大黄酸或姜黄素在制备预防和/或治疗糖尿病肾病药物中的应用

摘要

本申请公开了一种药物及组合物。所述药物组合物包括大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷。所述大黄酸具有1‑5‑摩尔份，所述姜黄素具有1‑5‑摩尔份，所述二苯乙烯苷具有1‑5摩尔份。本申请还公开了所述药物组合物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病，和/或降糖的药物中的应用。

权利要求

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由1摩尔份的大黄酸、5摩尔份的姜黄素和1摩尔份的二苯乙烯苷组成。

2.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括如权利要求1所述的药物组合物和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂选自片剂、胶囊和冲剂中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的药物制剂，其特征在于，以在所述药物制剂中的质量百分含量计，大黄酸2.4％-38.4％、姜黄素26.7％-92.5％和二苯乙烯苷4.1％-51.9％。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，或根据权利要求2-4中任意一项所述的药物制剂在制备预防和/或治疗糖尿病肾病，和/或降糖的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述糖尿病选自II型糖尿病。

说明书

大黄酸或姜黄素在制备预防和/或治疗糖尿病肾病药物中的

应用

技术领域

[0001] 本申请涉及大黄酸或姜黄素在制备预防和/或治疗糖尿病肾病，和/或降糖的药物中的应用，特别涉及一种药物组合物和药物制剂。

背景技术

[0002] 糖尿病发病率日益攀升，已成为一个公共卫生问题，其严重的并发症之一是糖尿病肾病。糖尿病肾病是一种微血管并发症，逐渐发展的肾脏损害中，可见弥漫性和结节性肾小球硬化，以及与这些病理改变相伴随的水肿、蛋白尿、高血压等临床表现，最后直接导致肾功能衰竭。糖尿病患者I型占10％，II型占90％，I型中有约35％发生糖尿病肾病，而II型中有约25％发生。糖尿病肾病已成为终末期肾病的(ESRD)的第一位原因。美国透析患者中30％来自糖尿病肾病，接受肾移植约1/5为糖尿病肾病患者。研究显示，糖尿病合并肾病和尿毒症的概率较非糖尿病人高效7倍。糖尿病病程10-20年后，约半数会发生肾功能衰竭。因此，糖尿病肾病的预防和治疗均应得到足够的重视。

[0003] 目前临床用于降糖的化学药物，主要效应是降低血糖，而对糖尿病重要脏器损伤等并发症往往没有防治作用。目前无特效、能预防、终止或逆转糖尿病肾脏功能障碍进展的药物。临床用于治疗糖尿病的化学药物在降低血糖之外，并不具备肾脏功能的改善或保护，有些降糖药物甚至发生肾损伤作用，例如在肾脏功能出现损害时不宜使用双胍类及经肾脏代谢的药物，双胍类降糖药易诱发乳酸中毒，并可加重肾功能衰竭时的代谢性酸中毒症状；经肾代谢的降糖药，可加重肾脏负担，并可造成严重的持续性低血糖。

[0004] 因此，目前临床上的治疗方法有很大的局限性，不能有效地减缓病情的发展。研发预防和/或治疗糖尿病肾病的药物成为当前该领域的重大课题。

发明内容

[0005] 本申请首次确定了大黄酸和姜黄素均可以用于预防和/或治疗糖尿病肾脏损伤，以及降糖的功效，其中相比于大黄酸，姜黄素能够取得更好的效果。因此，本申请之一提供了大黄酸或姜黄素在制备预防和/或治疗糖尿病肾病，和/或降糖的药物中的应用。本申请的大黄酸或姜黄素具有降糖和防治糖尿病肾病双重功效，其具有疗效好、毒副作用低、安全、用量小、应用方便等优点。避免中药大复方成分复杂不清的缺点，同时除去了中药大复方中毒性成分，从而减少毒副作用的发生。

