利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。所述菌株是在大肠杆菌染色体上异源表达来自伸长盐单胞菌中的ectABC基因簇，重构四氢嘧啶合成通路，构建无质粒系统，利用木糖启动子诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，同时结合T7强启动子系统启动目的基因高效表达，从而达到摇瓶发酵20‑28h后四氢嘧啶的产量达到了12‑16g/L，5L发酵罐发酵24‑40h后四氢嘧啶的产量达到了35‑50g/L的效果。

权利要求

1.一株生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以E. coli W3110，编号ATCC 27325为宿主细胞，其仅包含如下改造：T7启动子控制的来自伸长盐单胞菌的ectABC基因；thrA、iclR 两个基因缺陷型；T7启动子控制的来自谷氨酸棒状杆菌的lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；木糖启动子PxylF控制的来源于T7 噬菌体的RNA聚合酶；

所述ectABC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示;所述lysC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示;所述thrA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示;所述iclR基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示;所述ppc基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.8所示。

2.如权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，所述伸长盐单胞菌编号CGMCC No. 1.6329。

3.如权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示;所述trc启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.7所示;所述PxylF的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.9所示;所述来源于T7 噬菌体的RNA聚合酶的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.10所示。

4.权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：（1）以 E. coli W3110为出发菌株，敲除thrA、iclR 基因；

（2）ppc 基因启动子的替换为trc 启动子

（3）T7 RNA聚合酶的表达：构建木糖启动子PxylF和T7 RNA聚合酶T7RNAP的连接片段，并表达；

（4）L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径的构建：

①构建T7启动子和ectABC基因的连接片段T7-ectABC，并表达；

②构建T7启动子和lysC基因的连接片段T7- lysC，并表达。

5.权利要求1所述的一株生产四氢嘧啶的基因工程菌在生产四氢嘧啶中的应用。

6.权利要求5所述应用，其特征在于，摇瓶发酵生产四氢嘧啶步骤如下：（1）种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，37℃，200 rpm培养7 h；

（2）摇瓶发酵培养：按10-15%接种量接种发酵培养基，37℃，200 rpm培养20-28 h；维持pH在7.2，缺糖时补加60%葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵初始添加终浓度5-15 g/L的木糖溶液诱导目的基因表达。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，

所述种子培养基组成为：蔗糖20-30 g/L，(NH4)2SO4 1-5 g/L，KH2PO4 1-5 g/L，MgSO4·

7H2O 1-2 g/L，酵母粉 5-10 g/L，玉米浆 1-3 mL/L，FeSO4·7H2O 1-3 mg/L，MnSO4·H2O 1-

3 mg/L，其余为水，pH7.0；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖20-40 g/L，(NH4)2SO4 1-3 g/L，KH2PO4 1-3 g/L， MgSO4·7H2O 1-2 g/L，酵母粉0.1-0.3 g/L，玉米浆1-2 mL/L，FeSO4·7H2O 80-100 mg/L，MnSO4·7H2O 80-100 mg/L，其余为水，pH7.0。

8.权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵罐发酵生产四氢嘧啶步骤如下：（1）斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养

15-18 h，转接第二代斜面培养12 h；

（2）种子培养：取适量无菌水于斜面，将菌悬液接入种子培养基中，pH 7.0；温度36℃；

溶氧在25-35%之间，培养至细胞干重达到5-6 g/L；

（3）发酵培养：按照15-20%接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0；温度维持在36℃；溶氧在25-35%之间；

发酵初始添加终浓度为5-15 g/L的木糖溶液，诱导目的基因表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80%的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-2 g/L，发酵周期24-40 h。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，

活化斜面培养基组成为：蔗糖 1-3 g/L，Tryptone5-10 g/L，牛肉膏 5-10 g/L，Yeast Extract 2-5 g/L，NaCl 2-5 g/L，琼脂条 15-30 g/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15 min；

所述种子培养基组成为：葡萄糖 15-30 g/L，Yeast Extract 5-10 g/L ，Tryptone 5-

10 g/L， KH2PO4 5-15 g/L，MgSO4·7H2O 2-5 g/L，FeSO4·7H2O 5-15 mg/L，MnSO4·H2O 5-

15 mg/L，VB1 1-3 mg/L，VH 0.1-1 mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15 min；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 15-25 g/L，Yeast Extract 1-5 g/L，Tryptone 1-5 g/L，柠檬酸钠 0.1-1 g/L，KH2PO4 1-5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1 g/L，FeSO4·7H2O 80-100 mg/L，MnSO4·H2O 80-100 mg/L，VB1 0.5-1 mg/L，VH 0.1-0.5 mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃灭菌15 min。

