一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法

摘要

本发明公开了一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法，所述耐氨氮丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群及硝化与反硝化菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸为碳源，以尿素或NH4Cl为氨氮来源，通过交替提高丙酸浓度及氨氮浓度的方法驯化沼气发酵液得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系，该菌系可长期稳定地在氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L条件下稳定产气，其产气率大于理论产量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％；具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，可用于解除沼气发酵过程中的氨氮及丙酸的综合抑制，提高沼气发酵性能。

权利要求

1.一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法，其特征在于，所述耐氨氮丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群及硝化与反硝化菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸为碳源，以尿素或NH4Cl为氨氮来源，通过交替提高丙酸浓度及氨氮浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得耐氨氮丙酸产甲烷菌系，该方法包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，按体积比为19:

1-9:1将接种物接种到丙酸浓度为0.5g/L、氨氮浓度为0.5g/L的新鲜培养基中，放入试剂瓶中37℃进行培养，每24h置换新鲜的培养基，保持新鲜培养基中丙酸和氨氮浓度不变，20天为一个培养周期，初始周期后新鲜培养基中丙酸浓度或氨氮浓度保持不变，提高氨氮浓度或丙酸浓度，稳定培养1-2周期后，再保持氨氮浓度或丙酸浓度不变，提高丙酸浓度或氨氮浓度，并稳定培养1-2周期，如此交替提高丙酸浓度及氨氮浓度，直至氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L获得高氨氮耐受能力的丙酸产甲烷菌系；所述试剂瓶配有带两个孔的橡胶塞，其中一个孔中插有橡胶管至试剂瓶中下部作为进出料的通道，另一个孔连接收集气体的气袋；所述新鲜培养基配制方法为：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、

400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg；此外还加入碳源和氨氮，碳源和氨氮的质量跟相应的浓度对应。

2.根据权利要求1所述耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法，其特征在于，所述交替提高丙酸浓度及氨氮浓度，丙酸浓度的提高幅度为30-50％，氨氮浓度的提高幅度为0.3-0.5g/L。

3.一种权利要求1驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系的应用，其特征在于，权利要求

1驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系可长期稳定地在氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L条件下产气。

4.一种耐氨氮丙酸产甲烷系固体菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷系的菌液经离心，弃去液体部分后置于厌氧环境下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到目标产物。

5.一种液体浓缩耐氨氮丙酸产甲烷菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷系的菌液经离心，收集全部的固体沉淀及少许上清液，利用灭菌的液体甘油封液面以隔绝空气，-20℃保存。

说明书

一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法。背景技术：

[0002] 在能源短缺及环境污染的双重压力下，既能处理废弃物又能产生可再生能源的沼气产业得到了较快发展，从小规模的户用沼气走向了规模化生产。据统计，全国沼气用户约4300万户，全国规模化沼气工程约10万处，然而，多数沼气池由于无法长期稳定运行而处于闲置状态，大部分沼气工程至今无法盈利。由挥发性有机酸累积导致的酸抑制问题是制约沼气发酵稳定性及经济性的因素之一。

[0003] 酸抑制或酸败现象在餐厨垃圾、农林废弃物、城市有机垃圾、能源作物等为原料的厌氧发酵过程中常发生。酸抑制是由于厌氧发酵系统上游产酸过程与下游产甲烷过程失衡，中间产物挥发性脂肪酸累积(主要是丙酸，乙酸)，致使发酵系统pH降低，抑制了产甲烷菌的活性，最终导致发酵系统产气能力下降或者发生酸败。氨抑制是由于含氮有机物分解成小分子的氨，其对产甲烷菌具有毒害作用，降低产甲烷菌的活性，最终导致发酵系统产气能力下降。通常的解决方法是宏观上优化运行参数，如降低有机负荷和发酵浓度，使发酵在相对较低的发酵浓度下运行，这就限制了发酵效率。随着生物强化技术在废水处理领域的应用，研究人员开始尝试将其应用到沼气发酵系统中，即人为的添加特定功能的微生物来应对酸抑制或氨抑制，提高发酵系统的稳定性，提高发酵浓度，或恢复酸败系统产气。