[0006] 本申请之二提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括大黄酸和姜黄素。

[0007] 本申请的研究表明，将大黄酸和姜黄素组合可以更好地预防和/或治疗糖尿病肾脏损伤，两者表现出协同作用。

[0008] 进一步地，本申请确定了两种单体化合物在组合物中的优选比例关系，在一个具体实施方式中，所述大黄酸具有1-5摩尔份，所述姜黄素具有1-5摩尔份。例如，按人体重70kg计算，所述大黄酸具有55mg/70kg-275mg/70kg体重，所述姜黄素具有355mg/70kg-
1775mg/70kg体重。

[0009] 本申请的研究还发现，当大黄酸和姜黄素与二苯乙烯苷组合时，比其中的任何两两组合预防和/或治疗糖尿病肾脏损伤效果更好，表现出最佳协同作用。因此，在一个具体实施方式中，所述药物组合物还包括二苯乙烯苷。

[0010] 进一步地，本申请还确定了二苯乙烯苷在组合物中的比例。因此，在一个具体实施方式中，所述二苯乙烯苷具有1-5摩尔份。例如，按人体重70kg计算，所述二苯乙烯苷具有8mg/70kg-40mg/70kg体重范围。

[0011] 在一个具体实施方式中，优选所述大黄酸具有1-5摩尔份，所述姜黄素具有4-5摩尔份，所述二苯乙烯苷具有1-5摩尔份。

[0012] 在一个具体实施方式中，更优选所述大黄酸具有1-2摩尔份，所述姜黄素具有5摩尔份，所述二苯乙烯苷具有1-2摩尔份。

[0013] 本申请之三提供了一种药物制剂，所述药物制剂包括如本申请之一所述的药物组合物和药学上可接受的载体。

[0014] 在一个具体实施方式中，所述制剂选自片剂、胶囊和冲剂中的至少一种。

[0015] 在一个具体实施方式中，以在所述药物制剂中的质量百分含量计，大黄酸2.4％-38.4％、姜黄素26.7％-92.5％和二苯乙烯苷4.1％-51.9％。根据研究数据，最佳质量百分比为大黄酸11.1％、姜黄素71.1％和二苯乙烯苷17.8％配伍组合。

[0016] 本申请之四提供了根据本申请之二所述的药物组合物，或根据本申请之三所述的药物制剂在制备预防和/或治疗糖尿病肾病，和/或降糖的药物中的应用。

[0017] 在一个具体实施方式中，所述糖尿病选自II型糖尿病。

[0018] 中医学整体观念的特点及中药学复方特征，使得中药在治疗神经损伤性疾病上具有多靶点的优势，具有很强的可行性。本申请的研究发现，大黄酸和姜黄素均表现出降糖和肾脏保护作用。另外，二苯乙烯苷也表现出降糖和肾脏保护作用。但三者的作用机制不同。因此，由这些组分组成的单体复方制剂在效应上可发挥多靶点神经保护机制，对应糖尿病肾脏损伤多因素、多环节、多途径等特点，而干预其中某一环节或途径单一的治疗经临床证实疗效较差。另外，单体复方制剂又可避免中药大复方成分复杂不清的缺点，避免毒性成分，因此单体复方成分清楚、含量配伍清晰、靶点明确，从而减少毒副作用的发生。大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷均具有一定的降糖与肾脏保护作用，因此，本申请筛选出了该三种组分，采用优选剂量配伍，阐明三种化合物协同作用的药效物质基础与配伍比例。因此，本申请发掘了一种安全有效且成分明确的新型单体复方糖尿病肾脏保护药物。

附图说明

[0019] 图1为单体及复方组合物对糖耐量的影响。三类单体以及复方对糖耐量的影响，RGZ作为阳性对照药物。大黄酸(Rhein)、姜黄素(Curcumin)和二苯乙烯苷(TSG)，三单体组合物(Combination)。n＝8平均值±标准误，**p<0.01与模型组(T2DM)比较。

