一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法转让专利
申请号 : CN201710001527.X
文献号 : CN106749539B
文献日 : 2019-10-15
发明人 : 江锡铭 , 丁金国 , 黄臻辉
申请人 : 上海上药第一生化药业有限公司
摘要 :
本发明公开了一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法。该制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为硅胶C18；所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为含两游离巯基的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品。本发明创新性运用了反相吸附法环化、纯化和脱盐，一次性解决环化、纯化和脱盐的问题，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。
权利要求 :
1.一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为硅胶C18；
所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为含两游离巯基的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品；
所述的缩宫素脱酰胺杂质为
所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐的条件如下：流动相A1为纯水，A2为体积百分比
0.01～0.05％的H2O2 的NaOH水溶液，pH 为7.5 ～9.0 ，流动相B为乙腈，流动相C为所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液，流速为80～110mL/min，检测波长为220nm；
按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；
洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B 收集保留时间为50～65min的洗脱液得到缩宫素脱酰胺杂质溶液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品，HPLC纯度为60～90％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品的结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸盐。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液为缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐均是在一步的反相洗脱过程中完成。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的A2为体积百分比0.02～0.03％的H2O2的NaOH水溶液，pH为7.5～9.0。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的流速为100mL/min。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相反相色谱法的装填条件如下：填料为Kromasil硅胶C18，孔径10nm，粒径10μm。
说明书 :
一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法。
背景技术
[0002] 缩宫素，又称催产素，英文名为Oxytocin，结构式：
[0003]
[0004] 分子式为：C43H66N12O12S2，分子量为1007.2
[0005] 缩宫素用于引产、催产、产后及流产后因宫缩无力或缩腹不良而引起的子宫出血；了解胎盘储备功能(催产素激怒试验)；滴鼻可促使排乳。缩宫素能间接刺激子宫平滑肌收缩，模拟正常分娩的子宫收缩作用，导致子宫颈扩张，子宫对缩宫素的反应在妊娠过程中逐渐增加，足月时达高峰。缩宫素也可刺激乳腺的平滑肌收缩，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量。
[0006] 就一个药品而言，其中所含的少量杂质是引发药品副作用最重要的原因，因此对其纯度的检查是保证药品安全有效性的重要基础之一，而纯度检查的内容，根据各个药物的性质和特点有些不同，但基本上均要涉及各自的“有关物质”检查研究。合成多肽的有关物质主要来自合成过程中的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等杂质，尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质(如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等)与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。研究表明合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺和肽链C段酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下)。
[0007] 由于合成多肽中有些杂质的性质与目标产品非常接近，因此建立适宜的方法充分检出这些杂质是合成多肽药物有关物质研究中面临的巨大困难。
[0008] 目前国内缩宫素脱酰胺杂质大多先是采用固相合成保护缩宫素树脂，再经过裂解干燥得缩宫素脱酰胺杂质前体粗品(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸盐)，高度稀释环化，纯化，转盐等步骤，最终得到缩宫素脱酰胺杂质。高度稀释环化由于样品浓度稀，体积庞大，对于后期纯化很不利。现在还缺乏一种有效的制备含二硫键的多肽原料药类似物的方法，因此仍然迫切需要开发新的含二硫键多肽的制备方法。
发明内容
[0009] 本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中缩宫素脱酰胺杂质的制备工艺复杂、收率低、样品浓度稀、体积庞大的缺陷，而提供了一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法。本发明的缩宫素脱酰胺杂质的制备方法以含一对游离巯基(-SH)的多肽粗品——缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为起始原料，经过高压液相反相色谱环化、纯化和脱盐步骤，制备高纯度的缩宫素脱酰胺杂质的方法。本发明的多肽是缩宫素制备过程中的1个关键杂质，因此可作为缩宫素检测过程的标准对照品，对缩宫素以及杂质进行定性和定量分析，对于提高缩宫素的质量标准，控制产品质量具有重要意义。
[0010] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
[0011] 本发明提供了一种缩宫素脱酰胺杂质的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液依次进行反相环化、反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为硅胶C18；
[0012] 所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为含两游离巯基的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品；
[0013] 所述的缩宫素脱酰胺杂质为
[0014] 其中，所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品较佳地为采用固相合成法经过裂解干燥制得的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品，HPLC纯度为60～90％；所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品的结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸盐。
[0015] 其中，所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液较佳地为缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
[0016] 本发明中，所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐均是在一步的反相洗脱过程中完成。