[0004] 虽然，已有关于生物强化技术缓解酸抑制的报道，但是投加功能菌的多为购买的纯培养的针对丙酸降解的互营丙酸氧化细菌，或针对乙酸产甲烷过程的产甲烷古菌，亦或是人为地将几种微生物进行组合制成复合微生物菌剂。这些菌剂的制备技术存在以下问题：第一，厌氧的微生物培养条件苛刻，需要专门厌氧设备及微生物专业技术人员进行培养；第二，纯培养的微生物丙酸氧化细菌或产甲烷菌作为外源投加的菌种很难适应厌氧发酵系统中的复杂环境条件，如低pH，高氨氮浓度等；第三，单一类型的微生物作为生物强化菌剂投加到厌氧发酵体系后很难抵抗土著微生物的竞争并长期地保持生物持有量以发挥强化作用。此外，鉴于氨抑制导致产甲烷菌活性减低，甚至失活，乙酸不能及时被转化成甲烷并发生累积，而丙酸的降解又会受到乙酸的产物抑制，从而导致丙酸累积。因此，为应对氨抑制和酸累积的双重压力，有必要提出一种有效地驯化耐氨氮丙酸产甲烷菌系的方法。发明内容：

[0005] 本发明的目的是提供一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法，得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系主要包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群及硝化与反硝化菌群等，具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，用于提高沼气发酵性能，解决了厌氧发酵过程中的氨抑制和酸抑制问题。

[0006] 本发明是通过以下技术方案予以实现的：

[0007] 一种耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法，所述耐氨氮丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群及硝化与反硝化菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸为碳源，以尿素或NH4Cl为氨氮来源，通过交替提高丙酸浓度及氨氮浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得耐氨氮丙酸产甲烷菌系，该方法包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，按体积比为19:1-9：1将接种物接种到丙酸浓度为0.5g/L、氨氮浓度为0.5g/L的新鲜培养基中，放入试剂瓶中37℃进行培养，每24h置换新鲜的培养基，保持新鲜培养基中丙酸和氨氮浓度不变，20天为一个培养周期，初始周期后新鲜培养基中丙酸浓度或氨氮浓度保持不变，提高氨氮浓度或丙酸浓度，稳定培养1-2周期后，再保持氨氮浓度或丙酸浓度不变，提高丙酸浓度或氨氮浓度，并稳定培养1-2周期，如此交替提高丙酸浓度及氨氮浓度，直至氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L获得高氨氮耐受能力的丙酸产甲烷菌系；所述试剂瓶配有带两个孔的橡胶塞，其中一个孔中插有橡胶管至试剂瓶中下部作为进出料的通道，另一个孔连接收集气体的气袋；所述新鲜培养基配制方法为：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg；此外还加入碳源和氨氮，碳源和氨氮的质量跟相应的浓度对应。

[0008] 所述交替提高丙酸浓度及氨氮浓度，丙酸浓度的提高幅度为30-50％，氨氮浓度的提高幅度为0.3-0.5g/L。

[0009] 本发明还保护上述驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系的应用，驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系可长期稳定地在氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L条件下稳定产气，其产气率大于理论产量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％。

[0010] 本发明还提供一种耐氨氮丙酸产甲烷系固体菌剂的制备方法，将上述驯化后得到的耐氨氮丙酸产甲烷系的菌液经离心，弃去液体部分后置于厌氧环境下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到目标产物。

[0011] 本发明还提供一种液体浓缩耐氨氮丙酸产甲烷菌剂的制备方法，将上述驯化后的耐氨氮丙酸产甲烷系菌液经离心，收集全部的固体沉淀及少许上清液，利用灭菌的液体甘油封液面以隔绝空气，-20℃低温保存。

[0012] 本发明的有益效果如下：

[0013] (1)本发明得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，用于解除沼气发酵过程中的氨氮及丙酸的综合抑制，提高沼气发酵性能，长期稳定地在氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L条件下稳定产气，其产气率大于理论产量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％。

[0014] (2)本发明得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系固体菌剂和液体浓缩耐酸产甲烷菌剂便于运送和长期保存。具体实施方式：