说明书

利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其应用

技术领域：

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用木糖诱导产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。背景技术：

[0002] 四氢嘧啶(1,4,5,6-2-甲基-4-嘧啶羧酸)，是由N-乙酰化的二氨基丁酸通过分子内脱水而形成的一种环状氨基酸，最早作为一种渗透压补偿性溶质，发现于能进行光合作用的极端外硫红螺菌。经过多年的研究，学者们在不同的嗜盐真菌中也发现了四氢嘧啶。

[0003] 近来，四氢嘧啶的渗透保护功能以及在其他领域内的应用越来越受到人们的重视。研究发现，四氢嘧啶可以作为稳定剂去保护和稳定酶、核酸、DNA等生物大分子抵抗高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境。目前四氢嘧啶已经在酶制剂、基因工程、医疗、化妆品等领域有着重要的用途。

[0004] 在酶制剂领域的应用：通常工业生产过程中，工艺的理化条件并不能保证总是处在酶反应的最佳条件，这就需要酶制剂能够在不同的温度和盐度等逆环境下保持良好的活性，而四氢嘧啶能够帮助这些蛋白质大分子在逆环境下保持活性。

[0005] 在基因工程技术领域的应用：目前，控制四氢嘧啶合成的基因已经在烟草中得到表达，虽然其表达量比较低，但是烟草的耐盐性还是有着一定的提高；此外，四氢嘧啶还能降低DNA的Tm值；对于高G+C含量的模板双链DNA，进行PCR扩增时，如果反应体系加入四氢嘧啶，能够促进PCR反应的进行；

[0006] 在医疗领域的应用：四氢嘧啶不仅可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂，同时对老年痴呆症和帕金森氏病也有一定的预防效果；

[0007] 在化妆品中的应用：基于四氢嘧啶的渗透保护功能，四氢嘧啶可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害。

[0008] 目前四氢嘧啶的生产方法包括发酵法、酶催化法。其中，嗜盐微生物中具有四氢嘧啶的合成途径，因此广泛应用于四氢嘧啶的发酵法生产中。嗜盐菌的四氢嘧啶合成途径为：草酰乙酸—天冬氨酸—天冬氨酸-β-半醛—L-2,4-二氨基丁酸—Nγ-乙酰二氨基丁酸—四氢嘧啶。Grammann等从伸长盐单胞菌中发现了与以往任何渗透调节都不同的系统，包括ectA、ectB、ectC三个基因，这三个基因组成一个操纵子，受共同的启动子调控，分别表达L-
2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶、L-2,4-二氨基丁酸转氨酶和四氢嘧啶合成酶。

[0009] 本发明将来源于嗜盐菌中的四氧嘧啶合成基因ectABC转入非嗜盐菌，在非嗜盐菌中重构四氢嘧啶的合成通路，重组的菌株在中度盐离子浓度或者是低的盐离子浓度的胁迫下就能以葡萄糖为原料催化合成四氢嘧啶。

[0010] 此外，本发明还敲除了乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，增加前体物草酰乙酸的积累量；敲除编码高丝氨酸脱氢酶I的基因thrA，阻止L-天冬氨酸-β-半醛向分支代谢产物苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的支路代谢，使代谢流更多的流向四氢嘧啶途径；通过替换T7强启动子增加目的基因ectABC的表达强度，提高关键酶的活性以增加四氢嘧啶途径的代谢通量；通过替换T7强启动子增加目的基因lysC的表达强度，解除赖氨酸对四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶Ask的反馈抑制，同时回补天冬氨酸激酶，可以实现四氢嘧啶的过量积累；利用木糖启动子(PxylF)诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)，同时结合T7强启动子(Pt7)系统启动目的基因以增强外源基因的表达强度。发明内容：

[0011] 为了实现上述目的，本发明将提供的技术方案之一：是一株生产四氢嘧啶的基因工程菌E.coli ECT06，所述E.coli ECT06菌株是在大肠杆菌染色体上异源表达来自伸长盐单胞菌(CGMCC 1.6329)中的ectABC基因簇，重构四氢嘧啶合成通路，构建无质粒系统，利用木糖启动子(PxylF)诱导来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，同时结合T7强启动子(Pt7)系统启动目的基因高效表达；