具体实施方式

[0020] 下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

[0021] 如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

[0022] 大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1购自中国典型培养物保藏中心。

[0023] 大黄酸购自国家标准物质中心，纯度≥98％。

[0024] 姜黄素购自国家标准物质中心，纯度≥99％。

[0025] 二苯乙烯苷购自国家标准物质中心，纯度≥98％。

[0026] 实施例1

[0027] 细胞实验

[0028] 该实施例主要评价各组分的作用及量效关系。利用肾小球系膜细胞(EMCs)高糖培养模型，筛选大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷各单组份及其组合物对EMCs增值、IV型胶原和层黏粘蛋白合成的影响。

[0029] 1.MTT比色法测大鼠肾小球系膜细胞(MCs)增殖

[0030] MCs在高糖环境培养48h时显著刺激系膜细胞增殖。

[0031] MCs培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基(购自gibco)中，常规置于37℃，5％CO2培养箱中孵育，用0.25％胰蛋白酶消化传代，每周传代2-3次。MTT法检测GMCs增殖活性，取对数期大鼠GMCs，每孔2×104-4×104细胞接种于96孔板上，12h待细胞亚融合后改0.5％的胎牛血清DMEM培养24h使细胞同步化。弃上清，按不同处理分组给药，每组设6个复孔，分别加入大黄酸、姜黄素、二苯乙烯苷1h后，将DMEM中葡萄糖含量增加至30mM，继续培养48h，于实验终止前4h每孔加10μl(5mg/ml)MTT。4h后吸净上清液，加入100μl DMSO，振荡10min于酶标仪上570nm波长处测OD值。

[0032] 单体对高糖引起肾脏系膜细胞增殖的影响结果见表1。从表1中可以看出，系膜细胞在高糖环境培养48h时显著刺激系膜细胞增殖，中高剂量的大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷均表现出抑制高糖引起的系膜细胞增殖，并呈剂量依赖性关系。而阳性对照药物罗格列酮(RGZ，5μM)和小剂量大黄酸(1μM)对系膜细胞增殖无显著影响。

[0033] 2.MCs培养上清中胶原蛋白IV和层黏连蛋白含量测定

[0034] MCs在高糖环境培养48h时显著引起IV型胶原合成。

[0035] 细胞处理同上，将MCs细胞按每孔104接种于96孔培养板中，于37℃、5％CO2孵箱中培养48h，收集细胞上清，按照试剂盒说明书进行胶原蛋白IV和层黏连蛋白含量的测定。根据标准曲线求出相应的蛋白含量。每组各设3个复孔，取各组平均值作为最终结果，实验重复3次。

[0036] 单体高糖环境下系膜细胞IV型胶原合成的影响结果见表1。从表1中可以看出，系膜细胞在高糖环境培养48h时显著引起IV型胶原合成，中高剂量的大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷均表现出抑制高糖引起的IV型胶原合成，并呈剂量依赖性关系。而阳性对照药物罗格列酮(RGZ，5μM)和小剂量各组对IV型胶原合成无显著影响。

[0037] 单体对高糖环境下系膜细胞层黏连蛋白合成的影响结果见表1。从表1中可以看出，系膜细胞在高糖环境培养48h时显著刺激系膜细胞层黏连蛋白合成，大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷均表现出抑制高糖引起的层黏连蛋白合成增加，并呈剂量依赖性关系。而阳性对照药物罗格列酮(RGZ，5μM)和小剂量大黄酸(1μM)对层黏连蛋白合成无显著影响。

[0038] 表1三种单体分别对高糖引起肾脏系膜细胞增殖及相关蛋白表达的影响[0039]

[0040] n＝6培养皿/组，平均值±标准误，##P<0.01与正常对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与高糖组比较。

