本发明公开了一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱及其制备方法，所述整体柱是先以环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体和丙烯酸酯交联剂聚合形成带有环氧基的支化结构的聚合整体柱固定相，再柱后开环加成，共价键合特异识别赭曲霉毒素的核酸适配体制得。本发明中核酸适配体与环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相表面支化分布的环氧基开环进一步加成，实现缩合偶联；所制备的聚合整体柱基质固定相具有环硅氧烷八元环型结构、支化分布环氧基，结构稳定，与5’‑氨基核酸适配体的作用位点多、位阻小，可实现对赭曲霉毒素A核酸适配体的高效键合，适用于赭曲霉毒素A的特异识别分离。
1.一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，其特征在于：所述的整体柱先以环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体和丙烯酸酯交联剂在烯基化的毛细管中热引发聚合，形成具有高度交联、带有环氧基的支化结构的环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相，在此基础上，对环氧基团进行氨基开环加成，柱后衍生核酸适配体制得；所述的整体柱固定相表面键合对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，其特征在于：所述的对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体在平面八元环型环硅氧烷支化分布的环氧基上开环加成，实现高度交联缩合；所述的特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱同时含有平面八元环型硅氧烷无机内核结构、胺基羟基共存的R1-NH-CHR2-OH极性基团以及对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体；其中R1为核酸适配体，R2为环硅氧烷丙烯酸酯。
3.根据权利要求1所述的一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，其特征在于：按质量百分数之和为100%计，所述的毛细管整体柱基质固定相各组分所占质量百分比为：环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体31.85% 37.83%，丙烯酸酯交联剂6.97% 12.95%，致孔剂由正丙~ ~醇和1,4-丁二醇二元体系组成，其中正丙醇16.92% 20.90%，1,4-丁二醇33.85% 37.83%，引~ ~发剂0.45%；所述的环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体为2-羟基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,
8-三(丙基缩水甘油醚)-2-环四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯；所述的丙烯酸酯交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述的引发剂为偶氮二异丁氰。
4.根据权利要求1所述的一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，其特征在于：所述的对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体为5'-NH2-C6-GATCGGGTGTGGGTG GCGTAAAGGGAGCATCGGACA。
5.一种制备如权利要求1所述的特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）毛细管柱壁表面烯基化：
对毛细管空柱依次采用0.1mol/L的盐酸溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液冲洗3小时，去离子水冲洗15分钟、甲醇冲洗15分钟，在50℃下氮气吹干；注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷体积比为1∶1的混合物，在60℃下反应12小时，用甲醇冲洗15分钟；在70℃下氮气吹干，制得柱壁表面烯基化的毛细管；
按比例称取环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体、丙烯酸酯交联剂、致孔剂及引发剂，混合均匀，超声振荡15分钟，然后将混合物注入经烯基化预处理过的毛细管中，控制注入的液柱的长度为28 32厘米，两端封闭并浸于60℃水浴锅中恒温加热20小时；待反应完成后，以甲醇~为流动相，在液相色谱泵上冲洗毛细管柱2小时，冲去床层内残留的溶剂、再将毛细管柱在泵压12Mpa状态下平衡10 15小时，得到环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相；
将5′端带氨基的核酸适配体使用前3000r/min离心5分钟，加入Tris-HCl缓冲液稀释到
100 μmol/L，涡旋震荡溶解核酸适配体，放置于90℃恒温水浴锅加热3分钟，室温条件下自然冷却约30分钟；采用液相泵将冷却后的核酸适配体溶液通入步骤（2）制备的环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相，60℃恒温反应1小时，使管壁表面上环氧基与适配体分子链5′端的氨基发生缩合反应；反应后用水冲洗30min，除去残留的核酸适配体之后，通入Tris-HCl缓冲液，即制得表面核酸适配体键合修饰的聚合整体柱。