[0012] 所述生产四氢嘧啶的基因工程菌，包含T7启动子控制的来自伸长盐单胞菌(CGMCC No.1.6329)的ectABC基因；thrA、iclR两个基因缺陷型；具有T7启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)；

[0013] 所述ectABC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；

[0014] 所述lysC基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所示；

[0015] 所述thrA基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3所示；

[0016] 所述iclR基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4所示；

[0017] 所述T7启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5所示；

[0018] T7终止子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.6所示

[0019] 所述trc启动子的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.7所示；

[0020] 所述ppc基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.8所示；

[0021] 所述PxylF的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.9所示；

[0022] 所述T7RNAP的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.10所示；

[0023] 所述生产四氢嘧啶的基因工程菌以E.coli W3110(ATCC 27325)为宿主细胞；

[0024] 本发明将提供的技术方案之二：是上述生产四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，具体如下：

[0025] (1)以E.coli W3110(ATCC 27325)为出发菌株，敲除thrA、iclR基因；

[0026] (2)ppc基因启动子替换为trc启动子

[0027] (3)T7 RNA聚合酶的表达：构建木糖启动子PxylF和T7 RNA聚合酶T7RNAP的连接片段，并表达；

[0028] (4)L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径的构建：

[0029] ①构建T7启动子和ectABC基因的连接片段T7-ectABC，并表达；

[0030] ②构建T7启动子和lysC基因的连接片段T7-lysC，并表达；

[0031] 本发明提供的技术方案之三：是上述基因工程菌发酵生产四氢嘧啶的方法，具体如下：

[0032] 摇瓶发酵：

[0033] (1)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基中，37℃，200rpm培养7h；

[0034] (2)摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种发酵培养基，37℃，200rpm培养20-28h；通过补加氨水维持pH在7.2，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液)，发酵初始添加
60％(m/v)木糖溶液(发酵液中木糖终浓度5-15g/L)诱导目的基因表达，发酵周期20-28h；

[0035] 摇瓶发酵20-28h后四氢嘧啶的产量达到了12-16g/L；

[0036] 种子培养基组成为：蔗糖20-30g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母粉5-10g/L，玉米浆1-3mL/L，FeSO4·7H2O 1-3mg/L，MnSO4·H2O 1-3mg/L，其余为水，pH7.0；

[0037] 发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母粉0.1-0.3g/L，玉米浆1-2mL/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 
80-100mg/L，其余为水，pH7.0。

[0038] 发酵罐发酵：

[0039] (1)斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养15-18h，转接第二代斜面培养12h；

[0040] (2)种子培养：取适量无菌水于斜面，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右；温度恒定在36℃；溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；

[0041] (3)发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右；温度维持在36℃；溶氧在25-35％之间；

[0042] 发酵初始添加终浓度为5-15g/L的木糖溶液，诱导目的基因表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-2g/L，发酵周期24-40h；

[0043] 5L发酵罐发酵24-40h后四氢嘧啶的产量达到了35-50g/L；

[0044] 活化斜面培养基组成为：蔗糖1-3g/L，Tryptone(胰蛋白胨)5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，Yeast Extract(酵母提取物)2-5g/L，NaCl 2-5g/L，琼脂15-30g/L，其余为水，pH 
7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0045] 种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，Yeast Extract 5-10g/L，Tryptone 5-10g/L，KH2PO4 5-15g/L，MgSO4·7H2O 2-5g/L，FeSO4·7H2O 5-15mg/L，MnSO4·H2O 5-15mg/L，VB1 1-3mg/L，VH 0.1-1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0046] 发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，Yeast Extract 1-5g/L，Tryptone 1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O 80-100mg/L，VB1 0.5-1mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃灭菌15min。

[0047] 有益效果：

[0048] 1、本发明所构建的产四氢嘧啶的菌株经过一系列的改造，增强了葡萄糖到L-天冬氨酸-β-半醛的代谢通量，使得工程菌可以直接利用葡萄糖发酵生产四氢嘧啶，摇瓶发酵20-28h后四氢嘧啶的产量达到了12-16g/L，5L发酵罐发酵24-40h后四氢嘧啶的产量达到了
35-50g/L。
附图说明：

