用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片

摘要

本发明提供一种用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片，其包括：依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为微阀控制层、微阀薄膜层以及带有多个功能区的基板。微阀控制层上设有贯通控制层的孔，用于样品流入和流出，以及气体通道，用于气体通入；微阀薄膜层，在气体通道对应的薄膜层区域，在气压控制下可发生弯曲形变；基板上包含三个功能区，分别为杂质过滤区、细胞分离区和单细胞定位和荧光鉴定区。上述三个功能区由三条流体通道连接，每条流体通道的开启与闭合由单独的气体微阀控制。本发明实现了癌症患者血液中循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数，为循环肿瘤细胞分析领域提供了一种有效手段。

权利要求

1.一种用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，包括：依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为微阀控制层、微阀薄膜层以及带有多个功能区的基板；

所述微阀控制层上设有六个贯通控制层的孔以及三条气体通道；其中，三个孔为加样孔，连通基板，用于样品和试剂流入和流出；其余三个孔分别连接三条气体通道，用于注入气体，控制微阀的开启与闭合；

所述微阀薄膜层上设有三个贯通薄膜层的孔，分别与上述微阀控制层的三个加样孔对应连通；

所述基板上设有三个功能区，呈“品”字型排布，分别为杂质过滤区、细胞分离区以及单细胞定位和荧光鉴定区；所述三个功能区由三条主流体通道连通，每条主流体通道的开启与闭合由单独的气体微阀控制；其中，所述杂质过滤区包括前、中、后三个区域，入口处分为两条分支流道，用于样品分流，过滤区内设置有阵列化平行排布的微柱，不同区域相邻两微柱之间间隔不同；所述细胞分离区为一条渐宽的微流体通道，通道宽度从入口至出口逐渐加宽；所述单细胞定位和荧光鉴定区，入口处分为两条分支流道，用于样品分离，该功能区内设置有阵列化平行排布的V形或U形定位单元，用于单细胞的捕获定位及荧光鉴定。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层厚度为2-5毫米，所述气体通道深度为30-100微米。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀薄膜层的厚度为30-50微米。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基板上杂质过滤区的微柱高度为20-30微米，直径为10-40微米。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，在所述杂质过滤区的前、中、后三个区域，相邻两个微柱的间距分别为100微米、50微米和32微米。

6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述杂质过滤区共布置有1500个微柱。

7.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基板上细胞分离区的微流体通道，其深度为20微米，入口宽度为1毫米，出口宽度为7毫米。

8.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基板上单细胞定位和荧光鉴定区，其V形定位单元的高度为20-30微米，最大开口15微米，最小开口3微米，相邻两个定位单元行间距为35微米，列间距为40微米，前后定位单元采用交替式阵列排布。

9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述单细胞定位和荧光鉴定区共布置有6000个V形定位单元。

10.根据权利要求1-9任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述微阀控制层由透明材质制成，所述透明材质包括玻璃、PDMS；所述微阀薄膜层由PDMS材料制成，在气体通道对应的薄膜层区域，在气压控制下可发生弯曲形变；所述基板的材质为硅或硅-玻璃。

11.循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数系统，其特征在于，包括权利要求1-10任一项所述的微流控芯片，荧光探针，荧光成像系统和分析计数系统，泵，单片机控制的气压控制装置。

12.用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，包括盒体、设在盒体内的权利要求

1-10任一项所述微流控芯片，以及设在盒体内的荧光探针，所述荧光探针为多种带有荧光标记的抗体或多肽，所述抗体或多肽可识别肿瘤细胞表面特定的抗原。

说明书

用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片

技术领域

[0001] 本发明涉及微流控芯片技术领域和医学诊断领域，具体地说，涉及一种用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片。

背景技术

[0002] 循环肿瘤细胞(CTC,Circulating Tumor Cell)，是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或者诊疗操作从实体瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC进入外周血后发生凋亡或者被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。近年来的研究表明，CTC存在与否及数量多少是癌症进展和转移的重要指标，检测和跟踪外周血中CTC的数量有助于对患者进行早期筛查、疗效监控、预后判断和复发预测。

[0003] 目前，最常用的CTC检测方法是利用EpCAM(上皮细胞黏附分子)抗体免疫磁珠与细胞表面EpCAM蛋白的结合来富集CTC，再对癌细胞表面特异性蛋白进行免疫标记来鉴定。唯一被美国FDA认证批准的CellSearch就是利用该方法对CTC进行检测的，其检测过程包括样品孵育，细胞分离，免疫荧光标记和人工鉴定这几个主要步骤。许多实验室为了避免采用昂贵的CellSearch系统，研究人员尝试利用试管等廉价仪器进行人工分离和计数。