[0017] 其中，所述的反相环化、反相纯化、反相脱盐的条件优选如下：流动相A1为纯水，A2为体积百分比0.01～0.05％(较佳的为0.02～0.03％)的H2O2pH为7.5～9.0的NaOH水溶液，流动相B为乙腈，流动相C为所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液，流速为80～110mL/min(较佳的为100mL/min)，检测波长为220nm；
[0018] 按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；
[0019]洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B
[0020] 收集保留时间为50～65min的洗脱液得到缩宫素脱酰胺杂质溶液。
[0021] 其中，所述的高效液相反相色谱法的装填条件优选如下：填料为Kromasil硅胶C18，孔径10nm，粒径10μm。
[0022] 缩宫素脱酰胺杂质是一种多肽物质，在碱性条件下不稳定，易降解，尤其是强碱环境下，本发明综合考察了碱洗脱的浓度和时间，以保证减少脱盐过程中样品的破坏及损失。
[0023] 本发明创新点在于将环化、纯化和脱盐一步反相得到多肽纯品，缩宫素脱酰胺杂质前体粗品中含有两游离巯基，传统工艺环化和纯化分步进行，而且环化的体积庞大，增加了纯化的难度，为了快速高效的环化和制备工艺，设计出硅胶C18填料的最新应用。本发明创新性运用了反相吸附法环化、纯化和脱盐，一次性解决环化、纯化和脱盐的问题。
[0024] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0025] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0026] 本发明的积极进步效果在于：
[0027] (1)本发明采用在线环化的方法，先将还原型多肽粗品吸附到固定相上，利用多肽和反相填料的疏水结合，在色谱柱上中性洗脱弱结合的酸根离子，并采用pH偏碱的含H2O2的流动相冲洗，促使两巯基成二硫键，获得目标多肽粗品，样品保留在色谱柱上。
[0028] (2)本发明采用在线环化，环化的样品避免洗脱，可直接变换流动相后进行梯度洗脱纯化，得到最终的纯品，适合连续的生产。
[0029] (3)本发明创新性地运用了反相吸附环化、纯化、脱盐一步法制得多肽纯品，优化了生产工艺，适合工业化连续生产。
具体实施方式
[0030] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0031] 下述实施例中，缩宫素脱酰胺杂质为
[0032] 实施例1(HPLC法检测缩宫素脱酰胺杂质前体粗品和纯化中间体溶液纯度及定量)[0033] 仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪
[0034] 分离柱：Waters XBridge-C18，4.6×150mm，5μm
[0035] 流动相：A为体积百分比50％乙腈水溶液，B为0.02M KH2PO4 pH 3.0水溶液，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，室温检测，洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
[0036]洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～15min 35％A+65％B
2 15～25min 35％A+65％B→100％A
3 25～28min 100％A
4 28.0～28.1min 100％A→35％A+65％B
5 28.1～32min 35％A+65％B
1 0～15min 35％A+65％B
2 15～25min 35％A+65％B→100％A
3 25～28min 100％A
4 28.0～28.1min 100％A→35％A+65％B
5 28.1～32min 35％A+65％B
[0037] 实施例2(50mm内径L&L4002制备柱装填)
[0038] 运用Load&Lock动态轴向压缩和静态锁紧技术，填料为硅胶C18(Kromasil C18)，孔径10nm，粒径10μm，装柱密度0.66g/mL，装填至柱床压力133bar，采用Varian色谱装填系统，325g干粉填料，650mL异丙醇搅拌匀浆后，倒入内径50mm L&L4002制备柱，压缩比为1.5:1，载气为N2，调节载气压力使得油压表压力为200bar，动态轴向压缩至柱床高度25.5cm，作为反相环化、反相纯化和反相脱盐方案所用的制备柱。
[0039] 实施例3缩宫素脱酰胺杂质前体粗品原料的反相环化、反相纯化和反相脱盐[0040] 仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
[0041] 色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock4002 50×255mm，C18 10μm10nm[0042] 缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸盐。
[0043] 缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液为上述缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
[0044] 流动相A1为纯化水，A2为体积百分比0.02的H2O2pH为7.5的NaOH水溶液，流动相B为乙腈，流动相C为所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为82.25％，保留时间为9.20min。
[0045] 本实施例的反相环化、反相纯化和反相脱盐条件如下：流速100mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
[0046]洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B
[0047] 收集保留时间为50～65min的洗脱液得到缩宫素脱酰胺杂质溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.52％，保留时间为6.56min。
[0048] 实施例4缩宫素脱酰胺杂质前体粗品原料的反相环化、反相纯化和反相脱盐[0049] 仪器：Varian SD-1高压液相制备系统
[0050] 色谱柱：实施例2自装的制备柱Load&Lock4002 50×255mm，C18 10μm10nm[0051] 缩宫素脱酰胺杂质前体粗品为采用固相合成法经过裂解干燥制得的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品，结构式为Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸盐。
[0052] 缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液为上述缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。
[0053] 流动相A1为纯化水，A2为体积百分比0.03的H2O2 pH为9.0的NaOH水溶液，流动相B为乙腈，流动相C1为所述的缩宫素脱酰胺杂质前体粗品溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为82.25％，保留时间为9.20min。
[0054] 本实施例的反相环化、反相纯化和反相脱盐条件如下：流速100mL/min，220nm检测，纯化洗脱梯度见下表所示，百分比为体积百分比。
[0055]洗脱步骤 洗脱时间 洗脱液
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B
1 0～10min 100％C
2 10～25min 95％A1+5％B
3 25.1～30min 95％A2+5％B
4 30.1～35 95％A1+5％B
5 35～50min 95％A1+5％B→80％A1+20％B
6 50～65min 80％A1+20％B→73％A1+27％B
7 65～75min 50％A1+50％B
8 75～80min 95％A1+5％B
[0056] 收集保留时间为50～65min的洗脱液得到缩宫素脱酰胺杂质溶液，按实施例1的方法测定其HPLC纯度为99.50％，保留时间为6.55min。
[0057] 实施例5(缩宫素脱酰胺杂质的质谱检测)
[0058] 采用waters micromass ZQ单重四级杆电喷雾质谱(ESI-MS)测定实施例3、4得到的缩宫素脱酰胺杂质的分子质量峰[M+1]+测定值1009.31，主要离子碎片峰[M+2]2+测定值505.17，都符合理论值1008.2。