[0049] 图1 thrA基因的敲除及验证

[0050] 其中，M：Maker，1：上游同源臂，2：氯霉素抗性片段，3：下游同源臂，4：重叠片段；5：原菌基因组PCR片段，6：敲除后基因组PCR片段，7：删除氯霉素抗性后基因组PCR片段；

[0051] 图2 iclR基因的敲除及验证

[0052] 其中，M：Maker，1：iclR敲除片段，2：原菌基因组PCR片段，

[0053] 3：iclR敲除后基因组PCR片段，4：删除氯霉素抗性后基因组PCR片段；

[0054] 图3替换Pppc为Ptrc及验证

[0055] 其中，M：Maker，1：上游同源臂，2：氯霉素抗性片段，3：下游同源臂4：启动子替换片段，5：启动子替换前片段，6：启动子替换后片段，7：删除抗性基因后片段；

[0056] 图4 PxylF-T7RNAP重叠片段的构建及PCR验证

[0057] 其中，M：marker，1：PxylF-T7RNAP重叠片段，2：上游同源臂，3：氯霉素抗性片段，4：下游同源臂，5：PxylF-T7RNAP整合片段6：PxylF-T7RNAP整合片段替换lacZ基因，7：删除抗性基因后片段；

[0058] 图5 T7-ectABC整合重叠片段的构建及PCR验证

[0059] 其中，M：Marker，1：上游同源臂，2：T7-ectABC整合基因及氯霉素抗性基因重叠片段3：下游同源臂，4：T7-ectABC整合基因4段重叠片段，5：原基因片段，6：T7-ectABC整合片段替换ybeM基因；

[0060] 图6 T7-lysC整合重叠片段的构建及PCR验证

[0061] 其中，M：Marker，1：上游同源臂，2：T7-lysC整合基因及氯霉素抗性基因重叠片段，3：下游同源臂，4：T7-lysC整合基因4段重叠片段，5：原基因片段，6：T7-lysC整合片段替换yghX基因。
具体实施方式：

[0062] 实施例1：E.coli ECT 06菌株构建

[0063] (1)thrA、iclR基因的敲除

[0064] 采用Red同源重组技术敲除上述基因：

[0065] ①采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据thrA基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(thrA-up-1、thrA-up-2)和下游同源臂引物(thrA-down-1、thrA-down-2)，扩增获取thrA基因的上、下游同源臂；

[0066] ②采用PCR技术以pKD3为模板，设计引物(Cmr-thrA-up、Cmr-thrA-down)，扩增氯霉素抗性基因片段；

[0067] ③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得thrA基因敲除片段，所述基因敲除片段由thrA基因上、下游同源臂基因片段及氯霉素抗性基因片段组成；

[0068] ④将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的E.coli W3110中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得thrA基因敲除菌E.coli ECT01(thrA基因的敲除及验证见图1：上游同源臂约500bp，下游同源臂约700bp，中间氯霉素抗性片段约1080bp，重叠后敲除片段大小约2500bp；原菌基因组片段大小约2000bp，抗性标记被删除的条带大小约为1500bp；thrA敲除片段构建结果如图1，电泳条带与设计大小一致，证明thrA敲除成功。)；

[0069] iclR基因的敲除：以上述相同方法敲除iclR基因(上游同源臂引物(iclR-up-1、iclR-up-2)和下游同源臂引物(iclR-down-1、iclR-down-2)，氯霉素抗性基因片段扩增引物(Cmr-iclR-up、Cmr-iclR-down)，获得阳性转化子并消除氯霉素抗性基因后获得thrA、iclR基因敲除菌E.coli ECT02(iclR基因的敲除及验证见图2：上游同源臂约500bp，下游同源臂约500bp，中间氯霉素抗性片段约1080bp，重叠后敲除片段大小约1700bp。原菌基因组片段大小约1200bp，抗性标记被删除的条带大小约为800bp。iclR敲除片段构建结果如图2，电泳条带与设计大小一致，证明iclR敲除成功。)。

[0070] (2)ppc基因启动子替换为trc启动子

[0071] ①采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据ppc基因序列设计ppc基因启动子同源臂引物(上游同源臂引物(pppc-up-1、pppc-up-2)和下游同源臂引物(pppc-down-1、pppc-down-2))，上游同源臂位于ppc启动子上游，下游同源臂位于ppc结构基因前600bp范围内；