6.根据权利要求5所述的一种制备特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的Tris-HCl缓冲液组成为：10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、
120mmol/L NaCl以及20mmol/L CaCl2，pH=8.00。
一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于整体柱功能材料制备领域，具体涉及一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱及其制备方法。
背景技术
[0002] 毛细管整体柱，是一类新兴的色谱微分离柱。目前，毛细管整体柱主要基于反相作用或亲水作用原理进行分离。在特异分析方面，亲和色谱柱利用固定于色谱固定相上的具有特异性识别功能的配体，使其与待分析物产生专一的相互作用，实现与样品中其他物质的分离。
[0003] 分子印迹聚合物（MIP）由于其类似于“钥匙-锁”相互作用的识别原理，成为选择性整体柱材料研究的主要研究对象。由于分子印迹技术自身的特点，存在合成时材料消耗大、极性溶剂干扰、刚性识别“空穴”易被破坏或变形等不足，以及MIP 合成过程中不可避免地产生非特异性结合位点，导致其选择性与抗体抗原、酶底物等专一特异性生物识别体系相比存在较大差距。
[0004] 核酸适配体具有稳定的二级结构和高特异性、高亲和力、便于化学修饰与功能化的特点，已成为一种广受关注的新型识别分子。核酸适配体的应用主要包括在化学研究检测系统中作为分子识别元件，在生物样品分离富集过程中作为能够与靶目标发生特异性结合的配基以及在医学上用于临床诊断和治疗。Chris Le等将适配体固定在毛细管中，用于蛋白质混合物中细胞色素C 的分离与检测，基于细胞色素C 的核酸适配体通过非共价键结合在有机聚合物整体柱基质上实现了对细胞色素C 和凝血酶的分离与检测。目前，基于不饱和烯基自由基聚合引入氨基链霉素，再与链接核酸适配体的生物素特征结合，核酸适配体修饰在一维碳链聚合结构上，形成的聚合物结构为一维结构低交联度形成的二维网状结构。构建高度交联立体结构的核酸适配体功能化聚合整体柱有待取得突破。
[0005] 纳米复合材料是以聚合基体为连续相，将纳米尺寸的粒子或含有孔径的功能材料等分散相均匀分散于基体材料中，形成含有纳米尺寸材料的均一相复合体系。环四硅氧烷丙烯酸酯具有由-Si-O-交替连接的硅氧骨架组成的平面八元环型无机内核，平面八元环型环上拥有三个支化短链，链端含有环氧基团，通过这些支化结构上的环氧基团与功能试剂发生接枝或者聚合反应，可以实现分子层上的高度分散和功能化。引入环四硅氧烷丙烯酸酯，在八元环型上键合修饰核酸适配体功能分子，发展具有纳米孔穴的高度交联聚合结构的核酸适配体功能化整体材料，提供稳定的环状构型和高密度修饰的核酸适配体，可实现对特征生物样品的分离、富集和纯化。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱及制备方法。所述整体柱是先以环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体和丙烯酸酯交联剂聚合形成带有环氧基的支化结构的固定相，然后开环加成，柱后修饰对赭曲霉毒素特异识别的核酸适配体；所述的环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体为2-羟基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,8-三(丙基缩水甘油醚)-2-环四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯；所述的核酸适配体为5'-NH2-C6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA；所述的核酸适配体与环硅氧烷丙烯酸酯聚合物表面支化分布的环氧基开环进一步加成，实现缩合偶联；所制备的整体柱基质固定相具有环硅氧烷八元环型结构、支化分布环氧基，结构稳定，与核酸适配体的5’-氨基作用位点多、位阻小，实现对赭曲霉毒素A核酸适配体的高效键合。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，所述的整体柱先以环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体和丙烯酸酯交联剂在烯基化的毛细管中热引发聚合，形成具有高度交联、带有环氧基的支化结构的环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相，在此基础上，对环氧基团进行氨基开环加成，柱后衍生核酸适配体制得；所述的整体柱固定相表面键合对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体。
[0009] 其中，所述的对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体在平面八元环型环硅氧烷支化分布的环氧基上开环加成，实现高度交联缩合；所述的特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱同时含有平面八元环型硅氧烷无机内核结构、胺基羟基共存的R1-NH-CHR2-OH极性基团以及对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体；其中R1为核酸适配体，R2为环硅氧烷丙烯酸酯。
[0010] 按质量百分数之和为100%计，所述的毛细管整体柱基质固定相各组分所占质量百分比为：环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体31.85% 37.83%，丙烯酸酯交联剂6.97% 12.95%，致~ ~孔剂由正丙醇和1,4-丁二醇二元体系组成，其中正丙醇16.92% 20.90%，1,4-丁二醇33.85%~