[0004] 多年的实验室和临床研究证实了上述这类的方法的有效性，但依然有三类问题有待解决:A.较大的处理腔室影响了富集效率；B.不同腔室间的样品转移过程损失细胞；C.人工鉴定判读标准不一；D.检测时间过长。前三类问题影响了CTC技术精确性，后两类问题阻碍了CTC检测技术的临床推广。

[0005] 微流控技术的出现为CTC检测提供了新的手段，微流控技术可以精确控制细胞以及细胞所处的环境(流场、磁场、电场等)，也可以将多个功能集成在一起以尽量避免细胞损失。因此，研究者已经通过设计特殊流道及纳米表面，控制磁场，集成片上荧光染色，结合cofocal等方法来提高富集效率，避免细胞损失和提升鉴定准确率。甚至还通过检测细胞尺寸大小，电学特性等方法，演示了无需抗体的检测。但目前临床实践中最迫切需求的是：1)不受人工判读影响的准确计数；2)快速的自动化检测。虽然微流控技术已经在各个方面都展示了优良的性能，但尚无一个芯片能够同时满足上述两个临床要求。

[0006] 目前，关于微流控芯片中的细胞计数主要涉及到以下三类技术：

[0007] 1、利用荧光显微镜进行人工计数：用微流控芯片对CTC进行捕获，再通过荧光显微镜进行人工计数。由于该技术需要样品在不同腔室之间进行转移，造成难以预计的细胞损失，再加上人工判读标准不一，导致计数精度不高。

[0008] 2、利用流式细胞仪或者共聚焦荧光显微镜等进行自动计数：借助微流控芯片进行CTC捕获，在通过流式细胞仪进行精确计数。该技术避免了人工判读标准不一带来的计数误差，但是不同腔室间的样品转移依然无法避免，细胞损失不可预计。进行自动计数，虽然避免了样品损失和人工判读，但由于设备价格昂贵，一般实验室很难接受，普及难度高。

[0009] 3、利用电场进行细胞计数。通过在微流控芯片中设计相应的测量电极，当细胞通过芯片通道时，不同细胞在电场下的阻抗或者电导率不同，产生不同的波峰，以此达到对目的细胞的计数目的。

[0010] 目前，尚无能够将CTC捕获、鉴定及计数集成于一体的技术。

发明内容

[0011] 本发明的目的是提供一种集成化、多功能微流控芯片，该芯片具有多层结构和多个功能区，可以进行血液杂质过滤、CTC捕获和定位，并实现对定位细胞的原位荧光标记和鉴定。

[0012] 本发明的另一目的是提供一种循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数系统及应用方法。

[0013] 为了实现本发明目的，本发明用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片，其包括：依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为微阀控制层、微阀薄膜层以及带有多个功能区的基板。

[0014] 所述微阀控制层上设有六个贯通控制层的孔以及三条气体通道；其中，三个孔为加样孔，连通基板，用于样品和试剂流入和流出；其余三个孔分别连接三条气体通道，用于注入气体，控制微阀的开启与闭合。

[0015] 所述微阀薄膜层上设有三个贯通薄膜层的孔，分别与上述微阀控制层的三个加样孔对应连通。

[0016] 所述基板上设有三个功能区，呈“品”字型排布，分别为杂质过滤区、细胞分离区以及单细胞定位和荧光鉴定区；所述三个功能区由三条主流体通道连通，每条主流体通道的开启与闭合由单独的气体微阀控制；其中，所述杂质过滤区包括前、中、后三个区域，入口处分为两条分支流道，用于样品分流，过滤区内设置有阵列化平行排布的微柱，不同区域相邻两微柱之间间隔不同；所述细胞分离区为一条渐宽的微流体通道，通道宽度从入口至出口逐渐加宽；所述单细胞定位和荧光鉴定区，入口处分为两条分支流道，用于样品分离，该功能区内设置有阵列化平行排布的V形或U形定位单元，用于单细胞的捕获定位及荧光鉴定。