[0072] ②采用PCR技术扩增pTrc99a载体质粒上的trc启动子(上游引物ptrc-up,下游引物ptrc-down)；

[0073] ③采用PCR技术以pKD3质粒为模版；设计引物(Cmr-ppc-up、Cmr-ppc-down)，扩增氯霉素抗性基因片段；

[0074] ④以步骤①、②、③获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ppc启动子替换片段，所述片段由ppc基因启动子上游同源臂、ppc基因启动子下游同源臂、trc启动子片段、氯霉素抗性基因片段组成；

[0075] ⑤将上述基因片段导入含有pKD46的E.coli ECT02中，获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得ppc启动子替换为trc启动子的E.coli ECT03(Pppc替换为Ptrc及验证见图3：上游同源臂约700bp，下游同源臂约800bp，中间氯霉素抗性片段约1080bp，启动子片段重叠后片段大小约2300bp。原菌基因组片段大小约1300bp，抗性标记被删除的条带大小约为1500bp。启动子替换片段构建结果如图3，电泳条带与设计大小一致，证明启动子片段替换成功。)。

[0076] (3)T7 RNA聚合酶(T7RNAP)的表达

[0077] ①采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据木糖编码基因xylF基因序列设计一对引物(PxylF-up、PxylF-down)，扩增获取木糖启动子PxylF片段；

[0078] ②采用PCR技术以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，根据T7RNAP基因序列设计一对引物(T7RNAP-up、T7RNAP-down)，扩增获取T7RNAP片段；

[0079] ③采用PCR技术以pKD3为模版；设计引物(Cmr-lacZ-up、Cmr-lacZ-down)，扩增氯霉素抗性基因片段；

[0080] ④采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据lacZ基因序列设计同源臂引物(上游同源臂引物(lacZ-up-1、lacZ-up-2)和下游同源臂引物(lacZ-down-1、lacZ-down-2))，上下游同源臂均位于基因lacZ内部；

[0081] ⑤以步骤①、②、③、④获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得PxylF-T7RNAP整合片段，所述片段由lacZ基因上游同源臂、lacZ基因下游同源臂、氯霉素抗性基因片段、PxylF启动子片段、T7RNAP基因片段组成；

[0082] ⑥将上述基因片段导入含有pKD46的E.coli ECT03中，获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得lacZ基因替换为PxylF启动子控制的T7RNAP基因的E.coli ECT04(PxylF-T7RNAP重叠片段的构建及PCR验证见图4：上游同源臂约451bp，下游同源臂约456bp，中间氯霉素抗性片段约1024bp，PxylF-T7RNAP重叠后片段大小约3000bp，PxylF-T7RNAP整合片段大小约5000bp，原菌基因组片段大小约3700bp，抗性标记被删除的条带大小约为4000bp。启动子替换片段构建结果如图4，电泳条带与设计大小一致，证明PxylF-T7RNAP整合成功。)。

[0083] (4)L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径的构建

[0084] ①采用PCR技术，以伸长盐单胞菌(CGMCC 1.6329)基因组为模板，根据ectABC基因序列设计一对引物(ectABC-up、ectABC-down)，扩增ectABC基因，并将T7启动子和T7终止子序列添加到ectABC片段扩增引物的5’和3’端，扩增获取T7-ectABC片段。

[0085] ②采用PCR技术以pKD3为模版；设计引物(Cmr-ybeM-up、Cmr-ybeM-down)，扩增氯霉素抗性基因片段；

[0086] ③采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据假基因ybeM设计同源臂引物(上游同源臂引物(ybeM-up-1、ybeM-up-2)和下游同源臂引物(ybeM-down-1、ybeM-down-2))，上下游同源臂均位于ybeM基因内部；

[0087] 所述ybeM的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.11；

[0088] ④以步骤①、②、③获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得T7-ectABC整合片段，所述片段由ybeM基因上游同源臂、ybeM基因下游同源臂、T7启动子片段、氯霉素抗性基因片段、ectABC基因片段、T7终止子片段组成；