37.83%，引发剂0.45%。
~
[0011] 所述的环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体为2-羟基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,8-三(丙基缩水甘油醚)-2-环四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯；
[0012] 所述的丙烯酸酯交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯；
[0013] 所述的引发剂为偶氮二异丁氰；
[0014] 所述的对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体为5'-NH2-C6-GATCGGGTGTGGGTG GCGTAAAGGGAGCATCGGACA。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种制备上述特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱的方法，包括以下步骤：
[0016] （1）毛细管柱壁表面烯基化：
[0017] 对毛细管空柱依次采用0.1mol/L的盐酸溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液冲洗3小时，去离子水冲洗15分钟、甲醇冲洗15分钟，在50℃下氮气吹干；注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷体积比为1∶1的混合物，在60℃下反应12小时，用甲醇冲洗15分钟；在70℃下氮气吹干，制得柱壁表面烯基化的毛细管；
[0018] （2）环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相的制备：
[0019] 按比例称取环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体、丙烯酸酯交联剂、致孔剂及引发剂，混合均匀，超声振荡15分钟，然后将混合物注入经烯基化预处理过的毛细管中，控制注入的液柱的长度为28 32厘米，两端封闭并浸于60℃水浴锅中恒温加热20小时；待反应完成后，以~甲醇为流动相，在液相色谱泵上冲洗毛细管柱2小时，冲去床层内残留的溶剂、再将毛细管柱在泵压12Mpa状态下平衡10 15小时，得到环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相；
~
[0020] （3）核酸适配体修饰的聚合整体柱制备
[0021] 将5′端带氨基的核酸适配体使用前3000r/min离心5分钟，加入Tris-HCl缓冲液稀释到100 μmol/L，涡旋震荡溶解核酸适配体，放置于90℃恒温水浴锅加热3分钟，室温条件下自然冷却约30分钟；采用液相泵将冷却后的核酸适配体溶液通入步骤（2）制备的环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相，60℃恒温反应1小时，使管壁表面上环氧基与适配体分子链5′端的氨基发生缩合反应；反应后用水冲洗30min，除去残留的核酸适配体之后，通入Tris-HCl缓冲液，即制得表面核酸适配体键合修饰的聚合整体柱。
[0022] 其中，所述步骤（3）中的Tris-HCl缓冲液组成为：10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl以及20mmol/L CaCl2，pH=8.00。
[0023] 本发明的显著优点在于：
[0024] （1）本发明所述的一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体与环氧基环四硅氧烷聚合物表面支化分布的环氧基开环进一步加成，基体中硅氧烷分散相均匀分散，具有由Si-O交替连接的纳米尺寸的八元环型无机内核构型，环氧基支化分布，形成高度交联三维结构，5’-氨基核酸适配体在支化分布的环氧基开环加成缩合，与核酸适配体的5’-氨基作用位点多、位阻小，提高了聚合物骨架稳定性和对赭曲霉毒素A核酸适配体的高效键合。
[0025] （2）本发明所述的一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，以环氧基环四硅氧烷聚合形成环氧基支化分布的有机聚合物，每个八元环型环硅氧烷单体分子上具有三个支化碳链独立分布的环氧基作用位点，与带有5’-NH2的核酸适配体作用，每个八元环型环硅氧烷单体分子均可立体地引入核酸适配体，形成高度交联的氨基开环键合核酸适配体的有机聚合固定相，提高了氨基核酸适配体的修饰键合效率。
[0026] （3）本发明中所述的对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体在平面八元环型环硅氧烷支化分布的环氧基上开环加成，实现高度交联缩合；所述的特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱同时含有平面八元环型硅氧烷无机内核结构、胺基羟基共存的（R1-NH-CHR2-OH）极性基团（R1：核酸适配体；R2：环硅氧烷丙烯酸酯）和对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体，可以比单一功能单体纳米复合整体柱提供更多的作用模式，实现亲水、氢键、适配体生物识别作用等模式，适用于极性赭曲霉毒素A的高效特异识别。
[0027] 图1（A）为未修饰核酸适配体的基质固定相对赭曲霉毒素A的识别，（B）为环氧基水解固定相对赭曲霉毒素A的识别；