[0041] 3.三种单体间两两组合对抑制肾脏系膜细胞增殖作用的考察

[0042] 根据上述第1和2小节的研究结果，发现大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷在一定剂量时均表现出对高糖引起的肾脏系膜细胞增殖的抑制作用。进一步利用交叉设计，考察大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷三个单体间两两组合及其在不同剂量下的作用。由于三个单体在1μM剂量单独使用时效果不显著，故在联合使用是分别选择5μM和25μM两个剂量进行研究。

[0043] 大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷在5μM和25μM两个剂量均有较好疗效，因此，先考察在三种单体在这两个剂量下两两组合的效应。测定方法同第1小节。结果见表2。从表2可以看出，其中任何两药联合应用，均表现出比单体更强的抑制系膜细胞增殖作用，即三种单体两两之间表现出一定的协同作用。

[0044] 表2.三种单体间的两两组合对抑制肾脏系膜细胞增殖作用(OD值％)[0045]

[0046] 注：n＝6培养皿/组，平均值±标准误，**p<0.01与正常比较；#p<0.05,##p<0.01与高糖模型比较。

[0047] 4.三种单体在不同剂量下的组合对抑制肾脏系膜细胞增殖作用的考察[0048] 结合上述第3小节三种单体间的两两组合的效果，进一步考察三个单体的联合使用，剂量分别考察大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷均在5μM和25μM浓度下的作用。根据三因素两水平设计，共分为以下8种组合：

[0049] 组合1：大黄酸(5μM)+姜黄素(5μM)+二苯乙烯苷(5μM)；

[0050] 组合2：大黄酸(5μM)+姜黄素(5μM)+二苯乙烯苷(25μM)；

[0051] 组合3：大黄酸(5μM)+姜黄素(25μM)+二苯乙烯苷(5μM)；

[0052] 组合4：大黄酸(5μM)+姜黄素(25μM)+二苯乙烯苷(25μM)；

[0053] 组合5：大黄酸(25μM)+姜黄素(5μM)+二苯乙烯苷(5μM)；

[0054] 组合6：大黄酸(25μM)+姜黄素(5μM)+二苯乙烯苷(25μM)；

[0055] 组合7：大黄酸(25μM)+姜黄素(25μM)+二苯乙烯苷(5μM)；

[0056] 组合8：大黄酸(25μM)+姜黄素(25μM)+二苯乙烯苷(25μM)。

[0057] 对上述8种组合物考察对肾系膜细胞增殖抑制作用，结果见表3。由表3可见，三个单体组合均具有较好的抑制系膜细胞增殖作用。相比较而言，组合中当姜黄素浓度较高(25μM)时，即组合3、组合4、组合7和组合8对细胞增殖抑制作用较显著，但这4组间效应无明显差异，并且大黄酸(5μM)与二苯乙烯苷(5μM)浓度较低。据此，在效应可以保证的前提下，三个药物组合的摩尔浓度比例可以按照组合3的比例设定，大黄酸(5μM)+姜黄素(25μM)+二苯乙烯苷(5μM)，摩尔浓度比例为大黄酸：姜黄素：二苯乙烯苷＝1:5:1。在大鼠整体实验中，药物给药剂量按照这一比例进一步验证评价。

[0058] 表3两类单体成分抑制肾脏系膜细胞增殖的协同作用(OD值％)

[0059]

[0060] 注：n＝6培养皿/组，平均值±标准误，##p<0.01与正常比较；**p<0.01与高糖模组比较；&p<0.05与组合1、组合2、组合5或组合6比较。