[0089] ⑤将上述基因片段导入含有pKD46的E.coli ECT04中，获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得ybeM基因替换为T7启动子控制的ectABC基因的E.coli ECT05(T7-ectABC整合重叠片段的构建及PCR验证见图5：上游同源臂约488bp，下游同源臂约645bp，中间氯霉素抗性片段约1024bp，T7-ectABC片段大小约2500bp，整合片段大小约4500bp，原菌基因组片段大小约2000bp。启动子替换片段构建结果如图5，电泳条带与设计大小一致，证明T7-ectABC整合成功。)。

[0090] (5)谷氨酸棒状杆菌lysC基因的引入

[0091] ①采用PCR技术以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium.glutamicum)ATCC13032基因组为模板，根据lysC基因序列设计一对引物(lysC-up、lysC-down)扩增lysC基因，并将T7启动子和T7终止子序列添加到lysC片段扩增引物的5’和3’端，扩增获取T7-lysC片段。

[0092] ②采用PCR技术以pKD3为模版；设计引物(Cmr-yghX-up、Cmr-yghX-down)，扩增氯霉素抗性基因片段；

[0093] ③采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据假基因yghX设计同源臂引物扩增同源臂(上游同源臂引物(yghX-up-1、yghX-up-2)和下游同源臂引物(yghX-down-1、yghX-down-2))，上、下游同源臂均位于yghX基因内部；

[0094] 所述yghX的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.12；

[0095] ④以步骤①、②、③获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得T7-lysC整合片段，所述片段由yghX基因上游同源臂、yghX基因下游同源臂、T7启动子片段、氯霉素抗性基因片段、lysC基因片段、T7终止子片段组成；

[0096] ⑤将上述基因片段导入含有pKD46的E.coli ECT05中，获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得yghX基因替换为T7启动子控制的lysC基因的E.coli ECT06(T7-lysC整合重叠片段的构建及PCR验证见图6：上游同源臂约418bp，下游同源臂约480bp，中间氯霉素抗性片段约1024bp，T7-lysC片段大小约1500bp，整合片段大小约3500bp，原菌基因组片段大小约1732bp。启动子替换片段构建结果如图6，电泳条带与设计大小一致，证明T7-lysC整合成功。)。

[0097] 上述实验过程所用引物见下表：

[0098]

[0099]

[0100]

[0101] 实施例2摇瓶发酵实验

[0102] 以实施例1构建的E.coli ECT06菌株作为生产菌株发酵生产四氢嘧啶：

[0103] (1)种子培养：使用接种环刮取一环菌种到装液量为30mL的500mL圆底三角瓶中，37℃，200rpm培养7h；

[0104] (2)摇瓶发酵：按照15％接种量接种发酵摇瓶，发酵摇瓶为装液量30mL的500mL挡板三角瓶，37℃，200rpm培养28h；苯酚红作为指示剂，通过微量进样器补加氨水维持pH在7.2，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加2mL 60％(m/v)葡萄糖溶液)，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液(终浓度15g/L)诱导目的基因表达，发酵周期28h；

[0105] (3)收集发酵液，13000rmp离心，收集上清液相检测四氢嘧啶含量；28h时发酵液中的四氢嘧啶含量约16g/L；

[0106] (4)检测方法：

[0107] 使用去离子水将上清稀释200倍，经0.22μm微孔过滤膜过滤后待测；使用UltiMate3000(Thermo Scientific)高效液相色谱仪测定四氢嘧啶，上述制备样品使用微量进样针，进样量20μL，色谱柱为TSK-GEL C18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速1mL/min，紫外检测波长210nm，出峰时间约2.953min；

[0108] 种子培养基组成为：蔗糖30g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，酵母粉10g/L，玉米浆3mL/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MnSO4·H2O 3mg/L，其余为水，pH7.0；

[0109] 发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，酵母粉0.3g/L，玉米浆2mL/L，FeSO4·7H2O 100mg/L，MnSO4·7H2O 100mg/L，其余为水，pH7.0。

[0110] 实施例3摇瓶发酵实验

[0111] 以实施例1构建的E.coli ECT06菌株作为生产菌株发酵生产四氢嘧啶：

[0112] (1)种子培养：使用接种环刮取一环菌种到装液量为30mL的500mL圆底三角瓶中，37℃，200rpm培养7h；

[0113] (2)摇瓶发酵：按照10％接种量接种发酵摇瓶，发酵摇瓶为装液量30mL的500mL挡板三角瓶，37℃，200rpm培养20h；苯酚红作为指示剂，通过微量进样器补加氨水维持pH在7.2，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1mL60％(m/v)葡萄糖溶液)，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液(终浓度
5g/L)诱导目的基因表达，发酵周期20h；