[0017] 所述微阀控制层厚度为2-5毫米，所述气体通道深度为30-100微米。优选地，所述微阀控制层厚度为5毫米，所述气体通道深度为30微米。

[0018] 所述微阀薄膜层的厚度为30-50微米。

[0019] 所述基板上杂质过滤区的微柱高度为20-30微米，直径为10-40微米。所述微柱为高度20微米，直径40微米的圆柱体。

[0020] 在所述杂质过滤区的前、中、后三个区域，相邻两个微柱的间距分别为100微米、50微米和32微米。优选所述杂质过滤区共布置有约1500个微柱。

[0021] 所述基板上细胞分离区的微流体通道，其深度为20微米，入口(最窄处)宽度为1毫米，出口(最宽处)宽度为7毫米，从入口到出口流道宽度逐渐变宽。

[0022] 所述基板上单细胞定位和荧光鉴定区，其V形定位单元的高度为20-30微米，最大开口15微米，最小开口3微米，相邻两个定位单元行间距为35微米，列间距为40微米，前后定位单元采用交替式阵列排布。优选地，每个V形定位单元整体长25微米，宽20微米。更优选地，所述单细胞定位和荧光鉴定区共布置有约6000个V形定位单元。

[0023] 所述微阀控制层由透明材质制成，所述透明材质包括玻璃、PDMS。所述微阀薄膜层由PDMS材料制成，在气体通道对应的薄膜层区域，在气压控制下可发生弯曲形变。所述基板的材质为硅或硅-玻璃。

[0024] 由于对细胞进行鉴定时，需要光线透过微阀控制层和微阀薄膜层，所以微阀控制层和微阀薄膜层需要采用透明材质；同时，控制层和薄膜层需要制作流体进入和流出的接口，所以需要能够开孔；另外，由于是通过气体挤压薄膜产生弯曲形变，达到微阀开关的目的，所以微阀薄膜层材质必须是弹性较好的软材料；最后，控制层需要和薄膜层封接在一起，并且实现密封，所以材质的选择上要考虑和薄膜层的兼容性。优选的材料是那些可以通过蒸镀、切割及热塑成型制成特定规格及形状的材料。特别优选的是较薄并透明的聚合物。微阀控制层和微阀薄膜层的外廓尺寸应与基板相匹配。

[0025] 本发明还提供循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数系统，包括上述微流控芯片，荧光探针，荧光显微镜(荧光成像系统)、自主开发的图像分析软件(分析计数系统)，泵，单片机控制的气压控制装置等。

[0026] 本发明还提供一种用于鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，包括盒体、设在盒体内的上述微流控芯片，以及设在盒体内的荧光探针，所述荧光探针为多种带有荧光标记的抗体或多肽，所述抗体或多肽可识别肿瘤细胞表面特定的抗原。

[0027] 本发明进一步提供一种循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数的方法，包括以下步骤：

[0028] S1、将癌症患者血液与结合有上皮细胞黏附因子(EpCAM)抗体的免疫磁珠混合孵育之后，通过微泵注入到微流控芯片中，同时关闭单细胞定位及荧光鉴定模块微阀，打开杂质过滤和细胞分离模块微阀。当血液流经杂质过滤模块时，由于尺寸大小作用，血液中不同尺寸的杂质(大于32微米)会被微柱阻挡在该模块，而尺寸较小的血细胞则很容易流入下一模块。

[0029] S2、经微柱过滤过的血液进入细胞分离模块时，血液中与免疫磁珠特异结合的EpCAM阳性细胞在磁场(所述磁场来自于外加磁铁)作用下将会被捕获在微流道中，其他血细胞将随着血液流动从细胞分离区流出并被收集。

[0030] S3、当全部血液全都注入到微流控芯片之后，关闭杂质过滤模块微阀，打开定位模块微阀，从细胞分离模块的出口注入磷酸缓冲溶液，将该模块中被捕获的细胞冲到下一模块中，即单细胞定位及荧光鉴定模块。进入这一模块的细胞将被V形捕获结构以单细胞形式捕获、定位。之后，再向该模块通入多种带有荧光标记的抗体或多肽，抗体(或多肽)会和某些细胞表面特定的抗原(或蛋白)结合，使用荧光显微镜从芯片正面对整个定位模块进行全覆盖自动化荧光成像，获取荧光图像。利用自主研发的图像处理软件，对获取的荧光图像进行自动化分析，从而得到癌症患者血样中CTC的数目。

