77(1):67-70.

[0006] [3]Donahue PJ,Stromberg EL,Myers SL.Inheritance of reaction to gray leaf spot in a diallel cross of 14maize inbreds.Crop Sci.,1991,31(4):926.[0007] [4]Rupe JC,Siegel MR,Hartman JR.Influence of environment and plant maturity  on gray  leaf  spot of  corn caused  by  Cercospora  zeae-maydis.Phytopathology,1982,72(12):1587-1591.

[0008] [5]卢灿华,罗雁新,沙本才,等.云南省玉米灰斑病菌孢子相关生物学特性研究.西南师范大学学报:自然科学版,2012,37(6):51-56.

[0009] [6]Elwinger G F,Johnson M W,Hill R R,et al.Inheritance of resistance to gray leaf spot of corn.Crop science,1990,30:350-358.

[0010] [7]Derera J,Tongoona P,Pixley K V,et al.Gene action controlling gray leaf spot resistance in Southern African maize germplasm.Crop science,2008,48:93-98.

[0011] [8]Ininda J,Danson J,Lagat M,et al.The use of simple sequence repeats markers to study genetic diversity in maize genotypes resistant to gray leaf spot disease.African Journal of Biotechenology,2007,6.

[0012] [9]Menkir A,Ayodele M.Genetic analysis of resistance to gray leaf spot of midaltitude maize inbres lines.Crop science,2005,45:163-170.发明内容

[0013] 本发明的目的在于提供了一种与玉米抗灰斑病主效QTL连锁的分子标记引物，所述的引物为TD111F:5’-GTCGGAGGGTGTCCTTAGC-3’、TD111R：5’-GACAGGTCGTGGTGATTATAGC-3’、TD382F:5’-CAAGGGCCCTGAAAACAATGG-3’和TD382R：5’-AGTGCGCCCAAAAAGCTGAT-3’。

[0014] 本发明的另一个目的在于提供了一种与玉米抗灰斑病主效QTL连锁的分子标记引物在玉米育种中的应用。所述的引物可用于玉米抗灰斑病的分子标记辅助选择、以及该主效QTL的精细定位和图位克隆。本发明为玉米灰斑病分子育种提供了新手段，可加速玉米抗灰斑病性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

[0015] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

[0016] 一种玉米抗灰斑病主效QTL位点qRglsSB通过下述方式筛选得到：构建定位分离群体，提取群体叶片的总DNA，合成玉米IBM图谱上已有的以及自主开发的SSR标记对DNA进行PCR以筛选多态性引物。利用多态性引物对BC1F1分离群体进行分子标记分析，获得基因型数据；利用该数据构建遗传连锁图谱；QTL定位。最终获得了一个抗灰斑病的主效QTL，位于分子标记TD111和TD382之间(物理距离约为2.8Mb)，TD111引物序列为TD111F:5’-GTCGGAGGGTGTCCTTAGC-3’和TD111R：5’-GACAGGTCGTGGTGATTATAGC-3’，在SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)中分别可扩增出569bp和268bp大小的条带，TD382引物序列为TD382F:5’-CAAGGGCCCTGAAAACAATGG-3’和TD382R：5’-AGTGCGCCCAAAAAGCTGAT-3’，在SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)中分别可扩增出116bp和128bp大小的条带。

[0017] 一种玉米抗灰斑病主效QTL、与QTL紧密连锁的分子标记在玉米抗灰斑病育种中的应用，利用分子标记TD111和TD382对待测群体进行基因型鉴定，选择并保留带型为杂合基因型的单株，即为抗病材料。通过选择上述玉米抗灰斑病主效QTL位点，可提高玉米抗灰斑病育种的选择效率，从而加快育种进程。

[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0019] 本发明首次定位到玉米高抗灰斑病自交系SB12中控制玉米抗灰斑病的主效QTL位点。在常规育种方法中，玉米灰斑病抗性的鉴定要等到玉米蜡熟期，费时费力且选择效率低下，通过对玉米抗灰斑病的主效QTL位点的检测，可以在苗期对感病单株进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中玉米抗灰斑病的主效QTL点位置明确，贡献率较高，能显著改善玉米自交系材料的抗灰斑病性状，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与抗灰斑病紧密连锁的分子标记，即可预测对灰斑病的抗性，进而准确快速筛选抗灰斑病材料。

附图说明

[0020] 图1为玉米自交系材料SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)对灰斑病抗性的植株表现。

[0021] 图2为玉米自交系材料SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)构建的BC1F1分离群体，2015年在湖北省恩施州巴东县种植时植株抗灰斑病的频数分布图。

[0022] 结果表明拟合曲线呈双峰分布，推测有主效QTL存在。

具体实施方式

[0023] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术。本发明实施例中使用的是玉米自交系SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)杂交构建的回交分离群体。所述的材料SB12和SA101来源于湖北腾龙种业有限公司。如未特别说明，本发明实施例中所用试剂或材料，均来源于商业渠道。