[0028] 图2是核酸适配体修饰整体柱特异识别赭曲霉毒素A，峰1为赭曲霉毒素A。
具体实施方式
[0029] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0030] 实施例1
[0031] 一种特异识别赭曲霉毒素的有机聚合整体柱，所述的整体柱先以环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体和丙烯酸酯交联剂在烯基化的毛细管中热引发聚合，形成具有高度交联、带有环氧基的支化结构的环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相，在此基础上，对环氧基团进行氨基开环加成，柱后衍生核酸适配体制得；所述的整体柱固定相表面键合对赭曲霉毒素A特异识别的核酸适配体。
[0032] 表1 环氧基环硅氧烷丙烯酸酯聚合整体柱固定相的不同组分含量表[0033]
[0034] *：环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体为2-羟基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,8-三(丙基缩水甘油醚)-2-环四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯。
[0035] 按表1所示的组分含量表制备毛细管整体柱基质固定相，其制备方法如下：
[0036] （1）毛细管柱壁表面烯基化：
[0037] 对毛细管空柱依次采用0.1mol/L的盐酸溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液冲洗3小时，去离子水冲洗15分钟、甲醇冲洗15分钟，在50℃下氮气吹干；注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷体积比为1∶1的混合物，在60℃下反应12小时，用甲醇冲洗15分钟；在70℃下氮气吹干，制得柱壁表面烯基化的毛细管。
[0038] （1）环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相的制备：
[0039] 按比例称取环氧基环硅氧烷丙烯酸酯单体、丙烯酸酯交联剂、致孔剂及引发剂，混合均匀，超声振荡15分钟，然后将混合物注入经烯基化预处理过的毛细管中，控制注入的液柱的长度为28 32厘米，两端封闭并浸于60℃水浴锅中恒温加热20小时；待反应完成后，以~甲醇为流动相，在液相色谱泵上冲洗毛细管柱2小时，冲去床层内残留的溶剂、再将毛细管柱在泵压12Mpa状态下平衡10 15小时，得到得到环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相。
~
[0040] （2）核酸适配体修饰的聚合整体柱制备
[0041] 将5′端带氨基的核酸适配体使用前3000r/min转速离心5分钟，加入缓冲液稀释到100 μmol/L，涡旋震荡溶解核酸适配体，放置于90℃恒温水浴锅加热3分钟，室温条件下自然冷却约30分钟；采用液相泵将上述的核酸适配体溶液通入步骤（2）制备的环氧基环硅氧烷聚合整体柱基质固定相，60℃恒温反应1小时，完成管壁表面上环氧基与适配体分子链5′端的氨基发生缩合反应。反应后用水冲洗30min，除去残留的核酸适配体之后，通入采用pH=
8.00、含有10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl和20mmol/L CaCl2的Tris-HCl缓冲液，即制得表面键合核酸适配体键合修饰的聚合整体柱。
[0042] 实施例2
[0043] 应用未修饰核酸适配体的基质固定相和环氧基水解固定相，按以下步骤实施：（1）平衡：对于配方B所制得的整体柱先用结合缓冲液平衡1小时，色谱条件为流速0.10 mL/min，压力250psi，所述的结合缓冲液pH 8.00，含有10mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2；（2）富集：将20微升的0.50μg/mL 赭曲霉毒素A（OTA）溶液注入，在整体柱上富集1小时，色谱条件为0.05 mL/min，压力250psi；（3）清洗：将富集柱装到液相色谱泵上，用结合缓冲液对未修饰核酸适配体的基质固定相和环氧基水解固定相分别清洗14小时、10小时；洗脱条件为流速0.03 mL/min，压力500psi，收集最后30分钟的清洗液待查；（4）洗脱：采用甲醇洗脱，洗脱条件为流速0.10mL/min，压力500psi，洗脱1小时，收集1小时的洗脱液待查。应用配方B所制得的整体柱，采用HPLC-荧光检测器上检测收集液，赭曲霉毒素A未见有效保留（图1）。
[0044] 应用核酸适配体键合配方B制备的整体柱，制得核酸适配体键合整体柱，按以下步骤实施：采用液相泵将上述的核酸适配体溶液通入配方B制备的整体柱，60℃恒温反应1小时，反应后用水冲洗30min，除去残留的核酸适配体之后，通入采用pH=8.00、含有10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl和20mmol/L CaCl2的Tris-HCl缓冲液，即制得表面键合核酸适配体键合修饰的聚合整体柱。
[0045] 应用核酸适配体键合的配方B整体柱，按以上平衡、富集和清洗步骤实施，其中结合缓冲液对核酸适配体键合的配方B整体柱清洗4小时即可清洗干净；采用100%甲醇洗脱可以将核酸适配体键合的配方B整体柱所保留的OTA有效洗脱下来，实现了核酸适配体键合的配方B整体柱对OTA的特异识别和有效保留与分离（图2），图2中洗脱峰为： 1. 赭曲霉毒素A（OTA）。
[0046] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