[0061] 实施例2

[0062] 大鼠实验

[0063] 链脲佐菌(STZ)诱导II型糖尿病大鼠模型

[0064] SD(Spraque-Dawley)雄性大鼠，10周龄左右，体重252±23g，随机分为：正常对照组和糖尿病待造模组。适应性喂养1周后，模型组大鼠喂以高糖、高脂饲料(其中含10.0％猪油、20.0％蔗糖、2.5％胆固醇、1.0％胆酸盐、66.5％常规饲料)4周，诱导发生胰岛素抵抗。第5周，各实验组大鼠禁食不禁水12h后，链脲佐菌(STZ)腹腔注射30mg/kg，正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。注射1周后，各组大鼠禁食不禁水12h后断尾取血，测空腹血糖(Fasting Blood Glucose，FBG)。FBG＞16.7mmol/L视为造模成功。治疗组每日给予单体及复方制剂灌胃给药4周(每日2次，于AM9:00和PM5:00各灌胃1次)，阳性对照选择罗格列酮(3mg/kg，RGZ)灌胃1次/天，阴性对照组和模型组给予等体积的生理盐水，每日2次，连续4周，实验组同时给予高糖高脂饲料喂养。考察单体及单体复方的降糖与肾保护作用。

[0065] 1.单体复方组合的动物药效学考察

[0066] 根据实施例1的细胞模型实验，结合大黄酸的分子量284.22、姜黄素的分子量368.39和二苯乙烯苷的分子量406.38，在假定三者生物利用度相同的情况下，依据分子量与细胞学实验中最佳有效浓度比例，设计三个单体摩尔比即大黄酸：姜黄素：二苯乙烯苷＝
1:5:1，确定三类单体给药剂量为大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg，单体组合剂量为45mg/kg。整体实验进一步比较三个单体及组合物对糖尿病大鼠肾脏功能的保护作用，药物均为灌胃口服给药，每日上午AM9:00和下午PM5:00各灌胃1次。阳性对照选择罗格列酮(3mg/kg，RGZ)，灌胃给药每日1次，阴性对照给予等体积生理盐水，每日灌胃每日上下午各1次。

[0067] (1)对STZ诱导II型糖尿病大鼠体重的影响

[0068] 首先制作II型糖尿病(T2DM)模型大鼠。STZ腹腔注射1周后，各组大鼠禁食不禁水12h后断尾取血，测空腹血糖(Fasting Blood Glucose，FBG)>16.7mmol/L视为造模成功。连续给药治疗4周后，模型对照组大鼠体质量减轻，状态萎靡，活动减少；而大黄酸(5mg/kg)，姜黄素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干预后大鼠体质量有不同程度增加，其中单体组合物治疗3-4周后体重增加最为显著，阳性对照RGZ组体重也显著增加(表4)。

[0069] 表4各组大鼠体重变化情况(均数±SEM)

[0070]

[0071] n＝8，**p<0.01与对照组比较；#p<0.0，##p<0.01与T2DM模型组比较；$p<0.05与组合物组比较。

[0072] (2)对STZ诱导II型糖尿病大鼠血糖及糖耐量的影响

[0073] 空腹血糖采用自动血糖仪和稳豪型血糖试纸检测，以mmol/L表示。糖耐量实验：模型干预组给予各单体与复方治疗4周，模型对照组给予与体质量相应体积的生理盐水，阳性对照药物为罗格列酮(3mg/kg RGZ)。糖耐量实验当天，各组动物禁食3-5小时，测定给葡萄糖前(即0时)血糖值，15-20分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kg体重，测定给葡萄糖后各组0.5，2.0小时的血糖值。连续给药治疗4周后，模型对照组大鼠血糖无明显变化，而大黄酸(5mg/kg)，姜黄素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：
5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干预后大鼠血糖均显著降低，单体组合治疗组降糖作用比各单体作用更强，显示出协同作用，组合物组降糖作用与阳性对照RGZ组作用相当(表5)。

[0074] 表5.各时间点SD大鼠空腹血糖(FBG)的变化情况(均数±SEM)

[0075]