[0024] 实施例1：

[0025] 玉米抗灰斑病主效QTL的连锁分子标记的获得：

[0026] (1)定位分离群体构建：

[0027] 使用玉米自交系中SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)杂交构建BC1F1和BC3F1分离群体。两亲本和两群体的灰斑病发病表型鉴定，均为在湖北巴东灰斑病高发区进行田间自然诱发鉴定。考察BC1F1群体单株的灰斑病病情分级数据表明：该群体灰斑病的病情级数表型的拟合曲线呈双峰分布，推测有主效QTL存在。(图1，图2)。

[0028] (1)定位分离群体构建。2014年春季湖北省恩施州巴东县，种植自交系SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)，以SA101为母本，SB12为父本杂交得到F1代杂交种，2014年在海南，种植杂种F1代以及SA101，用SA101与杂种F1回交产生构建BC1F1分离群体。2015年春季，将2个亲本(SB12和SA101)、杂种F1代以及该BC1F1分离群体在湖北省恩施州巴东县进行田间种植，自然诱发条件下，进行灰斑病发病等级的表型鉴定；

[0029] (2)DNA的提取

[0030] 采用常规的CTAB法(Doyle et al.1987)提取亲本SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)及BC1F1分离群体的叶片总DNA。

[0031] (3)引物的开发和合成：

[0032] 申请人利用的SSR引物包括两类：玉米公开的IBM图谱上的SSR标记和自主开发的SSR标记，标记引物合成后，对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要软件包括Primer5.0。

[0033] (4)BC1F1群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：

[0034] 1)采用CTAB法提取BC1F1群体217个单株的DNA；

[0035] 2)挑选出169对多态性SSR标记引物对BC1F1群体217个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。

[0036] 3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，A、B、H和-分别代表SB12、SA101、杂合以及缺失基因型，获得分子标记基因型数据。

[0037] 4)利用Joinmap4.0软件对BC1F1群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得10个连锁群(含169个分子标记)，恰好对应玉米的10条染色体。

[0038] 5)基于该遗传图谱、BC1F1群体的基因型数据以及两群体的表型数据，利用WinQTLCart2.5软件进行QTL检测，仅检测到了一个主效QTL位点，位于分子标记C1-44和TF116之间，物理距离约为107Mb，遗传距离30cM；该QTL贡献率为58.4％，加性效应值为-4.08，LOD值为44.7，而且抗病等位基因来源于亲本SB12。利用分子标记辅助选择该BC1F1群体中含有QTL片段的单株，与SA101(感病亲本)回交得到BC2F1代种子。2015年冬季，在海南，种植BC2F1代种子，与SA101回交得到BC3F1群体，对BC3F1群体的种子，通过区段内分子标记进行基因型检测，得到不同基因型的跨叠系，利用跨叠系进行精细定位，最终将主效QTL定位在分子标记TD111和TD382之间(物理距离约为2.8Mb)，

[0039] 申请人最终获得了玉米抗灰斑病的主效QTL位点qRglsSB，该位点与SSR标记TD111和TD382紧密连锁，TD111引物序列为TD111F:5’-GTCGGAGGGTGTCCTTAGC-3’和TD111R：5’-GACAGGTCGTGGTGATTATAGC-3’，在SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)中分别可扩增出569bp和268bp大小的条带，TD382引物序列为TD382F:5’-CAAGGGCCCTGAAAACAATGG-3’和TD382R：5’-AGTGCGCCCAAAAAGCTGAT-3’，在SB12(抗病亲本)和SA101(感病亲本)中分别可扩增出116bp和128bp大小的条带。

[0040] 实施例2：

[0041] 分子标记TD111和TD382在玉米抗灰斑病性状辅助选择中的应用，其步骤包括：

[0042] (1)在湖北恩施州巴东县田间种植SB12×SA101/SA101的BC3F1群体，在苗期对BC3F1单株挂牌取样，并提取叶片总DNA，利用SSR分子标记TD111和TD382对其进行qRglsSB基因型的判断；

[0043] 利用分子标记TD111和TD382检测到均为杂合带型的，记为抗病株；利用分子标记TD111和TD382检测均为纯合带型B的，记为感病株。

[0044] (2)在成熟期对BC3F1群体中的单株进行灰斑病病情调查(调查标准采用我国病害鉴定通用的叶斑病病级划分标准，即1、3、5、7、9级)。结果表明，步骤1)中分子标记TD111和TD382基因型均为H的单株表现为抗灰斑病，步骤1)中分子标记TD111和TD382基因型均为B的单株表现为感灰斑病(表1)。即，凡是利用本发明提供的分子标记检测出为HH带型的，均为抗病株。可见在苗期进行淘汰感病株，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出抗灰斑病的单株用于提高玉米抗灰斑病性。

[0045] 表1利用分子标记TD111和TD382辅助选择得到的BC3F1单株的抗感灰斑病性状[0046]TD111基因型 TD382基因型 单株数 抗感灰斑病性状
H H 105 抗灰斑病
B B 67 感灰斑病
H B 5 感灰斑病
H B 33 抗灰斑病
B H 7 感灰斑病
B H 13 抗灰斑病

[0047] B、H分别代表来源于SA101和杂合带型。其中TD111分子标记中B型的条带大小是268bp，H型的条带大小是569和268bp；TD382分子标记中B型的条带大小是128bp，H型的条带大小是128和116bp。