[0031] 本发明具有以下优点：

[0032] (一)实现了对循环肿瘤细胞的精确捕获、鉴定和自动化计数。首先，与传统技术相比，本发明通过设计宽度逐渐增加的微流道来分离血液中的CTC，由于样品需要在仅有20微米深的微流道中流动，其所受到的磁场力高于传统方式，更多的细胞将会被捕获到。同时，样品在微流道中的流速从入口到出口逐渐减慢，使得结合有不同磁珠数量的EpCAM阳性细胞可以在流道的不同地方被捕获且分布均匀；另外，从样品准备到CTC自动化计数，所有操作均在芯片上执行，避免了样品在不同腔室间的转移带来的不可预计的细胞损失；最后，通过自主开发用于CTC计数的自动化分析软件，采用统一标准对荧光图像中的细胞进行自动化鉴定和计数，避免了人工鉴定和计数带来的人为误差。这些都大大提高了细胞计数的精确度。

[0033] (二)实现了对样品高通量快速处理。本发明自动化程度高，从样品注入到荧光成像再到图像处理，整个过程自动化，大大减少了人工操作，节省了大量的人力和时间。另外，本发明引入了微流控技术，利用微加工技术可以根据需要设计多个并联的功能区，可以大大提高处理速度和通量。

[0034] (三)本发明设计的芯片及相应系统适用范围广。本发明中所涉及的微柱阵列、V形捕获阵列，其尺寸可以根据不同的细胞进行调整，灵活程度高，且不增加成本。

附图说明

[0035] 图1为本发明用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片的结构分解示意图。

[0036] 图2为本发明微流控芯片所对应三层结构的俯视角度透视图。

[0037] 图3为图1中三层结构封装后的俯视角度透视图。

[0038] 图4为图1中基板三个功能区的局部结构放大图。

[0039] 图5为本发明微流控芯片的基板上杂质过滤、细胞分离、单细胞捕获定位及鉴定的流程示意图。

[0040] 图1-图5仅为示意图，未按实际比例绘制。图中，1-微阀控制层；2-微阀薄膜层；3-带有三个功能区的基板；4,5,6-样品出入口；7,8,9-气体入口；10-杂质过滤模块(杂质过滤区)；11-细胞分离模块(细胞分离区)；12-单细胞定位及鉴定模块(单细胞定位和荧光鉴定区)；13-气体通道；14-用于杂质过滤的微柱；15-分离区流道中分离的细胞；16-用于单细胞定位的V形定位结构单元；17-定位在V形结构中的单细胞。

具体实施方式

[0041] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0042] 实施例1用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片

[0043] 本实施例提供的用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片，包括：依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为微阀控制层、微阀薄膜层以及带有多个功能区的基板。

[0044] 1、微阀控制层和微阀薄膜层

[0045] 微阀控制层上设有六个贯通控制层的孔以及三条气体通道；其中，三个孔为加样孔，连通基板，用于样品和试剂流入和流出；其余三个孔分别连接三条气体通道，用于注入气体，控制微阀的开启与闭合。

[0046] 微阀薄膜层上设有三个贯通薄膜层的孔，分别与上述微阀控制层的三个加样孔对应连通。

[0047] 微阀控制层和微阀薄膜层的外廓尺寸应与基板相匹配。

[0048] 图1和图5所示的微流控芯片，微阀控制层和微阀薄膜层均采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料，通过软光刻技术获得需要的控制层气体通道和薄膜厚度，二者采用键合的方式密封连接。在其它的实施方法中，微阀控制层也可以采用玻璃材料，利用湿法刻蚀或者激光刻蚀等技术获得气体通道，再通过键和的方式将二者封接在一起。

[0049] 图1和图5所示的微流控芯片，微阀控制层的厚度为5000微米，气体通道的深度为30～100微米，微阀薄膜层的厚度为30～50微米，这是有效控制微阀开关的最优范围。当需要微阀控制开关的流道长度、宽度以及深度发生变化时，可由本领域技术人员根据需要自行选择合适的气体通道和微阀薄膜尺寸。

[0050] 2、带有微柱阵列和V形定位阵列的基板

[0051] 本实施例中，所述基板上设有三个功能区，呈“品”字型排布，分别为杂质过滤区、细胞分离区以及单细胞定位和荧光鉴定区；所述三个功能区由三条主流体通道连通，每条主流体通道的开启与闭合由单独的气体微阀控制；其中，所述杂质过滤区包括前、中、后三个区域，入口处分为两条分支流道，用于样品分流，过滤区内设置有阵列化平行排布的微柱，不同区域相邻两微柱之间间隔不同；所述细胞分离区为一条渐宽的微流体通道，通道宽度从入口至出口逐渐加宽；所述单细胞定位和荧光鉴定区，入口处分为两条分支流道，用于样品分离，该功能区内设置有阵列化平行排布的V形或U形定位单元，用于单细胞的捕获定位及荧光鉴定。