[0076] n＝8，**p<0.01与对照组比较；#p<0.05，##p<0.01与T2DM模型组比较；$p<0.05，$$p<0.01与组合物组比较。

[0077] 在4周治疗结束时进行大鼠口服糖耐量实验(OGTT)。模型组大鼠的OGTT中各时间点的血糖值均显著高于正常组，表明大鼠糖耐量异常。而大黄酸(5mg/kg)，姜黄素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干预后，大鼠血糖各时间点均显著降低，单体组合物治疗组降糖作用与阳性对照RGZ作用相当，并显著强于各单体(图1)。

[0078] (3)单体复方组合对糖尿病模型大鼠肾脏功能的影响

[0079] 连续给药治疗4周后，留取T2DM模型大鼠血液与尿液，用Beckman全自动生化检测仪检测血浆肌酐(Cr)与尿素氮(BUN)水平。模型组大鼠血浆肌酐与尿素氮水平是显著升高，大黄酸(5mg/kg)，姜黄素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干预后血浆肌酐与尿素氮水平显著降低，而阳性对照RGZ明显降低尿素氮水平，但对血浆肌酐水平无显著影响，单体组合物(45mg/kg)治疗组保护肾脏作用最强，提示单体协同作用显著(表6)。

[0080] 表6.各处理组对大鼠肾脏功能的影响(均数±SEM)

[0081]

[0082] n＝8，**p<0.01与对照组比较；#p<0.05，##p<0.01与T2DM模型组比较；$p<0.05，$$p<0.01与组合物组比较。

[0083] 2.单体复方组合物药理作用机制研究

[0084] 为阐明大黄酸，姜黄素和二苯乙烯苷单体组合物减轻糖尿病模型大鼠肾脏损伤的机制，对影响肾脏纤维化信号因子和氧化损伤指标进行研究。

[0085] (1)对糖皮质激素诱导激酶1(SGK1)与TGF-β1蛋白表达的影响

[0086] SGK1参与多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能交汇点，参与细胞增殖与细胞凋亡等过程，从而促进间质纤维化。TGF-β1也能诱导SGK1在组织和细胞中的表达，二者水平的异常增加，可协同促进肾脏间质纤维化。

[0087] 模型大鼠连续药物干预4周后取肾皮质进行蛋白质Western blot。

[0088] 迅速取出肾脏，取肾皮质组织用PBS漂洗后，加入预冷的RIPA裂解液(含适量蛋白酶抑制剂cocktail和1mM PMSF)，于冰上用超声波细胞粉碎机匀浆5次(25Hz，3s/次，间隔5s)，最终液体至清亮。4℃，12000rpm离心20min，收集上清液于新的1.5ml离心管中；取少量上清用BCA法蛋白定量，绘制标准曲线，确定上样体积；剩余上清中加入1/4体积的5×上样缓冲液沸水煮8min，使蛋白变性。采用SDS-PAGE分离蛋白，先后配制9％分离胶和3％浓缩胶，待凝胶后，加入500ml电泳缓冲液(含1.51g Tris，7.4g甘氨酸，0.5g SDS)；取蛋白样品各30μg经加样孔上样，先80V电泳0.5h，然后调至120V继续电泳约1.5h，待溴酚蓝到达分离胶底部时，即停止电泳；PVDF膜用甲醇预处理2min，加入1L转移缓冲液(含200ml甲醇，14.4g甘氨酸，3.03g Tris)，将凝胶和PVDF膜以“黑胶白膜”的朝向放置，恒压100V，转移2h。转膜结束后，按照蛋白marker裁剪所需的目的蛋白条带，置于5％脱脂奶粉中封闭，室温缓慢摇动2-4h；PBST漂洗多余奶粉后，将条带封入塑料袋中，加入用PBST稀释的一抗，置于4℃孵育过夜；次日取出塑料袋，室温复温0.5h，然后PBST洗膜3次，每次10min，再将条带封入用PBST稀释的二抗中，室温孵育2h；PBST漂洗3次后，再用PBS漂洗10min，将ECL发光液A和B按1:1混合后，均匀滴加到膜上，迅速置于发光仪内曝光，照相。抗血清和糖皮质激素诱导激酶1(SGK1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)抗体购自美国Millipore公司。