[0114] (3)收集发酵液，13000rmp离心，收集上清液相检测四氢嘧啶含量；20h时发酵液中的四氢嘧啶含量约12g/L；

[0115] (4)检测方法：

[0116] 使用去离子水将上清稀释200倍，经0.22μm微孔过滤膜过滤后待测；使用UltiMate3000(Thermo Scientific)高效液相色谱仪测定四氢嘧啶，上述制备样品使用微量进样针，进样量20μL，色谱柱为TSK-GEL C18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速1mL/min，紫外检测波长210nm，出峰时间约2.953min；

[0117] 种子培养基组成为：蔗糖20g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，酵母粉5g/L，玉米浆1mL/L，FeSO4·7H2O 1mg/L，MnSO4·H2O 1mg/L，其余为水，pH7.0；

[0118] 发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，酵母粉0.1g/L，玉米浆1mL/L，FeSO4·7H2O 80mg/L，MnSO4·7H2O 80mg/L，其余为水，pH7.0。

[0119] 实施例4 5L发酵罐发酵实验

[0120] 以实施例1构建的E.coli ECT06菌株作为生产菌株发酵生产四氢嘧啶：

[0121] (1)斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养15h，转接第二代斜面培养12h；

[0122] (2)种子培养：无菌操作，取适量无菌水于四支新鲜的活化斜面，将菌悬液接入装有2L种子培养基的7.5L发酵罐中，通过pH电极控制自动流加氨水维持培养过程中pH稳定在7.0左右；通过温度电极自动控制发酵过程温度恒定在36℃；通过搅拌桨转速和通风量控制溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到6g/L；

[0123] (3)发酵培养：按照20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右；温度维持在36℃；溶氧在25-35％之间，发酵40h；

[0124] 发酵初始添加终浓度为15g/L的木糖溶液，诱导目的基因表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-2g/L。

[0125] 活化斜面培养基组成为：蔗糖3g/L，Tryptone(胰蛋白胨)10g/L，牛肉膏10g/L，Yeast Extract(酵母提取物)5g/L，NaCl 5g/L，琼脂条30g/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0126] 种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，Yeast Extract 10g/L，Tryptone 10g/L，KH2PO4 15g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnSO4·H2O 15mg/L，VB1 3mg/L，VH 1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0127] 发酵培养基组成为：葡萄糖25g/L，Yeast Extract 5g/L，Tryptone 5g/L，柠檬酸钠1g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 100mg/L，MnSO4·H2O 100mg/L，VB1 1mg/L，VH 0.5mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃灭菌15min。

[0128] 液相色谱检测，40h时发酵液中的四氢嘧啶含量约50g/L。

[0129] 实施例5 5L发酵罐发酵实验

[0130] 以实施例1构建的E.coli ECT06菌株作为生产菌株发酵生产四氢嘧啶：

[0131] (1)斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养18h，转接第二代斜面培养12h；

[0132] (2)种子培养：无菌操作，取适量无菌水于四支新鲜的活化斜面，将菌悬液接入装有2L种子培养基的7.5L发酵罐中，通过pH电极控制自动流加氨水维持培养过程中pH稳定在7.0左右；通过温度电极自动控制发酵过程温度恒定在36℃；通过搅拌桨转速和通风量控制溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5g/L；

[0133] (3)发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右；温度维持在36℃；溶氧在25-35％之间,发酵24h；

[0134] 发酵初始添加终浓度为5g/L的木糖溶液，诱导目的基因表达，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0-2g/L。

[0135] 经液相色谱检测，发酵24h发酵液中的四氢嘧啶含量约35g/L。

[0136] 活化斜面培养基组成为：蔗糖1g/L，Tryptone(胰蛋白胨)5g/L，牛肉膏5g/L，Yeast Extract(酵母提取物)2g/L，NaCl 2g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0137] 种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，Yeast Extract 5g/L，Tryptone 5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·H2O 5mg/L，VB1 1mg/L，VH 0.1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0138] 发酵培养基组成为：葡萄糖15g/L，Yeast Extract 1g/L，Tryptone 1g/L，柠檬酸钠0.1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O 80mg/L，MnSO4·H2O 80mg/L，VB1 0.5mg/L，VH 0.1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃灭菌15min。