[0052] 微柱阵列是用来过滤血液中不同尺寸大小的杂质，V形捕获结构单元阵列则是用来对单个细胞进行捕获定位的，两者都与细胞尺寸相关，是芯片有效进行精确计数的关键部件。为了适应细胞的尺寸，必须选择能够兼容现有微加工技术的材料。在图4所示的优选实施例中，选择硅作为基板微结构阵列的材料，是因为硅可以很好的兼容基于光刻和腐蚀的微加工工艺，而且加工精度易于控制，从而可以很容易的获得和细胞尺寸相符的捕获阵列。本领域技术人员也可以根据需求选择玻璃、PDMS等可加工的材料。需注意的是，为了实现快速、精确的自动化计数，该基板集成了杂质过滤区、细胞分离区和单细胞定位及荧光鉴定区这三个功能区，而这三个功能区及其包含的微结构加工工艺相同，可以在一块硅片上同时一次成型。

[0053] 在图4所示的微流控芯片中，对于杂质过滤区的微柱阵列，每个微柱都是边直径为40微米，高度为20微米的圆柱体，为了适应不同尺寸大小的血液杂质，在功能区的前、中、后三个位置，每两个微柱之间的间距为分别为100微米、50微米和32微米。微柱阵列的整体尺寸为长7毫米，宽6毫米，整个微柱阵列共有1500个微柱(图4中未全部示出)。对于细胞分离区的渐宽流道，从入口到出口，宽度逐渐变宽，入口处宽度最小，为1000微米，出口处最宽，为7000微米，流道全长2.5厘米，深20微米。对于单细胞定位及荧光鉴定区的V形定位阵列，每个V形定位结构单元高20微米，最大开口为15微米，最小开口为3微米，相邻两个定位结构行间距和列间距分别为35微米和40微米。上述是应用于血液中的循环肿瘤细胞的最优条件。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员自行选择合适的尺寸及微结构数量。三个功能区的局部结构放大图见图4。

[0054] 3、封接方法

[0055] 在图1所示的微流控芯片，微阀控制层、微阀薄膜层、基板的材料分别是PDMS、PDMS和硅。采用氧等离子辅助键合的方法可以很好的实现PDMS和PDMS、硅和PDMS之间的良好密封封接。封装后微流控芯片三层结构的俯视角度透视图见图3。

[0056] 在其它的实施方法中，可以根据微阀控制层、微阀薄膜层、基板的材料来选择合适的封接方法。

[0057] 4、芯片配套系统

[0058] 除了微流控芯片之外，还需要荧光探针(Probe)，荧光显微镜(荧光成像系统)、自主开发的图像分析软件(分析计数系统)、泵构成完整的系统，完成对血液样品的处理和循环肿瘤细胞的分离和计数。

[0059] 荧光探针用于鉴定细胞，所述带有荧光的分子探针是标记了荧光分子的抗体或多肽，为了完成对多蛋白鉴定，需要同时使用多种荧光探针来完成对多种蛋白的多重鉴定。在一个优选实施方案中，采用标记了绿色荧光的CK19抗体作为荧光探针，用来识别循环肿瘤细胞表面的CK19蛋白和采用标记了红色荧光的CD45抗体作为荧光探针，用来识别白细胞表面的CD45蛋白。在其它实施方法中，也可以针对不同的蛋白选择不同的抗体或者多肽作为探针。

[0060] 荧光显微镜用于检测微V形定位阵列中的细胞是否有荧光，并对该功能区进行全覆盖荧光成像，获取多通道荧光图像。

[0061] 自主开发的图像处理软件用于分析荧光显微镜获取的图像并获得相应的CTC数量。该软件通过对图像中细胞的大小、面积、长宽比、圆度等参数进行精确计算，筛选出符合要求的CTC，并对CTC进行计数。根据自主编写的算法对定位细胞进行筛选鉴定，鉴定出符合标记荧光特性的循环肿瘤细胞，并进行计数，报告细胞位置和放大细胞图像。

[0062] 泵用于驱动血液样品和相关试剂。

[0063] 单片机控制的氮气供给装置用于输出氮气，提供控制微阀开关所需的气压。

[0064] 5、微流控芯片的制作方法

[0065] 可采用以下两套不同的制作工艺制备所述微流控芯片。

[0066] 制作方法A：

[0067] 微阀控制层：采用4英寸Pyrex7740玻璃片(康宁公司)，在硅片正面光刻出微孔和气体通道的平面位置，采用氢氟酸腐蚀玻璃，形成30微米深的气体通道和孔，利用激光将微孔的位置打穿。最后按照长5厘米，宽3厘米的外形尺寸切成长方形小片。