[0015] 以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0016] 实施例1：

[0017] 本实施例接种物沼气发酵液为餐厨垃圾发酵液，有机负荷1.0g/L d，日容积产气率为0.3L/L d。(也可选取其他任意稳定运行发酵罐的发酵液)。

[0018] 培养装置为1L的试剂瓶，所述试剂瓶配有带两个孔的橡胶塞，其中一个孔中插有橡胶管至试剂瓶中下部作为进出料的通道，另一个孔连接收集气体的气袋。

[0019] 本实施例耐氨氮丙酸产甲烷菌系的驯化方法，包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，以保证厌氧环境，将接种物950ml接种到丙酸浓度为0.5g/L氨氮浓度为0.5g/L的50ml新鲜培养基中，放入1L的试剂瓶中37℃的水浴锅中进行静置培养，每24h用注射器吸出50ml的菌液，并注入50ml新鲜的培养基，保持新鲜培养基中丙酸和氨氮浓度不变，20天为一个培养周期，初始周期后第二个周期新鲜培养基丙酸浓度保持不变，提高氨氮浓度到1.0g/L，每24h用注射器吸出50ml的菌液，并注入50ml新鲜的培养基，保持新鲜培养基中丙酸浓度为0.5g/L、氨氮浓度1.0g/L不变，20天为一个培养周期，稳定培养1周期后，再保持氨氮浓度1.0g/L不变，提高丙酸浓度到0.75g/L，并稳定培养1周期，如此交替提高丙酸浓度及氨氮浓度，直至氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L(参见表1)获得高氨氮耐受能力的丙酸产甲烷菌系；所述新鲜培养基，每升是这样配制的：在1L水中加入0.5mg丙酸钠、400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3、还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·
4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各
0.0005mg，此外还加入碳源和氨氮，碳源和氨氮的质量跟相应的浓度对应。上述驯化后的耐氨氮丙酸产甲烷菌系能长期稳定地在氨氮浓度大于3.0g/L、丙酸浓度大于2.0g/L条件下稳定产气，其产气率大于理论产量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％。

[0020] 表1

[0021]

[0022] 将上述驯化后的耐氨氮丙酸产甲烷菌系菌液以5000-8000rpm的转速离心5-10min，弃去液体部分后置于厌氧环境(厌氧操作箱，厌氧气袋)下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到耐酸产甲烷菌系固体菌剂。

[0023] 将上述驯化后的耐氨氮丙酸产甲烷菌系菌液以5000-8000rpm的转速离心5-10min，收集全部的固体沉淀及少许上清液，利用灭菌的液体甘油封液面以隔绝空气，-20℃低温保存。

[0024] 实施例2：本发明获得的耐氨氮丙酸产甲烷菌剂对餐厨垃圾的厌氧发酵生物强化作用

[0025] 发酵原料：人工配置的餐厨垃圾，由米粉，奶粉及全蛋粉组成的，三种成分的比例为米粉：蛋白粉：奶粉为1：1：1，C/N为20。

[0026] 接种物：餐厨垃圾厌氧发酵液。

[0027] 反应装置：2L的连续CSTR在线自动采气装置。

[0028] 实验设置：共运行2个2L半连续厌氧发酵罐，分别为R1，R2。R1为空白对照，即餐厨垃圾独立厌氧发酵，不添加菌剂。R2从运行的第41天开始每天添加实施例1得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌系固体菌剂0.3g。

[0029] 2个反应器的运行过程如下：水力停留时间(HRT)为20天，即每天排出100ml的发酵液，注入100ml的人工配置的餐厨垃圾。2个反应器共连续运行100d，即4个HRT，每个HTR的有机负荷率(OLR)依次为0.5g/L d，0.75g/L d，1.0g/L d，1.5g/L d及2.0g/L d。

[0030] 结果表明：有机负荷率为0.5g/L d的前15天内，R1和R2的氨氮浓度相对较低为0.3g/L，产气未受到抑制，两个发酵罐的容积甲烷产量在0.16L左右，当有机负荷提升至
1.0g/L d时，氨氮浓度为2.0g/L d，R1未加菌剂的发酵体系产气明显下降，当有机负荷率提至2.0g/L d，氨氮浓度达到3.0g/L，丙酸浓度为1.5g/L,由于氨氮和丙酸的综合抑制导致R1完全不能产气。而R2从第40天开始添加菌剂，随着有机负荷的提升，发酵体系产气量稳定增加，当有机负荷率提至2.0g/L d，氨氮浓度达到3.0g/L，仍可稳定运行，且发酵液内的丙酸浓度小于1.0g/L。

[0031] 由此可见，通过本发明得到的耐氨氮丙酸产甲烷菌剂可应对氨氮及丙酸的综合抑制，提高餐厨垃圾厌氧发酵的发酵浓度，促进产气。