[0089] 模型组大鼠肾皮质SGK1与TGF-β1表达显著增加，大黄酸(5mg/kg)，姜黄素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)干预后SGK1与TGF-β1表达水平显著降低，而阳性对照RGZ对TGF-β1表达水平无显著影响，只显著降低SGK1表达水平。单体组合(45mg/kg)治疗组抑制SGK1与TGF-β1表达作用最强，提示单体组合可发挥协同抑制肾间质纤维化(表7)。

[0090] 表7.各处理组对SGK1与TGF-β1表达的影响(均数±SEM)

[0091]

[0092] n＝8，**p<0.01与对照组比较；#p<0.05，##p<0.01与T2DM模型组比较；＄p<0.05，$$p<0.01与组合物组比较。

[0093] (2)对肾脏氧化损伤的抑制作用

[0094] 具体实验步骤请参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书。肾皮质组织匀浆，12000rpm离心20min，上清液按照试剂盒，通过分光光度仪用化学比色法测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平。

[0095] T2DM模型大鼠肾脏皮质氧化损伤较为显著。姜黄素(32mg/kg)和二苯乙烯苷(8mg/kg)以及单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)均不同程度减轻T2DM大鼠肾脏皮质中氧化损伤产物丙二醛(MDA)含量，增加谷胱甘肽(GSH)和氧化物歧化酶(SOD)水平。大黄酸(5mg/kg)作用较弱。阳性对照RGZ也减轻T2DM大鼠肾脏皮质中氧化损伤。单体组合物抗氧化损伤作用最为强大，显示单体组合的协同作用(表8)。

[0096] 表8单体及其组合对T2DM大鼠肾组织抗氧化的影响

[0097]

[0098] n＝8，**p<0.01与对照组比较，#p<0.05，##p<0.01与T2DM模型组比较；$p<0.05，$$p<0.01与组合物组比较。

[0099] 3.组合物安全性考察

[0100] 对单体组合物(45mg/kg，即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)进行急性毒性研究，取禁食12h后大鼠，按体重随机分为几个剂量给药组和水对照组，每组8只。药物组按25ml/kg大鼠体重灌胃给药1次，对照组灌胃等体积的生理盐水。采用Bliss法大鼠灌胃检测急性毒性未测得LD50，最大负荷剂量2000mg/kg(为大鼠有效剂量45mg/kg的44.4倍)，未见明显毒副作用。

[0101] 4.配伍制剂与给药方法

[0102] 1.配伍比例与推荐剂量

[0103] 根据大鼠实验结果，三个单体给药剂量为大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg，二苯乙烯苷：8mg/kg，以及单体组合物为45mg/kg(即大黄酸：5mg/kg，姜黄素：32mg/kg和二苯乙烯苷：8mg/kg)，以及大鼠/人(70公斤)体表面积换算，推荐组方临床单次人用量为500mg/70kg(其中大黄酸：55mg/kg，姜黄素：355mg/kg，二苯乙烯苷90mg)。

[0104] 2.制剂类型

[0105] (1)口服制剂：可为片剂、胶囊，规格为500mg/片，建议每次1片，每日1-2次。

[0106] (2)注射剂：静脉滴注，每日总量控制在1000mg-2000mg之间。

[0107] 5.结论

[0108] 本发明利用细胞学和整体动物研究，发现大黄酸、姜黄素和二苯乙烯苷配伍组合，具有显著的协同作用，并最大程度抑制II型糖尿病大鼠肾脏功能损伤，未见明显毒副作用。与阳性对照药物罗格列酮相比，不仅具有降糖作用，还明显降低肾脏功能损伤，促进肾功能恢复，具有显著的优势。其作用机制与降低血糖、增加糖耐量、抑制肾脏间质纤维化和氧化损伤有关。

[0109] 以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。