[0068] 微阀薄膜层：采用N型4英寸硅片，利用旋涂法在其表面涂上一层30微米厚的PDMS液体，待其凝固后脱模取出，按照长5厘米，宽3厘米的外形尺寸切成长方形薄膜。

[0069] 带有硅微柱阵列和V形定位阵列的基板：采用4英寸硅-玻璃键和片(上层为硅，20微米厚；下层为透明玻璃，500微米厚)，在硅层光刻出微柱、渐宽流道和V形定位结构等其他结构的平面形状后，采用ICP干法刻蚀的方法获得20微米高的微柱和V形定位结构，以及20微米深的渐宽流道。将4英寸硅-玻璃键和片按照长5厘米，宽3厘米的外形尺寸切成长方形小片。

[0070] 封接：使用氧等离子体处理透明微阀控制层的底面，微阀薄膜层的两面，硅-玻璃基板的顶面，将他们依次键合在一起，最终获得完整的芯片。

[0071] 芯片系统：在微流体芯片的基础上，使用聚四氟乙烯管连接泵和微阀控制层的流体出入口，用聚四氟乙烯管连接单片机控制的氮气供给装置和微阀控制层的气体通道入口，并将芯片放置在可自动进行荧光成像的正置荧光显微镜下，并在计算机中配备自主研发的图像处理软件用于荧光图像的自动化分析处理，即可完成整套系统的搭建。

[0072] 制作方法B：

[0073] 微阀控制层：采用N型4英寸硅片，在光刻出气体通道的平面形状后，使用ICP干法刻蚀出30微米高的凸体。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出，按照长5厘米，宽3厘米的外形尺寸切成长方形小片，使用打孔器在所需位置打孔，这样就得到了微阀控制层。

[0074] 微阀薄膜层：采用N型4英寸硅片，利用旋涂法在其表面涂上一层30微米厚的PDMS液体，待其凝固后脱模取出，按照长5厘米，宽3厘米的外形尺寸切成长方形薄膜。

[0075] 带有硅微柱阵列和V形定位阵列的基板：采用N型4英寸硅片，在光刻出微柱、渐宽流道和V形定位结构等其他结构的平面形状后，采用ICP干法刻蚀的方法获得20微米高的微柱和V形定位结构，以及20微米深的渐宽流道。将4英寸硅片按照长5厘米，宽3厘米的外形尺寸切成长方形小片。

[0076] 封接：使用氧等离子体处理透明微阀控制层的底面，微阀薄膜层的两面，硅基板的顶面，将他们依次键合在一起，最终获得完整的芯片。

[0077] 芯片系统：在微流体芯片的基础上，使用聚四氟乙烯管连接泵和微阀控制层的流体出入口，用聚四氟乙烯管连接单片机控制的氮气供给装置和微阀控制层的气体通道入口，并将芯片放置在可自动进行荧光成像的正置荧光显微镜下，并在计算机中配备自主研发的图像处理软件用于荧光图像的自动化分析处理，即可完成整套系统的搭建。

[0078] 7、微流控芯片的应用方法

[0079] 从癌症患者抽取2毫升血液，与结合有EpCAM抗体的磁珠混合孵育，然后稀释5倍，通入微流控芯片中。待细胞捕获完成并进行单细胞定位后，向芯片内通入带有蓝色荧光的DAPI，带有红色荧光的CD45抗体和带有绿色荧光的CK19抗体，使用自动化荧光显微镜拍摄图像并通过自主研发的图像处理软件分析计数。不发蓝色荧光的细胞不加处理；同时发蓝色荧光和红色荧光的细胞是白细胞；同时发蓝色荧光、红色荧光和绿色荧光的同样是白细胞；仅发蓝色荧光和绿色荧光的说明是血液中的循环肿瘤细胞。该分析软件既可以获得血液中循环肿瘤细胞的数量，还可以获得每个循环肿瘤细胞在芯片中的位置和相应的放大图像。

[0080] 本发明通过引入微加工技术和微流控技术，并结合自动化图像处理技术，开发了一种多层、多功能微结构芯片，实现了癌症患者血液中循环肿瘤细胞捕获、鉴定和自动化计数，为循环肿瘤细胞分析领域提供了一种有效手段，能够更快，更准确，更高通量的获取循环肿瘤细胞并进行计数。

[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。